達(dá)托霉素生物合成過程的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

方教樂 ，呂中原 ，孫晨番 ，劉一帆 ，徐煒鋒 ，毛旭明 ，李永泉

（1 浙江大學(xué)藥物生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058； 2 浙江省微生物生化與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310058）

20 世紀(jì)70 年代青霉素的發(fā)現(xiàn)，以及之后不斷研發(fā)出來的抗生素，成為對付病菌感染的有效武器；但抗生素的過度使用，導(dǎo)致了致病菌特別是革蘭陽性菌產(chǎn)生耐藥性，形勢日益嚴(yán)峻。且現(xiàn)階段新藥研發(fā)越來越難，一旦感染“超級細(xì)菌”，或?qū)o藥可治，急需更新更有效的抗感染藥物。

圖1 達(dá)托霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)（a）和達(dá)托霉素的合成基因簇（b）Fig.1 Structural formula of daptomycin(a)and biosynthetic gene clusters of daptomycin(b)

達(dá)托霉素是繼萬古霉素之后發(fā)現(xiàn)的新型抗生素［圖1（a）］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)含多個(gè)非蛋白氨基酸［1-2］，系通過非核糖體肽（NRPS）途徑生物合成的一種環(huán)脂肽類藥物。達(dá)托霉素最初由美國禮來公司從玫瑰孢鏈霉菌的發(fā)酵液中分離提取獲得，在2003 年和2006 年分別被美國和歐盟批準(zhǔn)為用于治療由革蘭陽性菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引起皮膚結(jié)構(gòu)感染和菌血癥［3-4］，目前達(dá)托霉素國際市場年銷售已達(dá)20 億美元。達(dá)托霉素存在一個(gè)特殊的EF-手性模塊，與Ca2+結(jié)合后，插入到細(xì)菌的磷脂雙分子層并寡聚化，在細(xì)胞膜上形成大孔隙引發(fā)鉀離子外流，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5-6］。其特殊的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制，減少了與其他抗生素產(chǎn)生交叉耐藥的概率，因此在臨床上具有較高的應(yīng)用價(jià)值，是治療多重耐藥革蘭陽性細(xì)菌引起的重癥感染的高端微生物藥物。

然而，達(dá)托霉素生產(chǎn)菌發(fā)酵水平一直比較低，生產(chǎn)成本高，同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物存在多種同系物雜質(zhì)影響藥品質(zhì)量。Baltz 等［2］對達(dá)托霉素生物合成相關(guān)機(jī)制［圖1（b）］進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對其合成途徑及調(diào)控通路的認(rèn)識也逐然清晰。本文較為全面地總結(jié)了國內(nèi)外有關(guān)達(dá)托霉素合成過程的調(diào)控機(jī)制研究，包括調(diào)控蛋白的挖掘、級聯(lián)調(diào)控途徑、脂酰前體合成途徑調(diào)控、GBL 信號途徑與磷酸雙組分系統(tǒng)協(xié)同調(diào)控機(jī)制等，揭示了次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，并闡述了通過調(diào)控途徑重構(gòu)達(dá)托霉素調(diào)控通路實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)菌優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的策略。

1 鏈霉菌次級代謝調(diào)控因子的挖掘

圖2 體內(nèi)隨機(jī)轉(zhuǎn)座與體外親和純化的調(diào)控元件篩選技術(shù)Fig.2 Workflow for identification of regulatory elements by random transposition and affinity purification

原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子大約有50 余種［7］，分為初級代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和次級代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。鏈霉菌次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是微生物藥物合成過程的管理系統(tǒng)［8］，由全局調(diào)控、多效調(diào)控、途徑特異性調(diào)控等蛋白組成，全局調(diào)控和特異性調(diào)控蛋白往往已知，因此挖掘多效調(diào)控因子是解析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵。

