豬蛔蟲全基因組微衛(wèi)星分子記開發(fā)與特征分析

何晶晶，黃建華，牛紅艷，周春花，吳小平

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

豬蛔蟲(AscarissuumGoeze，1782年)隸屬于線蟲綱蛔蟲目，主要寄生于豬小腸，是生豬感染的最常見寄生蟲之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。同時(shí)豬蛔蟲也可以感染人，危害人類健康[2]。因此，許多國家已將其納入公共衛(wèi)生學(xué)范疇[3]。微衛(wèi)星標(biāo)記又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(Simple tandem repeat,STR)，廣泛分布于原核和真核生物基因組中，由1～6 bp的重復(fù)單元串聯(lián)而成，以雙核苷酸重復(fù)最為常見[4]。與其他分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星分子標(biāo)記因其存在廣泛、數(shù)量多、分布均勻、多態(tài)性信息豐富、遺傳共顯性、具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性、易于檢測等優(yōu)點(diǎn)，成為目前遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究中的首選標(biāo)記之一[5]。但目前沒有關(guān)于豬蛔蟲的微衛(wèi)星分子標(biāo)記相關(guān)信息的報(bào)導(dǎo)。雖然有學(xué)者應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記研究豬蛔蟲，但這些標(biāo)記都是基于其近緣種人蛔蟲而開發(fā)[6-8]。近年來隨著測序技術(shù)的發(fā)展，從全基因組水平研究物種的微衛(wèi)星，一方面可以了解不同物種微衛(wèi)星的生物信息學(xué)特征，另一方面可以揭示微衛(wèi)星在遺傳多樣性等領(lǐng)域的應(yīng)用[9-10]。因此，近年來基于全基因組開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記受到研究者青睞。豬蛔蟲全基因組測序已完成，其基因組微衛(wèi)星分布規(guī)律也有報(bào)道[11-12]。本試驗(yàn)基于已公布的豬蛔蟲全基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，驗(yàn)證其多態(tài)性，并進(jìn)一步檢測其在近緣種人蛔蟲中的擴(kuò)增情況，以期為豬蛔蟲和人蛔蟲的種群遺傳研究、流行病學(xué)、宿主特異性、遺傳結(jié)構(gòu)、交配模式提供有價(jià)值的研究工具和分子標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 材料 豬蛔蟲采自撫州市孝橋屠宰場，收集了25頭豬的腸內(nèi)容物，共198條豬蛔蟲。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 取豬蛔蟲樣本，剪下一小段體壁組織(約5 mm)用雙蒸水洗去固定液(2～3 次)，剪碎，采用Wizard?SV Genomic DNA Purification System 試劑盒提取DNA。本試驗(yàn)豬蛔蟲全基因組序列從美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載，然后使用軟件MSDB v2.4.1搜索并統(tǒng)計(jì)微衛(wèi)星序列，根據(jù)SSR側(cè)翼序列的保守性使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物長度18～22 bp，GC含量在40%～60%，目的片段長度在100～400 bp?？偣苍O(shè)計(jì)了104對(duì)豬蛔蟲微衛(wèi)星引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用上述104對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL:PremixTaqVersion 2.0(TaKaRa)10 μL，上下游引物和DNA模板各2 μL，M-13FAM熒光標(biāo)記引物1.6 μL，加水至20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，先進(jìn)性5個(gè)循環(huán)的高溫PCR：94 ℃ 變性45 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，再進(jìn)行30個(gè)低溫循環(huán)：94 ℃變性45 s，退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3 引物的篩選 104對(duì)微衛(wèi)星引物均先用6個(gè)DNA樣本擴(kuò)增，能全部擴(kuò)增出條帶的引物即被初選。然后將初選得到的引物用于豬蛔蟲種群的擴(kuò)增(n=30)，瓊脂糖凝膠電泳后，將有條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行STR掃描。并將所有有多態(tài)性的引物用人蛔蟲(n=6)擴(kuò)增。

