酵母終止子工程：從機理探索到人工設(shè)計

盛月，張根林

（石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆兵團化工綠色過程重點實驗室，新疆 石河子 832003）

合成生物學(xué)作為21 本世紀一個充滿活力的新興交叉學(xué)科，以工程化思想理性設(shè)計改造生命體、創(chuàng)造新功能。該技術(shù)突破了生命發(fā)生與進化的自然法則，推動了解讀生命到編寫生命的跨越，可為破解資源、能源、健康、環(huán)境、安全等重大難題提供重要技術(shù)支撐。通過引入新的合成途徑或功能模塊，已在微生物中實現(xiàn)了青蒿酸、人參皂苷、紫杉二烯、異丁醇等復(fù)雜或高值化合物的合成，在化學(xué)品合成、藥物發(fā)現(xiàn)與制造、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域均表現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價值［1-2］。

有效的生物元器件是途徑組裝和生命體改造的基礎(chǔ)，其中控制元件更是影響人工生物體系的重要因素之一。原核生物中含有上萬種調(diào)節(jié)線路，它們能夠在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平對環(huán)境信號進行感應(yīng)和應(yīng)對，人們成功地從這些線路中挖掘出了啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、核糖體結(jié)合位點等大量的控制元件，并構(gòu)建了人工核酸開關(guān)等應(yīng)用于代謝途徑的精細調(diào)控［3］。但由于真核生物復(fù)雜的遺傳特性，在其中開發(fā)的控制元件相對單一，常見的控制元件主要是啟動子，限制了真核生物中合成線路的構(gòu)建和應(yīng)用［4］。

近年來，科學(xué)家在釀酒酵母、大腸桿菌、病毒、哺乳動物和十字花科植物等物種中開展了大量的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)不少基因的3′-UTR 區(qū)域含有調(diào)控mRNA 穩(wěn)定性和亞細胞定位相關(guān)的功能元件。3′-UTR是mRNA上從終止密碼子到poly(A)尾巴的一段RNA 序列，長度從幾百個堿基至上千個堿基不等，常為冗余的重復(fù)序列，并且大多數(shù)可以形成莖環(huán)。將位于mRNA 3′-UTR 區(qū)域內(nèi)能夠利用自身“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)阻止RNA 聚合酶Ⅱ在模板上移動，并與其他高度保守元件和蛋白因子共同協(xié)作實現(xiàn)3′末端的加工，給予RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄終止信號，促進轉(zhuǎn)錄終止的元件稱為終止子（terminator）［5-6］。釀酒酵母每個基因的表達均受終止子元件的調(diào)控，當(dāng)轉(zhuǎn)錄進行到3′末端時，終止子利用自身富含GC 的區(qū)域形成一段穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，阻礙了RNA 聚合酶Ⅱ在模板鏈上移動，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。

不同活性終止子的使用能夠影響mRNA 的穩(wěn)定性、切割效率、聚腺苷酸化反應(yīng)以及3′-UTR 區(qū)域的長度和穩(wěn)定性，最終影響基因表達程度［7-10］?；趯K止子關(guān)鍵核心序列認識的不斷提高，以更短、性能更強、活性可控、可設(shè)計為特征的終止子工程迅速發(fā)展。以這種表達“輸出”控制方式的工程應(yīng)用也不斷涌現(xiàn)，表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力。因此，本文作者針對合成生物技術(shù)常用的釀酒酵母模式底盤，以機理探索到人工設(shè)計為主線總結(jié)終止子的研究進展，主要包括終止子元件的結(jié)構(gòu)與功能、作用機理、人工設(shè)計及應(yīng)用進展，并對終止子工程面臨的問題和發(fā)展趨勢做出討論，為開發(fā)合成生物學(xué)元件和異源合成途徑優(yōu)化提供有用的信息。

1 釀酒酵母終止子的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 終止子元件的基本構(gòu)成

合成生物學(xué)按照工程學(xué)理念，將生命體系中發(fā)揮功能最簡單、最基本的單元統(tǒng)稱為生物元件，調(diào)控元件是生物調(diào)控的重要組成部分，啟動子、終止子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白因子等可以作為調(diào)控元件作用于基因轉(zhuǎn)錄、翻譯水平［11-12］。為了明確釀酒酵母mRNA 3′末端形成所涉及的元件，豐富途徑工程發(fā)展，1996年Guo和Sherman率先定義了酵母終止子形成所必需的最小元素集：效率元件（efficiency element，EE）、位置元件（positioning element，PE）、poly（A）位點［poly（A）sites，Py（A）n］以及圍繞poly（A）位點的富T區(qū)域［圖1（a）］［13］。若將這些元素組合在一起，足夠發(fā)揮酵母3′末端的轉(zhuǎn)錄終止功能。

