2株雞細小病毒全基因組序列測定與分析

高倩文，王君娜，張宇名，尹燕博，徐守振

(青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東 青島 266109)

雞細小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)是一種無囊膜的單鏈DNA病毒，基因組長約為5 000 kb，包括3個開放閱讀框(ORF)。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，ORF2編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)，而位于ORF1和ORF2之間的ORF3編碼假定蛋白(NP)，其功能目前尚不清楚[1]。ChPV是引起雞腸道疾病重要的病原體之一，能引起禽腸炎綜合征和發(fā)育障礙與矮小綜合征等疾病。臨床特征表現(xiàn)為腹瀉、精神沉郁、發(fā)育遲緩、體重增加減慢、上市時間增加 ； 更嚴重的能導致免疫功能障礙和死亡率增加[2-3]。已有研究表明,該病在雞群中普遍存在，主要侵害雛雞，以商品肉雞的感染率較高，種雞和蛋雞次之[4]。迄今為止，已有39株完整的ChPV基因組序列在GenBank中提交，1株來自匈牙利[5]，4株來自美國[6]，5株來自韓國[7]，29株來自中國廣州[8]。目前，雖然致病毒株仍未確定，但是ChPV在雞群中的流行率卻仍在增加。本研究將測序的2株ChPV完整的基因組編碼序列與來自不同地區(qū)參考株的基因組序列進行同源性和遺傳進化分析，為ChPV基因組來源和遺傳進化特征提供參考，有助于更好地防控ChPV引起的有關疾病。

1 材料與方法

1.1 病料 本實驗室檢測的ChPV陽性病料分別來自山東濰坊和河南濮陽某養(yǎng)雞場，病雞表現(xiàn)腹瀉、體重減輕、發(fā)育遲緩等臨床癥狀。

1.2 主要試劑和儀器PremixTaqTM、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、DL-2 000 DNA Marker,均購自寶生物工程(大連)有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,購自康為世紀生物技術有限公司。高速離心機Pico17型,購自ThermoFisher公司；LifeTouch基因擴增儀TC-96/G/H(b)型，購自杭州博日科技有限公司；電泳儀JY600E型、凝膠成像儀JY04S-3C型，均購自北京君意東方電泳設備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱XT5116-IN70型，購自杭州雪中炭恒溫技術有限公司。

1.3 引物 ChPV檢測引物[9]和基因組測序引物[7]，均由睿博興科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 ChPV檢測引物和基因組測序引物Table 1 Detection primers and genome sequencing primers for ChPV

1.4 臨床病料檢測 根據(jù)TIANGEN病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，從山東濰坊和河南濮陽某養(yǎng)雞場送檢的病料中提取病毒DNA，使用ChPV檢測引物PVF1和PVR1對ChPV非結(jié)構(gòu)基因(NS)保守區(qū)域的561 bp區(qū)段進行PCR擴增，將電泳鑒定結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至睿博興科生物技術有限公司測序。

1.5 基因組提取 根據(jù)TIANGEN病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，從測序結(jié)果ChPV陽性的病料中提取病毒的基因組，用40 μL RNase-Free H2O洗脫后測DNA的濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因組分段PCR擴增 以1.5步驟所得DNA為模板進行ChPV基因組各片段的擴增。PCR反應體系：DNA 1 μg，PremixTaqTM25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O補足50 μL。分別用引物ChPV-A1/A2和ChPV-B1/B2擴增片段A和B，反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。引物ChPV-C1/C2和ChPV-D1/D2擴增片段C和D，反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。引物ChPV-E1/E2、ChPV-F1/F2和ChPV-G1/G2擴增片段E、F和G，反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s， 72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.7 基因組各片段克隆 PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對各目的片段進行純化回收，回收產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將PCR純化回收產(chǎn)物分別與pMDTM18-T Vector進行16 ℃連接30 min。連接體系：PCR產(chǎn)物4 μL，pMDTM18-T Vector 1 μL，Solution Ⅰ5 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL1-Blue感受態(tài)細胞中，挑單菌落搖菌，應用步驟1.6中的反應體系及反應程序進行菌液PCR驗證，將電泳鑒定結(jié)果為陽性的菌液送至睿博興科生物技術有限公司進行測序。

1.8 基因組序列同源性及遺傳進化分析 應用DNAMAN軟件將測得的7段基因序列進行拼接，組成完整的基因組序列。應用DNASTAR軟件和MEGA軟件分別對ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的基因組、NS基因、VP基因的核苷酸序列及其氨基酸序列與GenBank登錄的具有代表性的39株ChPV參考株以及2株美國火雞細小病毒(TuPV)參考株基因組進行基因特征和同源性分析。應用MEGA 5.02軟件Neighbor-Joining方法將ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株與GenBank登錄的參考株構(gòu)建基因組的遺傳進化樹，分析ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株基因組的遺傳進化關系。應用SimPlot 3.5.1(http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot)分析分離株的重組情況。