Luo 等［9］構(gòu)建了卡那霉素抗性報(bào)告系統(tǒng)結(jié)合Himar1 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組隨機(jī)突變篩選調(diào)控蛋白技術(shù)，同時(shí)建立了利用啟動(dòng)子DNA與調(diào)控蛋白互作釣取多個(gè)調(diào)控蛋白的體外親和純化技術(shù)（圖2）；以達(dá)托霉素合成基因簇唯一啟動(dòng)子dptEp為誘餌，利用體外親和純化和轉(zhuǎn)座突變技術(shù)，篩選和鑒定到 調(diào) 控 蛋 白 PhaR （MerR 家 族 ）［9］、 AtrA［10］、DepR1（TetR家族）［11］和DepR2（ArsR）家族［12］。

TetR 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是最常見的原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，其名來源于四環(huán)素抗性阻遏蛋白（Tet repressor，TetR），一般參與抗生素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及環(huán)境應(yīng)答等過程［13-16］。TetR 家族蛋白通?？膳c自身啟動(dòng)子結(jié)合，且結(jié)合位點(diǎn)具有高度序列相似性［15］。Yuan 等［11］研究發(fā)現(xiàn)敲除depR1完全不生產(chǎn)達(dá)托霉素，而depR1高表達(dá)菌株達(dá)托霉素產(chǎn)量高于野生型；depR1在玫瑰孢鏈霉菌形態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，depR1敲除株出現(xiàn)孢子缺陷型，回補(bǔ)菌株孢子形態(tài)恢復(fù)正常，depR1高表達(dá)菌株形態(tài)發(fā)育較野生型提前。

大多數(shù)原核生物AsrR 蛋白家族調(diào)控因子的主要功能是感應(yīng)環(huán)境中金屬離子濃度和細(xì)菌致病 性［17-18］。 Mao 等［12］發(fā)現(xiàn) DepR2 可以 與dptEp直接結(jié)合，并通過直接抑制達(dá)托霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄從而負(fù)調(diào)控達(dá)托霉素的合成；depR2缺失突變株的達(dá)托霉素發(fā)酵水平顯著增加，特別是發(fā)酵4 d 時(shí)，depR2缺失株的達(dá)托霉素發(fā)酵水平達(dá)到50.8 mg/L，比野生型高2.5 倍；depR2回補(bǔ)菌株發(fā)酵水平和野生型相近，同時(shí)該基因簇合成的3 種同系物A21978C1-3在depR2缺失株的發(fā)酵水平均遠(yuǎn)高于野生型［19］。

MerR 家族調(diào)控因子一般參與環(huán)境因子應(yīng)答、重金屬脅迫以及抗生素合成［20-22］。Luo 等［9］通過CRⅠSPR/Cas9 構(gòu)建phaR缺失菌株，發(fā)現(xiàn)PhaR蛋白直接負(fù)調(diào)控達(dá)托霉素生物合成途徑，缺失株中dptE的轉(zhuǎn)錄水平較野生型提升了2.68 倍。研究發(fā)現(xiàn)phaR也具有自身正調(diào)控功能，對形態(tài)發(fā)育的試驗(yàn)表明，phaR缺失菌株在平板上的菌絲形態(tài)發(fā)育較野生型及回補(bǔ)菌株有明顯的延遲。由此可見，PhaR 是一個(gè)多效調(diào)控因子。

2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

鏈霉菌次級代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要參與調(diào)控簇內(nèi)途徑特異性調(diào)控基因或直接調(diào)控合成基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而調(diào)控生產(chǎn)菌的形態(tài)分化和藥物的生物合成［7］。玫瑰孢鏈霉菌中達(dá)托霉素合成基因簇附近發(fā)現(xiàn)了編碼3 個(gè)不同家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子dptR1、dptR2、dptR3，它們分別編碼LuxR、DeoR、MarR 家族蛋白，并推測可能參與達(dá)托霉素生物合成的途徑特異性調(diào)控［23］。