圖1 釀酒酵母終止子的基本結(jié)構(gòu)與表征方法［13］Fig.1 Structure of terminator in S.cerevisiae and their characterization[13]

現(xiàn)已證明，效率元件一般位于終止子序列最上游，富含TA，序列TATATA、TATGTA、TACATA、TAAATA、TACCTA 是常見的效率元件，當(dāng)序列為TATATA時最有利于終止子效率文件的活性，并有提高下游位置元件使用效率的作用［14-15］。終止子的終止效果與效率元件的長度成正比，但效率元件的序列長度最少不能小于6 bp，大約50%終止子均有TATATA序列，其中第一和第五個堿基T對3′末端加工影響最大。另外，效率元件能夠輔助下游位置元件定位，提高元件使用效率。mRNA 3′末端的形成需要poly（A）位點上游的恒定位置元件進行終止信號的識別。位置元件是富含A的元件，位于poly（A）位點上游約10～30 bp，序列AAAAAAAA、TTAAGAAC、 AAGAA、 AATAAATGA、 AAAAAA、AATAAA 是常見的位置元件。當(dāng)位置元件的序列為AAAAAA 時，類似于哺乳動物中的六聚體定位poly（A）位點，終止子活性最強。位置元件募集大量轉(zhuǎn)錄終止因子、切割和多聚腺苷酸化因子共同完成加工和剪切過程，輔助識別切割位點，指導(dǎo)poly（A）位點的定位［16-20］。Guo 利用終止子 CYC1t 和ADH1t 對poly（A）位點的序列進行了系統(tǒng)研究，表明poly（A）位點實際序列由胞苷或胸腺嘧啶加上一個或多個腺苷殘基組成，夾在兩個富含U/GU 的側(cè)翼序列之間，TTTCAAA 是聚腺苷酸化發(fā)生的最佳序列，切割位點通常發(fā)生在核苷酸CA 上，第二個核苷酸A始終是一個發(fā)生切割的腺苷殘基，切割完成后添加poly（A）尾巴標志著轉(zhuǎn)錄完成，poly（A）位點的位置主要由效率元件和位置元件共同決定［13］。側(cè)翼富含U/GU的區(qū)域可用于調(diào)節(jié)poly（A）位點的使用效率和精確t 切割位置，以完成mRNA 3′末端的多聚腺苷酸化加工形成成熟的mRNA［21-26］。

顯然，這些簡單的元素共同參與了3′末端的形成過程，但其他序列也會影響終止子的強度。研究表明，終止子的終止作用除了與上述元件及它們的序列有關(guān)之外，還與各個元件之間的連接序列Linker 1 和Linker 2 的序列和長度有關(guān)。如果效率元件、位置元件和poly（A）位點的序列是確定的，那么Linker 1 序列的GC 含量和Linker 2 序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)將成為影響終止子強度的重要因素［27-28］。Guo［13］等通過CYC1-lacZ融合基因的轉(zhuǎn)錄分析證明，位置元件與效率元件相距10～20 bp，與poly（A）位點相距10～30 bp。