1.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)掃描結(jié)果，利用CERVUS V2.0計(jì)算等位基因數(shù)(Number of observed alleles,NA)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,HO)、期望雜合度 (Expected heterozygosity,HE)和多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)，利用Micro-Checker ver. 2.2.3計(jì)算無效等位基因頻率(Frequency of null alleles,F)。利用Popgene1.32進(jìn)行近交系數(shù)(Inbreeding coefficient,FIS)和哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢測。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多態(tài)性分析 本試驗(yàn)基于豬蛔蟲全基因組，根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性共設(shè)計(jì)了104對(duì)引物，經(jīng)擴(kuò)增篩選共獲得38對(duì)能穩(wěn)定擴(kuò)增并具有清晰條帶的引物，經(jīng)再次篩選后擴(kuò)增成功的有28個(gè)位點(diǎn)，初步測試顯示所有位點(diǎn)也能在人蛔蟲中擴(kuò)增(表中數(shù)據(jù)未顯示)。在篩選到的28對(duì)引物中有25對(duì)具有多態(tài)性(表1)，擴(kuò)增成功率26.9%。在25個(gè)有多態(tài)性的位點(diǎn)中，每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增得到的等位基因數(shù)(NA)在2～25個(gè)，平均8.2個(gè)；觀測雜合度(HO)范圍為0～1，平均值0.442；期望雜合度(HE)范圍為0.042～0.945，平均值0.602；多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.040～0.921，平均值0.558，其中有15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)顯示高度多樣性(PIC>0.5)，5個(gè)位點(diǎn)顯示中度多態(tài)性(0.5>PIC>0.25)，其他位點(diǎn)多態(tài)性較低(PIC<0.25)(表1)；無效等位基因頻率范圍為0～0.293 3，ASM46、ASM132、ASM213、ASM252、ASM535、ASM551、ASM573、ASM597、ASM598、ASM615、ASM632、ASM650這12個(gè)位點(diǎn)沒有出現(xiàn)無效等位基因，其他位點(diǎn)均存在無效等位基因。

2.2 哈迪-溫伯格平衡檢測 Hardy-Weinberg檢測顯示，篩選獲得的25個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中有15個(gè)符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)，有10個(gè)位點(diǎn)或多或少偏離哈迪-溫伯格平衡(圖1)。此外，通過Popgene1.32計(jì)算的FIS變化區(qū)間為-0.198 5～1，其中21個(gè)位點(diǎn)FIS>0(圖1)。

圖1 豬蛔蟲微衛(wèi)星位點(diǎn)的FIS值統(tǒng)計(jì)Fig.1 FIS value of microsatellite loci in A.suum注：負(fù)值表示雜合子過剩， 正值表示純合子過量； *：偏離哈迪-溫伯格平衡的位點(diǎn)(*:0.01

3 討論

HWE檢測顯示，多數(shù)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡。這與人蛔蟲和Nicrophorusvespilloides開發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記類似[6,13]，同時(shí)烏干達(dá)西南部人蛔蟲的遺傳多樣性研究也出現(xiàn)了這種情況[14]，這很可能是蛔蟲種群的普遍現(xiàn)象。而造成這種結(jié)果的原因可能是由于這些位點(diǎn)的純合子過量或近親繁殖，但也可能是由于這些標(biāo)記物中存在無效等位基因引起的，此次試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)無效等位基因確實(shí)存在，而且無效等位基因存在的多數(shù)位點(diǎn)偏離HWE，其中ASM7、ASM69、ASM118、ASM168這4個(gè)位點(diǎn)顯著偏離HWE(P≤0.001)，同時(shí)這些位點(diǎn)無效等位基因頻率相比于其他位點(diǎn)也較高。由此推斷無效等位基因的存在可能是導(dǎo)致偏離HWE的原因之一。

此外，F(xiàn)IS檢測顯示21個(gè)位點(diǎn)FIS>0，且多數(shù)位點(diǎn)觀測雜合度小于期望雜合度，這與人蛔蟲及其他線蟲相似[6,15]，表現(xiàn)為雜合子缺失，種群個(gè)體間親緣關(guān)系較近。試驗(yàn)結(jié)果表明，多數(shù)位點(diǎn)雜合子缺失，這種現(xiàn)象可能是由宿主內(nèi)個(gè)體近交和/或Wahlund效應(yīng)造成。而Criscione等在人蛔蟲遺傳多樣性分析中也發(fā)現(xiàn)了雜合子缺失的多數(shù)位點(diǎn)也偏離哈迪-溫伯格平衡，并解釋這種現(xiàn)象可能是由于Wahlund效應(yīng)，而非宿主內(nèi)隨機(jī)交配[6]。綜上所述，本試驗(yàn)認(rèn)為多數(shù)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡可能是由無效等位基因和/或雜合子缺失造成的。

本試驗(yàn)基于已公布的豬蛔蟲全基因組，進(jìn)行了豬蛔蟲微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)和特征分析，篩選獲得了25個(gè)能穩(wěn)定擴(kuò)增并具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。這些標(biāo)記可用于蛔蟲遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、譜系鑒定和種間雜交等的研究。

表1 豬蛔蟲25個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)特征描述Table 1 Characteristics of the 25 microsatellite loci for A. suum

續(xù)表1