Jin 等［24］通過同源重組方式對dptR1進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)dptR1對達(dá)托霉素的合成沒有太大影響。dptR2編碼的調(diào)控蛋白屬于DeoR 家族，大多數(shù)DeoR 家族調(diào)控形態(tài)發(fā)育和抗生素生物合成［25-27］。Wang 等［28］發(fā)現(xiàn)dptR2缺失突變株不產(chǎn)達(dá)托霉素，但未發(fā)現(xiàn)調(diào)控靶點(diǎn)。但是DptR2 可以直接正調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄；推測DptR2調(diào)控達(dá)托霉素合成的方式可能是通過影響葡萄糖的代謝過程，從而調(diào)控達(dá)托霉素合成的氨基酸前體供應(yīng)。

dptR3是一個(gè)屬于MarR 家族的多效調(diào)控基因，該家族調(diào)控因子大多數(shù)參與耐藥性、應(yīng)激反應(yīng)、毒性以及芳香族化合物分解代謝，且其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)一般都具有回文序列［29-31］。迄今為止，細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)超過 12 000 種類似 MarR 家族的蛋白［28］，但在鏈霉菌中只有少數(shù)被報(bào)道［32-33］。Zhang 等［34］研究發(fā)現(xiàn)dptR3不能與達(dá)托霉素合成基因簇上的啟動(dòng)子結(jié)合，缺失株達(dá)托霉素產(chǎn)量降低，并出現(xiàn)氣生菌絲生長、孢子成熟延遲的表型；DptR3 直接正調(diào)控自身轉(zhuǎn)錄并間接正調(diào)控達(dá)托霉素的生物合成，同時(shí)直接負(fù)調(diào)控與其轉(zhuǎn)錄方向相反的上游基因dptR16（編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié)合蛋白）；進(jìn)一步研究表明，DptR3 的主要靶基因dptR16對達(dá)托霉素的生物合成有積極的正效應(yīng)。

放線菌中存在兩類特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，分別是 SARP 和 WhiB 家族［7］，其中 WhiB 家族的調(diào)控因子與鏈霉菌形態(tài)分化與抗生素合成相關(guān)［35］。Huang 等［36］發(fā)現(xiàn) WhiB 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 WblA是一個(gè)多效調(diào)控因子，wblA缺失株孢子發(fā)育被阻斷，同時(shí)達(dá)托霉素產(chǎn)量有51%的提升，且關(guān)鍵合成酶dptE及關(guān)鍵調(diào)控基因atrA、dptR2和dptR3的表達(dá)量均顯著上升；但沒有直接證據(jù)表明WblA 可直接調(diào)控上述基因表達(dá)，推測WblA可能通過參與其他細(xì)胞進(jìn)程影響達(dá)托霉素生物合成相關(guān)通路。

3 GBL 信號級聯(lián)調(diào)控通路

γ-丁酮內(nèi)酯（γ-butyrolactone）［37］是一種鏈霉菌中普遍存在的信號分子，參與調(diào)控以抗生素為代表的次級代謝產(chǎn)物生物合成與細(xì)菌形態(tài)發(fā)育，可分為A 因子（A-factor）型、維基尼丁烯羥酸內(nèi)酯（virginiae butanolide，ⅤB）型和ⅠM-2型等三類［38-40］，統(tǒng)稱為GBL 信號分子?；疑溍咕腁 因子信號調(diào)控途徑研究比較清晰，Ohnishi 等［41］發(fā)現(xiàn)其在鏈霉菌形態(tài)分化及次級代謝調(diào)控中均扮演著重要角色。菌體生長階段，A因子濃度低，A 因子信號受體蛋白ArpA 結(jié)合于中心調(diào)控蛋白AdpA 的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄發(fā)生；當(dāng)菌體達(dá)到一定密度，A 因子大量積累，與ArpA 蛋白結(jié)合并使后者從啟動(dòng)子區(qū)釋放，解除對adpA基因的阻遏作用，AdpA 的大量翻譯推動(dòng)了次級代謝過程的啟動(dòng)。