1.2 終止子的功能表征

終止子的活性一般通過所控制基因的蛋白質(zhì)表達水平來表征。常利用綠色熒光蛋白基因（eGFP）、紅色熒光蛋白基因（mKO2）等報告基因為功能基因，將終止子插入報告基因的下游，通過流式細胞儀等手段檢測報告基因的表達情況，可將樣品熒光值（［GFP］t）與對照組熒光值（［GFP］0）差值的對數(shù)（FⅠ）作為終止子活性值，該值越大表明終止子的轉(zhuǎn)錄終止能力越強［圖1（b）］，（P1 為對照組-eGFP陰性區(qū)域，P2 為樣品組-eGFP陽性區(qū)域）。終止子是3′-UTR區(qū)域的功能元件，多為重復(fù)的冗余序列，常將位于基因3′-UTR 區(qū)的序列認為是終止子所在區(qū)域，因此在分析終止子時，常將蛋白質(zhì)編碼序列下游約500 bp 的序列或全部序列作為終止子元件，每個編碼序列都與一個實質(zhì)性的 3′-UTR 序列相關(guān)［29-30］。Yamanishi 等［30］從酵母基因組中克隆出約500 bp 的3′-UTR 區(qū)域，在eGFP下游插入不同的終止子，表征了釀酒酵母5880 個基因中的5302 個終止子，相對于PGK1 終止子的FⅠ值而言，發(fā)現(xiàn)酵母天然終止子的活性范圍可達0.036～2.52。Curran 等［27］表征了 34 個不同的酵母終止子，發(fā)現(xiàn)最活躍的終止子能使目標基因的mRNA 半衰期增加2.5 倍，而使蛋白質(zhì)過表達6.5倍。

1.3 終止子的分類

為了方便終止子研究與使用，可將終止子根據(jù)活性大小按照強、中、弱進行分類。由于強終止子序列更容易形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不僅能夠更快速地阻止RNA聚合酶Ⅱ在模板鏈上繼續(xù)前行，促進轉(zhuǎn)錄終止，也能提高mRNA 的穩(wěn)定性，增加蛋白質(zhì)的積累。因此強終止子的使用能夠提高mRNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)量［31-32］。弱啟動子與強終止子的互補使用能達到和強啟動子相似的基因表達效果，甚至某些情況下弱啟動子結(jié)合中強度終止子可以使蛋白質(zhì)表達效率提高幾倍，但誘導(dǎo)型啟動子和強啟動子與終止子活性的影響不大。研究酵母轉(zhuǎn)錄和聚合酶的催化中心發(fā)現(xiàn)，終止子的終止調(diào)控作用是酵母基因表達不可或缺的。終止子作為基因調(diào)控元件，主要功能是負責(zé)轉(zhuǎn)錄終止、mRNA 3′末端加工，最終通過影響mRNA 的穩(wěn)定性、翻譯效率和定位調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。然而，終止子作為基因元件是獨立于報告基因和編碼區(qū)序列而行使功能的，其活性不受所表達功能基因的調(diào)節(jié)。通過測量天然終止子的活性，已經(jīng)確定終止子的缺失會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程的冗長，而出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定。本課題組前期用eGFP驗證了糖酵解途徑和TCA 循環(huán)途徑中的100 個終止子，以釀酒酵母基因組為模板擴增相應(yīng)的終止子片段，構(gòu)建“TYS1p+eGFP+Terminators”基因表達盒，流式細胞儀檢測終止子強度，也發(fā)現(xiàn)了天然終止子的活性差異，強度范圍可達0.0613～1.8002［33］。以常用的終止子PGK1t 的FⅠ值為標準，人為地將FⅠ值小于0.0613 的終止子劃分為弱終止子；將FⅠ值大于0.9826的終止子劃分為強終止子；將FⅠ值在0.0613和0.9826 之間的終止子劃分為中等強度終止子。因此，在100 個酵母天然終止子文庫里含有45 個強終止子、31 中等強度終止子和24 個弱終止子，其 中 終 止 子 MⅠC60、 SOR1t、 ELO2t、 NTA1t、MMS22t和GRS2t是第一次被表征和報道。

2 釀酒酵母終止子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理

轉(zhuǎn)錄是將RNA 聚合酶募集到啟動子，合成mRNA 并在終止子序列上解離RNA 聚合酶的高度復(fù)雜的過程，受到多種因素的影響。其中兩個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控事件是轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控和轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控［34-36］。轉(zhuǎn)錄調(diào)控指通過改變轉(zhuǎn)錄速率從而改變基因表達的水平，可以控制轉(zhuǎn)錄何時發(fā)生以及產(chǎn)生多少，是基因表達調(diào)節(jié)控制中的一個重要環(huán)節(jié)［37-40］。研究表明，基因正確的表達需要RNA 聚合酶ⅠⅠ的有效終止以避免轉(zhuǎn)錄干擾和非編碼RNA的合成。終止滯后將破壞同一染色體上的其他基因表達；終止提前將產(chǎn)生縮短的有缺陷的mRNA，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變異，因此轉(zhuǎn)錄過程受到嚴格的調(diào)控。酵母的轉(zhuǎn)錄終止涉及轉(zhuǎn)錄終止因子、多聚腺苷酸化因子、組蛋白、核小體等，終止子利用自身的功能元件募集這些調(diào)控因子共同完成轉(zhuǎn)錄終止［41-43］。

