3種中藥制劑對(duì)腸炎沙門菌的體外抗菌和雛雞感染試驗(yàn)

沈?qū)W懷，張丹俊，趙瑞宏，張慶賀，芮聰杰，潘孝成，胡曉苗

(1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031 ； 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036)

多年來(lái)，由于抗生素在畜牧生產(chǎn)中的不合理使用，致使很多畜禽致病菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，給畜牧業(yè)生產(chǎn)以及人類健康帶來(lái)威脅[1-2]。隨著國(guó)家對(duì)獸用抗生素的嚴(yán)格控制，尋找到替代抗生素用于畜禽細(xì)菌病治療的中藥單方或組方成為研究的熱點(diǎn)[3]。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)和多作用的特點(diǎn)，其活性成分具有抗菌、抑菌活性，其毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性[4-5]。中藥配方制劑的應(yīng)用效果也顯示了作為替代或聯(lián)合抗生素在抗菌中的有效性和應(yīng)用前景[6-7]。本試驗(yàn)就目前市售的3種中藥制劑香連溶液、連蒲雙清顆粒和高山大巴，開展對(duì)沙門菌的體外抑菌試驗(yàn)和雛雞沙門菌感染保護(hù)試驗(yàn)，為中藥防治家禽沙門菌感染提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與菌株 本實(shí)驗(yàn)室孵化得到的7日齡SPF雛雞120只。2株腸炎沙門菌，AH-22為藥物敏感株，AH-27為多重耐藥株，由安徽省畜禽疫病研究中心分離并保存。

1.1.2 試驗(yàn)藥物與試劑 香連溶液、連蒲雙清顆粒、高山大巴，均購(gòu)自獸藥市場(chǎng)；頭孢噻呋鈉，購(gòu)自上海鑫牧源動(dòng)物藥業(yè)有限公司；LB瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基和XLD4選擇性培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液培養(yǎng) 沙門菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，將菌液104倍稀釋后作為體外抑菌試驗(yàn)的供試菌液。菌株AH-27涂板于LB培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，清洗菌苔并將菌液濃度配制為2×109CFU/mL，作為雛雞攻毒的供試菌液。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液將香連溶液稀釋為1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500；連蒲雙清顆粒液稀釋為16、8、4、2 g/L和1 g/L；高山大巴加入無(wú)菌水煮沸經(jīng)紗布過(guò)濾后稀釋為1.5、3、6、12 g/L和24 g/L；頭孢噻呋鈉稀釋為6.25、12.5、25、50 mg/L 和100 mg/L，另設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，各管加入40 μL供試菌液。37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h，以試管清亮的藥物最小稀釋濃度作為該藥物的MIC。取培養(yǎng)物劃線于LB培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最小稀釋濃度為藥物的MBC。

1.2.3 試驗(yàn)分組 將雛雞分為香連溶液組(1組)、連蒲雙清顆粒組(2組)、高山大巴組(3組)、陰性對(duì)照組(NC組)和陽(yáng)性對(duì)照組(PC組)，每組24只雛雞。1、2、3組分別按香連溶液1∶300、連蒲雙清顆粒4 g/L、高山大巴6 g/L加入飲水中，連用15 d，在用藥后的第5天，1、2、3組和PC組口服接種供試菌液0.2 mL，NC組接種生理鹽水。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 記錄各組死淘及病理變化，取雛雞肝臟進(jìn)行沙門菌分離，在不同階段稱量雛雞體重，測(cè)各組血清中T-SOD、GSH-Px、LDH、ALT/GPT和MDA的含量。所有數(shù)據(jù)用SPSS16分析軟件進(jìn)行差異性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 中藥體外抑菌和殺菌試驗(yàn) 結(jié)果顯示，香連溶液對(duì)2株沙門菌的MIC和MBC均為1∶300和1∶100；連蒲雙清顆粒在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未表現(xiàn)出體外的抑菌和殺菌作用；高山大巴的體外MIC均為24 g/L， 在試驗(yàn)濃度內(nèi)無(wú)殺菌作用。頭孢噻呋鈉對(duì)藥物敏感菌株的MIC和MBC分別為12.5 mg/L和50 mg/L，對(duì)多重耐藥株無(wú)抑菌和殺菌作用。表明香連溶液和高山大巴對(duì)沙門菌體外抑菌不受菌株耐藥性的影響。

2.2 中藥對(duì)雛雞感染腸炎沙門菌的保護(hù)性試驗(yàn)

2.2.1 雛雞接菌后的剖檢變化情況 在試驗(yàn)期內(nèi)PC組和3組各死亡1只雛雞，其他各組無(wú)死亡。組織病變和組織沙門菌分離率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。第5天 PC組在肝臟、心臟、脾臟、氣囊、腎臟和腸道均出現(xiàn)不同程度的病變。與PC組相比，1、2組的組織病變減少，3組除肝臟病變多于PC組，其他組織病變與PC組相同或減少；3組的沙門菌分離率為90%，PC、1、2組的分離率均為100%。第10天，PC組心臟病變率為10%，腸道病變?nèi)赃_(dá)到70%，1、3組肝臟病變率均為10%，中藥組腸道病變率均低于PC組；PC組的沙門菌分離率為80%，1、2、3組的分離率分別為30%、40%和40%。