玫瑰孢鏈霉菌中，A 因子信號通路參與調(diào)控達(dá)托霉素的合成和形態(tài)分化過程。敲除受體蛋白基因arpA，達(dá)托霉素產(chǎn)量比野生型提高了2.5倍，且菌絲發(fā)育提前；敲除adpA的突變株不再產(chǎn)生達(dá)托霉素及色素，且菌絲發(fā)育不全，不再產(chǎn)生孢子。Mao 等［10］通過轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變篩選得A 因子通路調(diào)控的下游受體蛋白AtrA，其受AdpA 激活轉(zhuǎn)錄并被自身蛋白反饋調(diào)控，且AtrA參與正調(diào)控下游達(dá)托霉素合成基因簇轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，對達(dá)托霉素合成有正調(diào)控作用。綜合上述研究結(jié)果，Mao 等［10］提出了玫瑰孢鏈霉菌達(dá)托霉素生物合成的級聯(lián)調(diào)控模式（圖3）。

圖3 達(dá)托霉素A因子級聯(lián)調(diào)控通路Fig.3 The model of the regulation of A-factor regulatory cascade on daptomycin biosynthesis

4 磷酸雙組分系統(tǒng)

鏈霉菌中，雙組分系統(tǒng)是一類十分重要的全局調(diào)控系統(tǒng)［42］，一般包括激酶和應(yīng)答調(diào)控蛋白，前者接受各種環(huán)境信號后激活后者，后者將信號傳遞到下游受調(diào)控基因，比較典型的雙組分系統(tǒng)有 PhoR-PhoP［43］、AbsA1-AbsA2［44］、AfsQ1-AfsQ2［45］、AfsK-AfsR［46］。玫瑰孢鏈霉菌中，磷酸雙組分系統(tǒng)PhoR-PhoP 能夠感應(yīng)環(huán)境中磷酸鹽濃度，通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)傳遞信號最終影響達(dá)托霉素合成［47］。Zheng 等［48］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)磷酸雙組分系統(tǒng)與A 因子信號途徑存在交互調(diào)控（圖4），PhoP 與AdpA 均能與atrA啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，從而產(chǎn)生競爭效應(yīng)。低磷酸鹽濃度下，PhoRPhoP 被激活并發(fā)揮主要作用，從而提高下游受調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而提高達(dá)托霉素產(chǎn)量；高濃度下該系統(tǒng)則受到抑制。由此提出了A 因子級聯(lián)調(diào)控通路與磷酸雙組分系統(tǒng)交叉調(diào)控的模型。由于磷營養(yǎng)代謝關(guān)聯(lián)了微生物發(fā)酵過程的碳源和氮源的營養(yǎng)代謝，因此通過應(yīng)答磷酸雙組分系統(tǒng)和A 因子級聯(lián)調(diào)控通路，可進(jìn)行針對性的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件優(yōu)化，從而克服傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝優(yōu)化的盲目性。

圖4 GBL信號通路與磷酸雙組分系統(tǒng)交叉調(diào)控模型Fig.4 Crosstalk of A-factor regulatory cascade and twocomponent system PhoRP

5 脂酰前體合成途徑

達(dá)托霉素合成過程中脂酰基前體的結(jié)構(gòu)多樣性是產(chǎn)生同系物雜質(zhì)的根源，達(dá)托霉素合成起始于一個(gè)脂?；D(zhuǎn)移蛋白，而脂?；鶄?cè)鏈不同則導(dǎo)致非目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生［19］。達(dá)托霉素的同系物A21978C1-3合成前體均來自支鏈脂肪酸，其產(chǎn)量遠(yuǎn)超達(dá)托霉素［49］，嚴(yán)重影響了目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)量。

研究表明，bkdR是支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合體（BCDH complex）的合成基因簇bkdA1B1C1的簇內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子，其對自身有負(fù)調(diào)控作用，且加入達(dá)托霉素可以特異性消除BkdR 對自身啟動(dòng)子的結(jié)合，從而消除該反饋?zhàn)饔?。Luo 等［50］研究發(fā)現(xiàn)，敲除bkdR不僅會(huì)消除同系物A21978C1-3，同時(shí)達(dá)托霉素也會(huì)消失，回補(bǔ)菌株產(chǎn)量部分回復(fù)，而高表達(dá)菌株則不會(huì)表現(xiàn)出高產(chǎn)；bkdR缺失株同時(shí)表現(xiàn)出氣生菌絲發(fā)育提前與色素產(chǎn)生滯后現(xiàn)象，BkdR蛋白可響應(yīng)氨基酸代謝、孢子形態(tài)發(fā)育以及菌絲的形態(tài)分化［51］，說明bkdR是一個(gè)全局調(diào)控因子（圖5）。因此，解析脂酰前體支鏈脂肪酸合成途徑，可對同系物合成途徑進(jìn)行定向改造，有助于達(dá)托霉素的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和后續(xù)純化。