酵母mRNA 3′末端是通過轉(zhuǎn)錄終止形成的，與其他高等真核生物相比，使用了更加復(fù)雜的加工機制。從機制上講，終止子定義了3′-UTR 的序列和結(jié)構(gòu)，在3′末端發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止信號并利用自身元件募集蛋白因子負責(zé)轉(zhuǎn)錄終止，切割新生的mRNA 鏈發(fā)生聚腺苷酸化反應(yīng)，有助于mRNA 的穩(wěn)定性。終止子區(qū)域的活性與mRNA 豐度成正相關(guān)，表明終止子是mRNA 豐度的決定因素，由于終止子在mRNA 加工中的重要性，最不活躍的終止子區(qū)域傾向于編碼更長的3′-UTR 區(qū)域，缺少終止子會產(chǎn)生延伸的轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定而無法翻譯［44-47］。

2.1 轉(zhuǎn)錄終止因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用

終止子元件作為3′末端區(qū)域重要的調(diào)控元件，具有調(diào)控mRNA亞細胞定位、穩(wěn)定性及翻譯效率的作用。終止子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄加工通常涉及兩個調(diào)控過程，轉(zhuǎn)錄終止涉及3′末端mRNA 的切割和poly（A）位點的剪切；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控涉及3′-UTR 區(qū)域的穩(wěn)定性、翻譯效率和mRNA 的定位。終止子內(nèi)的高度保守序列招募RNA 結(jié)合蛋白和相關(guān)蛋白因子，用于轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達的各個方面［48-50］。具體而言，終止子元件上的功能元件作為轉(zhuǎn)錄終止的修飾位點，通過招募與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的切割因子ⅠA、切割因子ⅠB、聚腺苷酸化特異性因子復(fù)合物CPF，共同完成3'末端復(fù)雜的加工機制［51-53］。在釀酒酵母中已經(jīng)鑒定出超過20 種以上的蛋白質(zhì)因子與mRNA 3′末端加工有關(guān)，但大多數(shù)蛋白質(zhì)因子都沒有關(guān)于詳細功能的解析或與終止子結(jié)合靶標的信息［54］。

終止子通過切割因子ⅠA、切割因子ⅠB 識別自身效率元件和位置元件進行3′末端的加工和切割。而多聚腺苷酸化反應(yīng)首先由切割因子ⅠB 和CPF 蛋白質(zhì)復(fù)合物識別終止子元件上的ploy（A）位點及圍繞ploy（A）位點的富U/GU 區(qū)域進行切割，在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，3′末端會合成具有一定長度的ploy（A）尾巴，將mRNA 從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中翻譯成蛋白質(zhì)［55-57］。切割因子 ⅠA、ⅠB 的亞基根據(jù)其不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和裸露在外的氨基酸殘基行使不同的功能，結(jié)合不同的終止子區(qū)域（圖2）。突變或過表達切割因子ⅠA、ⅠB均會造成轉(zhuǎn)錄終止缺陷，但并不會完全停止轉(zhuǎn)錄。同樣，終止子的缺失可能延長轉(zhuǎn)錄過程造成下游基因的通讀，導(dǎo)致目標基因和蛋白質(zhì)表達量的減少［58-59］。遺傳和功能研究表明轉(zhuǎn)錄終止因子與RNA 的精確結(jié)合對于3′末端轉(zhuǎn)錄終止有巨大作用，在當(dāng)前的釀酒酵母轉(zhuǎn)錄終止因子研究中，僅有非編碼蛋白Nrd1、Nab3 在全基因組上的靶標RNA 序列研究較為清楚，分別識別 UGUAG/A 和 UCUUG［60-62］。另外，目前已確認轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11、Rtt103、Mbp1、Fkh1 主要作用于聚腺苷酸化反應(yīng)，但它們?nèi)绾闻c終止子結(jié)合行使終止功能還不完全清楚［63-66］。

圖2 釀酒酵母終止子參與的可能終止機理Fig.2 Possible termination mechanism of terminators in S.cerevisiae