1.9 VP2蛋白三級結(jié)構(gòu)預測 利用Phyre 2(Protein Homology/AnalogyRecognition Engine2)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/)預測ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株VP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)，應用PYMOL Viewer(http://www.pymol.org)分析預測的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 臨床病料的檢測 應用PVF1和PVR1檢測引物分別從山東濰坊送檢的腸、法氏囊病料和河南濮陽送檢的腺胃、肝、腸病料中PCR擴增出片段長度為561 bp的目的片段，如圖1和圖2所示。測序結(jié)果BLAST比對分析確定送檢的2份病料均為ChPV陽性病料，分別將其命名為ChPV-SDWF和ChPV-HNPY。

圖1 山東濰坊臨床病料PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR test results of clinical material from Weifang districtM：DL-2 000 DNA marker； 1～8：心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、法氏囊； 9：陰性對照M:DL-2 000 DNA marker; 1～8:Heart, liver, spleen, lung, kidney,intestine, brain, bursa of fabricius; 9:Negative control

圖2 河南濮陽臨床病料PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR test results of clinical material from Puyang districtM：DL-2 000 DNA marker； 1～3：腺胃、肝、腸； 4：陰性對照M:DL-2 000 DNA marker; 1～3:Glandular stomach,liver, intestine; 4:Negative control

2.2 基因組各片段的PCR擴增 以ChPV陽性病料提取的DNA為模板，分段擴增出302 bp、1 559 bp、1 360 bp、 569 bp、895 bp、1 448 bp、333 bp的ChPV基因組片段，與預期片段大小一致，如圖3所示。

圖3 ChPV基因組各片段PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of each fragment of ChPV genomeM：DL-2 000 DNA marker； 1～7：片段A、片段B、片段C、片段D、片段E、片段F、片段G； 8：陰性對照M:DL-2 000 DNA marker; 1～7:Fragment A, fragment B,fragment C, fragment D, fragment E, fragment F,fragment G; 8:Negative control

2.3 基因組序列結(jié)構(gòu)分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株基因組全長編碼核苷酸序列均為4 615 bp， 包含3個開放閱讀框。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，ORF2編碼次要和主要衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，ORF3編碼假定蛋白NP1。NS1(1～2 085 nt)從ATG開始到TAG結(jié)束，共2 085 bp，編碼694 aa。

NP1(2 286～2 591 nt)長為306 bp，編碼101aa；NS1和NP1之間存在201 nt非編碼區(qū)。VP1(2 588～4 615 nt) 從ATG到TAA共含有2 028 bp，編碼675 aa；VP2(3 005～4 615 nt)從VP1中間開始編碼，與VP1共用1個終止密碼子TAA，全長1 611 bp，編碼536 aa；在3 197～3 199nt可能存在VP3的起始密碼子ATG。

2.4 基因組核苷酸序列同源性與遺傳進化分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株2個分離株間核苷酸同源性為96.9%，ChPV-SDWF株和ChPV-SDWF株與美國TuPV參考株TuPV-260同源性分別為95.7%和95.4%，與匈牙利ChPV參考株ChPV-ABU-P1同源性分別為95.1%和94.9%，與4株美國ChPV參考株同源性分別為85.4%～93.0%、85.1%～93.6%，與5株韓國參考株同源性分別為88.3%～92.2%、87.6%～92.1%，與29株中國廣西參考株的同源性分別為81.6%～94.7%、81.5%～95.4%?；诤塑账嵝蛄械幕蚪M遺傳進化分析表明，ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株位于同一個小的分支，與匈牙利ChPV參考株ChPV-ABU-P1和美國TuPV參考株TuPV-260位于同一個大的分支，ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株親緣關系最近，二者與TuPV-260株親緣關系較近，其次是ChPV-ABU-P1株(圖4)。用Z檢驗進行基因選擇分析發(fā)現(xiàn)2個分離株的全基因組都進行了純化選擇(負選擇)。SimPlot分析表明，ChPV-SDWF株(見封三彩版圖5A)和ChPV-HNPY株(見封三彩版圖5B)基因組核苷酸序列沒有出現(xiàn)重組信號，分離株與參考株間5′端NS1基因同源性高，3′端的VP1基因和VP2基因同源性低，VP2基因同源性最低。

圖4 基因組遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed on genomic sequences

圖5 分離株基因組序列Simplot分析結(jié)果Fig.5 Simplot analysis based on full-length nucleotide sequencesA:ChPV-SDWF株基因組； B:ChPV-HNPY株基因組A:Genome of ChPV-SDWF; B:Genome of ChPV-HNPY