表1 不同時(shí)期各組剖檢組織病變和組織沙門菌分離率Table 1 Necropsy tissue lesions and Salmonella isolation rate of each group in different periods

2.2.2 中藥對(duì)雛雞體重的影響 對(duì)不同階段雛雞進(jìn)行體重稱量(見(jiàn)表2)，在接菌前，各組之間的體重?zé)o明顯差異。接菌第5天，NC組體重顯著高于PC組，1、2、3組雛雞體重均高于PC組，但未達(dá)到顯著性差異(P>0.05)。接菌第10天，1、2、3組和NC組雛雞體重均顯著高于PC組(P<0.05)，其中1組和3組的平均體重甚至高于NC組。

表2 不同時(shí)間段不同組雛雞體重變化Table 2 Changes in body weight of different groups of chickens in different time periods

2.2.3 中藥對(duì)雛雞血液應(yīng)激損傷指標(biāo)的影響 結(jié)果如表3所示，接菌第5天 NC、1、2、3組血清中LDH水平均低于PC組，其中NC、1、3組達(dá)到顯著性水平(P<0.05)，其中1組最低，其次是3組和2組；在接菌后第10天 NC、1、2、3組LDH水平均略低于PC組，但都未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。NC、1、2、3組ALT/GPT水平在第5天均顯著低于PC組(P<0.05)，在第10天時(shí)的趨勢(shì)相同，但僅3組達(dá)到顯著性差異水平(P<0.05)。接菌第5天和第10天1、2、3組血清MDA水平均低于PC組，其中第5天 3組顯著低于PC組(P<0.05)，第10天2組顯著低于PC組和1組(P<0.05)。

表3 雛雞血清應(yīng)激損傷指標(biāo)變化Table 3 Changes of serum stress injury indexes in chickens

2.2.4 中藥對(duì)雛雞血液抗氧化指標(biāo)的影響 結(jié)果如表4所示，接菌第5天 PC組較NC組血清中T-SOD和GSH-Px均出現(xiàn)不同程度的降低，其中GSH-Px水平差異顯著(P<0.05)；1、2、3組血清中T-SOD和GSH-Px水平均高于PC組，但并未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。接菌第10天 PC組血清中T-SOD和GSH-Px水平均高于NC組，其中GSH-Px達(dá)到顯著性水平(P<0.05)，1、2、3組血清T-SOD水平均高于PC組，但均未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)，1、2、3組血清GSH-Px水平在接菌后第10天均略低于PC組，但均未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。

表4 雛雞血清抗氧化指標(biāo)變化Table 4 Changes of serum antioxidant indexes in chickens

3 討論

近年來(lái)的研究表明，有些中藥具有抑菌和殺菌作用，可作用于抗菌的多個(gè)環(huán)節(jié)，甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥[8-9]。國(guó)內(nèi)研究中藥的學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)多種中藥成分具有抗菌的活性[10-11]。目前市售畜禽用中藥多以復(fù)方制劑為主，本試驗(yàn)選用的3種畜禽用中藥制劑均屬于多組方中藥。體外抑菌和殺菌結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)香連溶液對(duì)沙門菌表現(xiàn)出體外抑菌和殺菌作用，高山大巴有一定程度的抑菌作用，連蒲雙清顆粒無(wú)明顯的體外抗菌作用。香連溶液和高山大巴對(duì)沙門菌的抑菌和殺菌作用與菌株的耐藥性強(qiáng)弱無(wú)關(guān)，結(jié)果提示，中藥制劑在治療沙門菌耐藥菌株感染時(shí)具有一定的應(yīng)用潛力。

腸炎沙門菌感染可造成雛雞的組織病理變化[12]、免疫器官指數(shù)降低[13]和血液淋巴細(xì)胞的下降[14]。本試驗(yàn)通過(guò)人工感染沙門菌評(píng)價(jià)3種中藥對(duì)雛雞的保護(hù)效果，結(jié)果顯示，接種腸炎沙門菌可使雛雞表現(xiàn)出肝臟、心臟、氣囊、腸道等典型的感染臨床癥狀和剖檢病理變化。3種中藥制劑不同程度的減少沙門菌感染導(dǎo)致的組織病變，在感染后期降低組織中沙門菌的分離率。3種中藥制劑均可以提高由于沙門菌感染造成的體重減輕，甚至有一定的促生長(zhǎng)作用。血清中LDH、ALT/GPT和MDA的含量可以反映機(jī)體的應(yīng)激和損傷程度，而T-SOD和GSH-Px水平可反映機(jī)體的抗氧化能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種中藥制劑均可降低LDH、ALT/GPT和MDA的血清含量，增加血清中T-SOD和GSH-Px水平，表明3種中藥制劑均可減輕對(duì)感染雛雞的機(jī)體應(yīng)激損傷，提高機(jī)體的抗氧化能力，這也可能是中藥組雛雞感染后器官病變減少和增重未受影響的主要原因。