在上述轉(zhuǎn)錄終止因子中，發(fā)現(xiàn)切割因子ⅠB 家族包含的轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11 與裂殖酵母、哺乳動物、人、果蠅等中都含有類似的功能同系物，并貫穿于整個轉(zhuǎn)錄終止過程，推測Pcf11 具有多種功能［67-71］。第一，Pcf11 能夠識別終止子區(qū)域上的位置元件，利用自身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域招募蛋白質(zhì)因子Clp1、Rna14、Rna15 和切割與多聚腺苷酸化因子CPF 共同完成3′末端加工過程，同時促進新生pre-RNA 鏈從DNA-RNA-RNA 復(fù)合物中釋放，促進轉(zhuǎn)錄終止［72-73］。第二，Pcf11介導(dǎo)與ploy（A）位點相關(guān)的切割和多聚腺苷酸化反應(yīng)，在ploy（A）位點處完成切割并添加ploy（A）尾巴，促進mRNA 成熟，并與非編碼RNA結(jié)合切割內(nèi)含子連接外顯子，構(gòu)建不同長度的轉(zhuǎn)錄本［74-75］。第三，在轉(zhuǎn)錄延伸過程進行到3′末端時，Pcf11 蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)與RNAP ⅠⅠRbp1 亞 基 CTD 區(qū) 域 中 磷 酸 化 的 Ser2、Ser5 結(jié)合，促進 mRNA 切割、RNAP ⅠⅠ從 DNA 模板鏈上的解離，開啟下一輪轉(zhuǎn)錄［76-79］?？傊?，轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11 通過識別終止子元件，參與mRNA 3′末端的加工和聚腺苷酸化反應(yīng)，既能影響轉(zhuǎn)錄終止的時機又能調(diào)控mRNA 的穩(wěn)定性，對轉(zhuǎn)錄過程具有全局調(diào)控作用，是一種重要的潛在全局調(diào)控元件。然而，目前對其具體的轉(zhuǎn)錄終止機制還不清楚，特別是關(guān)于Pcf11 是如何與終止序列識別并響應(yīng)的、它的靶標RNA 如何、Pcf11是如何參與聚腺苷酸化反應(yīng)進行poly（A）的位點選擇的。相信通過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11 等缺失菌株，利用高通量方法深入分析轉(zhuǎn)錄終止因子與終止子的結(jié)合位點和規(guī)律，將會進一步實現(xiàn)在全基因組層面分析轉(zhuǎn)錄終止過程的詳細調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為轉(zhuǎn)錄終止機理提供新的研究線索。

2.2 依賴于poly（A）位點的轉(zhuǎn)錄終止

真核生物的遺傳信息由三種聚合酶進行轉(zhuǎn)錄，作用于不同類型的轉(zhuǎn)錄本，RNA 聚合酶ⅠⅠ轉(zhuǎn)錄大量mRNA和一些經(jīng)典的非編碼功能基因SnoRNA和SnRNA，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物合成是一個嚴格調(diào)控過程，與其他RNA 加工事件共同進行［80-81］。對于蛋白質(zhì)編碼基因，轉(zhuǎn)錄終止主要依賴于poly（A）位點的終止路徑，與切割和聚腺苷酸化因子相關(guān)。在真核生物中除了組蛋白mRNA 幾乎絕大多數(shù)真核生物mRNA 和lncRNA 的3′末端都具有一串連續(xù)的腺苷，被稱為poly（A）尾巴。poly（A）尾巴與mRNA 的出核轉(zhuǎn)運、穩(wěn)定性和翻譯效率息息相關(guān)，具有重要的生物學(xué)意義［82-83］。

研究表明，絕大多數(shù)的mRNA 具有一個或兩個以上的多聚腺苷酸化位點，酵母、哺乳動物、擬南芥高達70%以上基因具有選擇性多聚腺苷酸化現(xiàn)象，在3′末端加工中具有重要作用，并受到復(fù)雜而精細的調(diào)控，涉及到許多蛋白質(zhì)-RNA 之間的相互作用［84-85］。這種相互作用可分為兩種情況：一種擁有多個 poly（A）位點，并且都在 3′-UTR 區(qū)對應(yīng)的mRNA 編碼區(qū)完全一樣，只是3′-UTR 長短不同稱為UTR-APA；一種是由選擇性切割導(dǎo)致，poly（A）位點位于不同的外顯子區(qū)域編碼序列有可能發(fā)生改變，稱為CR-APA［86-88］。在此過程中，貫穿整個轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄終止因子Pcf11 作為“加工支架”，能夠輔助CPF 識別poly（A）位點的側(cè)翼元件，有助于切割因子在poly（A）位點的準確切割，輔助蛋白質(zhì)復(fù)合物與pre-mRNA 的穩(wěn)定結(jié)合，有助于mRNA在蛋白質(zhì)合成中有效地發(fā)揮作用［89-90］?？梢钥闯?，poly（A）位點選擇性多聚腺苷酸化會直接影響到mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。