2.5NS1基因序列 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的NS1基因具有高度同源性，其核苷酸和氨基酸同源性分別為98.0%和99.0%。ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株與國內(nèi)外ChPV參考株NS1基因核苷酸分別為88.6%～97.2%、88.4%～97.5%，氨基酸同源性分別為92.5%～99.1%、92.4%～99.1%；與TuPV參考株NS1基因核苷酸同源性分別為88.5%～97.7%、88.3%～97.1%，氨基酸同源性分別為89.8%～98.9%、90.1%～98.1%。ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的NS1基因的392～399 aa位和436～437 aa位都存在保守的P-loop基序(GPANTGKT)和NTP結(jié)合基序(EE)。

2.6VP1基因序列分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株之間的VP1核苷酸和氨基酸同源性分別為95.2%和98.4%。2個分離株與ChPV參考株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分別為73.4%～95.7%、79.6%～99.0%；與TuPV參考株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分別為73.9%～94.8%、79.5%～99.0%。在ChPV-SDWF株VP1基因的164～170 aa位和ChPV-HNPY株VP1基因的163～170 aa位存在富含甘氨酸(G)基序，但ChPV-SDWF株比ChPV-HNPY株少1個G。

2.7VP2基因序列分析 ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株的VP2核苷酸和氨基酸同源性分別為94.4%和98.7%。2個分離株與ChPV參考株VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分別為71.7%～95.0%和78.8%～99.4%；與TuPV參考株VP2基因核苷酸和氨基酸同源性分別為72.8%～94.1%和79.3%～99.4%。ChPV-SDWF株VP2基因的134～151 aa位存在五重圓筒基序(LQVIQKTVTDSGTQYSND)，在152 aa位存在1個亮氨酸(L)。

2.8 VP2蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果 從預測得到的ChPV-SDWF株(見封三彩版圖6A)和ChPV-HNPY株(見封三彩版圖6B)VP2蛋白3D結(jié)構(gòu)模型可以看出，VP2含有由8條反向平行的β折疊圍成的桶，表面存在4個Loop，其中Loop3和Loop4變異最大。

圖6 VP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型Fig.6 Tertiary structure model of VP2 proteinA:ChPV-SDWF株VP2蛋白； B:ChPV-HNPY株VP2蛋白A:VP2 protein of ChPV-SDWF; B:VP2 protein of ChPV-HNPY

3 討論

ChPV是引起雞腸道疾病的重要病原體之一，能導致家禽出現(xiàn)腹瀉、體重減輕等癥狀。本研究從山東濰坊送檢病死雞的法氏囊和河南濮陽送檢病死雞的腺胃、腸道中成功檢測出ChPV，通過PCR擴增出2株完整的基因組序列，在ChPV基因組各片段的PCR擴增過程中，通過對退火溫度進行優(yōu)化，最終確定片段1、2的最佳退火溫度為55 ℃，片段3、4的最佳退火溫度為60 ℃，片段5、6、7的最佳退火溫度為58 ℃。

對來自不同地域的毒株進行基因組序列同源性和遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，ChPV-SDWF株與ChPV-HNPY株核苷酸同源性最高，親緣關系最近，其次與美國TuPV參考株TuPV-260和匈牙利ChPV參考株ChPV-ABU-P1核苷酸同源性較高，親緣關系較近。通過對分離株與參考株的NS1基因、VP1基因和VP2基因核苷酸和氨基酸的同源性分析發(fā)現(xiàn)，NS1基因較VP1基因和VP2基因具有較高的保守性，其次是VP1和VP2基因。ChPV-SDWF株與ChPV-HNPY株與美國TuPV參考株TuPV-260具有較高的同源性和較近的親緣關系，說明它們在某個時間從一個共同的祖先分化開來[5]，也說明了不同毒株同源性的高低以及親緣關系的遠近與不同毒株所處的地域沒有直接的關聯(lián)?；贑hPVVP1基因構(gòu)建的遺傳進化樹同基于全基因組構(gòu)建的遺傳進化樹的相似性好于基于NS1和VP2構(gòu)建的遺傳進化樹(數(shù)據(jù)未提供)，據(jù)此可推測可用VP1基因來代替全基因組構(gòu)建遺傳進化樹。VP2蛋白的三級結(jié)構(gòu)表明在蛋白外表面有4個Loop，內(nèi)部有1個由8條反向平行的β折疊形成的桶，與ChPV ABU-P1基因組具有類似的結(jié)構(gòu)[12]。

本研究提供了2株ChPV完整的基因組序列，并對來自不同地域的毒株進行基因組序列同源性和遺傳進化分析。鑒于雞群感染ChPV造成的經(jīng)濟損失，有必要對我國雞群中ChPV的地理分布進行廣泛的流行病學研究。本研究可為ChPV診斷和流行病學研究提供參考。