poly（A）位點位于整個轉(zhuǎn)錄本的3′末端，位點的選擇直接影響到mRNA最重要的調(diào)控區(qū)3′-UTR，是絕大多數(shù)RNA 結(jié)合蛋白和microRNA 調(diào)控的靶標區(qū)域，因此poly（A）位點的選擇會直接影響到mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率［91-92］。然而，酵母中選擇性多聚腺苷酸化的具體調(diào)控機理尚不明確，對其具體分子機制及功能性結(jié)果等尚處于研究的起步階段。認為多聚腺苷酸化過程通常與終止子序列具有內(nèi)在聯(lián)系，終止子元件上的ploy（A）位點與多聚腺苷酸化反應(yīng)必需的蛋白質(zhì)復(fù)合物的識別密切相關(guān)，其中3′末端的切割和多聚腺苷酸化是兩個重要的步驟［93-95］。pre-mRNA 切割和聚腺苷酸化是一種機制，令編碼蛋白mRNA 和長鏈非編碼RNA的3′末端中斷。該過程涉及大量多聚腺苷酸化因子與終止子功能元件之間的相互作用，其中ploy（A）位點的準確切割取決于切割和多聚腺苷酸化因子CPF 蛋白質(zhì)復(fù)合體，識別終止子區(qū)域內(nèi)的ploy（A）位點、富含GU/U 的側(cè)翼元件，促進ploy（A）位點的多聚腺苷酸化反應(yīng)過程。

2.3 不依賴poly（A）位點的轉(zhuǎn)錄終止途徑

與蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄終止相比，釀酒酵母大部分非編碼轉(zhuǎn)錄事件不依賴于RNA 切割終止，而是需要Nrd1-Nab3-Sen1蛋白復(fù)合物途徑終止。該途徑包括大多數(shù)小核仁RNA、隱形不穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本等。非編碼蛋白Nrd1、Nab3 在全基因組上的靶標RNA 序列研究較為清楚，通過與RNA 聚合酶ⅠⅠ的亞基Rbp1和終止子區(qū)域中的GUA/G核苷酸相互作用，分別識別UGUAG/A和UCUUG，其中Nrd1還可以通過促進過早轉(zhuǎn)錄終止來調(diào)控數(shù)百種蛋白質(zhì)編碼基因，這些靶標RNA序列在SnoRNA序列中是頻繁的，特定的RNA 基序?qū)τ贜rd1-Nab3-Sen1 蛋白復(fù)合物結(jié)合到新生的RNA上是至關(guān)重要的［96-98］。

3 釀酒酵母終止子的人工設(shè)計與合成

釀酒酵母可以利用自身有效的同源重組在體內(nèi)進行遺傳電路或合成途徑的組裝，但當(dāng)外源基因序列與酵母基因組序列重復(fù)或高度相似時，會給多基因裝配帶來問題［99］。大多數(shù)天然終止子的序列較長，作為元件使用時與酵母基因組同源重組的風(fēng)險較大，可能會導(dǎo)致體內(nèi)組裝構(gòu)建物中重復(fù)序列的重排，在構(gòu)建大型遺傳回路或途徑時較為困難，同時過長或太復(fù)雜的終止子也會影響異源基因mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，降低表達水平［100］。為了避免這些不足，終止子工程應(yīng)運而生。終止子設(shè)計的基本原則是，采用最少元素設(shè)計，將功能元件的最佳序列組合在一起，對天然終止子序列進行簡化，合成人工終止子，不僅使其具有與天然終止子相同的效應(yīng)，由于其與酵母基因組幾乎沒有同源性，大大降低了同源重組率，還能大幅度縮短終止子長度，減輕質(zhì)粒載體和菌株代謝負荷［101］。

終止子設(shè)計是沿著相對較短的線性DNA 進行模塊化組合的，可以創(chuàng)建高度精確的基因表達模式。從頭合成終止子的設(shè)計將提供比天然終止子更大的優(yōu)勢，就像合成啟動子可以勝過天然啟動子一樣，合成終止子可能同時影響多個mRNA 特性，即多聚腺苷酸化水平和3′-UTR 區(qū)域的結(jié)構(gòu)。為了構(gòu)建一系列合成的終止子，可從基礎(chǔ)元件、間隔區(qū)、二級結(jié)構(gòu)、GC 含量等方面設(shè)計（圖3）。Curran 等［102-103］基于構(gòu)成終止子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)元件，設(shè)計出30個短的、合成長度為35～70 bp的人工終止子，與常用的CYC1終止子相比，合成的短終止子更能提高mRNA 的穩(wěn)定性和增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，其中人工終止子最高使熒光蛋白輸出增加3.7 倍，轉(zhuǎn)錄水平增加4.4 倍，并且合成的終止子在釀酒酵母和解脂耶氏酵母中都具有很高的活性，證明了這些設(shè)計理念可在多種酵母菌種中轉(zhuǎn)移。

圖3 酵母終止子設(shè)計的思路Fig.3 The strategy for yeast terminators design

表達增強型終止子使釀酒酵母基因表達效率比對照提高了11 倍，與不使用終止子情況相比提高了35 倍，為今后終止子人工設(shè)計提供了理論依據(jù)和設(shè)計規(guī)則：如熒光蛋白的表達量與效率元件的序列長度成正比；位置元件和poly（A）位點對熒光蛋白的表達量沒有太大影響［104-105］。本課題組在優(yōu)化效率元件、位置元件和poly（A）位點基礎(chǔ)方面，進一步探討了間隔區(qū)序列對終止子活性的貢獻。在Guo首次描述定義酵母終止所需最小元素集的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建266 個長度約60 bp 的人工終止子文庫，初步發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律：終止子活性隨效率元件與位置元件間Linker 1序列GC含量的升高而降低，且隨Linker 1序列中T的增加而增加；Linker 1序列GC 含量對熒光蛋白表達量的影響要大于Linker 2序列；Linker 2 序列構(gòu)成的莖環(huán)對不同活性終止子具有不同程度的影響，降低弱、中等強度終止子的莖長有利于提高mRNA表達量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量［15，106］。這些研究充分證明終止子的活性是可以調(diào)節(jié)可以控制的，更短、最小序列的終止子可能被編入未來基因調(diào)控元件的設(shè)計和預(yù)測模型中，也將為理解終止子在基因表達調(diào)控中的作用提供重要信息。表1列舉了常用酵母終止子的相關(guān)信息。

4 終止子在酵母途徑精細調(diào)控中的應(yīng)用

盡管利用強啟動子控制途徑酶的表達是代謝工程和合成生物學(xué)中常用的調(diào)控方法，但隨著對轉(zhuǎn)錄終止過程的逐步解析，終止控制已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注［107］。由于終止子有助于mRNA 穩(wěn)定，將天然終止子用于基因表達盒構(gòu)建是構(gòu)建外源途徑的必然選擇［108-109］。而使用合成的人工終止子可以更加理性地調(diào)控mRNA 的半衰期，減少或增加蛋白質(zhì)產(chǎn)生［110］，因此通過選擇合適活性的終止子可以對代謝途徑進行精細調(diào)控［111-112］。利用終止子優(yōu)化合成途徑時，可考慮以下原則：①盡量選擇相對較短的終止子，以避免冗余序列帶來的干擾；②選擇終止子時要同時考慮相應(yīng)組成型啟動子的活性，弱、強元件的搭配可以達到使用高活性啟動子的效果；③使用誘導(dǎo)性啟動子時，終止子的調(diào)控作用將會明顯降低，因此只需考慮終止子是否易得、易操作；④若難以判斷某一基因?qū)Χ嗷蛲緩降挠绊憰r，可優(yōu)先考慮使用中等活性終止子，既能保證目的基因的有效表達，又能有效避免途徑上游基因?qū)ο掠位虻母蓴_。例如，本課題組通過優(yōu)選天然終止子來控制番茄紅素合成途徑，結(jié)合檸檬酸分批補料發(fā)酵使釀酒酵母合成番茄紅素的產(chǎn)量獲得了大幅提升［113］，在此基礎(chǔ)上，利用短的、人工合成的終止子控制番茄紅素途徑基因的表達，使番茄紅素產(chǎn)量又提高了13.0%，并發(fā)現(xiàn)在某些情況下中等活性終止子比強終止子更有利于代謝途徑表達。當(dāng)合成終止子用于較長途徑的β-香樹脂醇合成時，也表現(xiàn)出了良好的效果，使β-香樹脂醇產(chǎn)量提高了約12 倍［114］。目前，已在酵母中建立了大量的天然終止子文庫，同時部分結(jié)構(gòu)優(yōu)化的人工終止子元件已應(yīng)用于代謝途徑調(diào)控中，它們的調(diào)控能力較天然終止子有顯著提高，在代謝工程中具有極大的潛力。這些實例充分證明了終止子調(diào)控技術(shù)在控制代謝途徑中的重要作用，不僅能夠用于調(diào)節(jié)基因表達效率，還可以有效增強代謝途徑中目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。

表1 常用酵母終止子的信息Tab.1 properties of commonly used yeast terminators

5 結(jié)語與展望

合成生物技術(shù)突破了生命發(fā)生與進化的自然法則，推動了生命科學(xué)由解讀生命到編寫生命的跨越，將在破解資源、能源、健康、環(huán)境、安全等重大難題方面提供重要支撐。過去的一段時間里，啟動子、終止子等調(diào)控元件的研究為提升基因和途徑的表達給予了許多貢獻。然而，偏離期望的元件功能仍然是導(dǎo)致設(shè)計周期多次迭代、遺傳改造和途徑優(yōu)化快速發(fā)展的嚴重阻礙。穩(wěn)定、正交、可預(yù)測、可調(diào)的元件設(shè)計是優(yōu)化控制元件功能必須滿足的要求，控制元件的最小化已成為趨勢。迄今為止，人們對終止子結(jié)構(gòu)與功能、作用機理的探索取得了重要進展，新的合成終止子已經(jīng)為代謝工程和合成生物學(xué)應(yīng)用提供了重要支持。但由于真核細胞終止子受其所在染色質(zhì)環(huán)境的高度調(diào)控，對酵母終止子的工程化努力仍然較少。終止子與各類轉(zhuǎn)錄終止因子如何識別、識別位點或序列是什么，這些問題仍然是終止子優(yōu)化設(shè)計的限制。因此，有必要進一步制定控制終止子染色質(zhì)環(huán)境的設(shè)計規(guī)則，開發(fā)新技術(shù)來預(yù)測和設(shè)計期望功能的終止子。

為避免野生型酵母染色質(zhì)環(huán)境對終止子研究的干擾，利用人工合成酵母體系研究人工設(shè)計終止子的特性和調(diào)控機理將會是一種重要的技術(shù)選擇［115-116］。另外，新一代高通量測序技術(shù)為研究終止子轉(zhuǎn)錄機理注入了巨大的活力，是研究轉(zhuǎn)錄機理的新的發(fā)展趨勢。如紫外交聯(lián)免疫沉淀測序、染色質(zhì)免疫沉淀測序技術(shù)可為終止子元件與蛋白質(zhì)的結(jié)合靶點提供服務(wù)；多聚腺苷酸化位點測序技術(shù)將為多聚腺苷酸化反應(yīng)機理研究發(fā)揮積極作用［117-122］。

另外，巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、解脂耶氏酵母等非模式酵母近年來也展現(xiàn)出了優(yōu)良的工業(yè)應(yīng)用價值，通過構(gòu)建文庫等方法在這些酵母中也篩選到了一些內(nèi)源終止子［123-125］。盡管非模式酵母中終止子研究較少，但終止子是重要的合成生物學(xué)元件之一，是構(gòu)建基因表達盒和途徑的基本要素，因此非模式酵母中終止子的篩選、人工構(gòu)建甚至異源終止子的優(yōu)化等也將會是今后該領(lǐng)域的研究重點。相信通過終止子等元件的逐漸解析和開發(fā)，會彌補非模式酵母遺傳背景不夠清楚、代謝調(diào)控復(fù)雜性高的限制，必將為非模式酵母合成生物學(xué)的發(fā)展帶來新突破。