圖5 BkdR對支鏈脂肪酸合成通路的調(diào)控模型Fig.5 Regulatory of BkdR on the production of branchedchain fatty acid

6 總結(jié)與應(yīng)用

微生物藥物的生物合成不僅受控于全局調(diào)控、多效調(diào)控、途徑特異性調(diào)控等組成的復(fù)雜次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［8］，也受控于糖代謝、脂肪酸合成、氨基酸合成等初級代謝相關(guān)通路交互網(wǎng)絡(luò)。在達(dá)托霉素的生物合成過程中，我們得以一窺微生物次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的冰山一角，其中不僅有磷酸雙組分與A 因子信號途徑的交叉調(diào)控作用，也有其他多效調(diào)控因子的級聯(lián)調(diào)控，還包括脂酰基前體相關(guān)合成途徑的簇內(nèi)調(diào)控，整個(gè)系統(tǒng)在微生物體內(nèi)和諧有序運(yùn)行。通過剖析復(fù)雜的次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以明晰生產(chǎn)菌遺傳改造的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為藥物高產(chǎn)改造策略提供切入點(diǎn)。同時(shí)，針對調(diào)控途徑的關(guān)鍵蛋白對發(fā)酵環(huán)境的響應(yīng)，可精準(zhǔn)地進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，從而克服傳統(tǒng)工藝研究的盲目性。

基于上述機(jī)制研究，浙江大學(xué)李永泉課題組通過組合敲除arpA、phaR、depR2和高表達(dá)depR1、重構(gòu)A 因子級聯(lián)調(diào)控通路ArpA-AdpAAtrA，獲得的高產(chǎn)菌50 L 罐發(fā)酵水平達(dá)0.93 g/L；通過調(diào)控脂酰前體合成途徑，敲除其基因簇bkdA1B1C1，消除了同系物雜質(zhì)A21978C1-3合成；基于合成生物體系對環(huán)境應(yīng)答構(gòu)建了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)發(fā)酵工藝，結(jié)合流加補(bǔ)料癸酸，達(dá)托霉素10 t罐發(fā)酵水平達(dá)2.23 g/L，并在杭州中美華東制藥有限公司實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，該公司是國內(nèi)首家獲批新藥證書的支撐企業(yè)，填補(bǔ)了我國重癥感染臨床用藥的空白，阻礙了國際原研美國Cubist制藥公司進(jìn)軍我國臨床用藥市場。

7 展 望

抗生素的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)是一個(gè)系統(tǒng)性工程，不僅要考慮到菌種本身的遺傳改造水平，也應(yīng)關(guān)注環(huán)境因子的相關(guān)作用，以及發(fā)酵過程中的碳/氮源比例及成本。本文總結(jié)的一部分，不過是微生物來源的抗生素工業(yè)化優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)過程中的一小部分工作，后續(xù)工作路阻且長。畢竟從實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)工廠，是夢想照進(jìn)現(xiàn)實(shí)的過程，中間的每一步，都需縝密的思考及不懈的努力。

本文聚焦于達(dá)托霉素生物合成過程的調(diào)控機(jī)制研究，從多個(gè)層次的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、級聯(lián)調(diào)控通路、多信號途徑的協(xié)同調(diào)控，探究達(dá)托霉素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。同時(shí)通過解析同系物雜質(zhì)合成調(diào)控機(jī)制，消減旁路代謝產(chǎn)物以減少雜質(zhì)合成，解除達(dá)托霉素合成的關(guān)鍵限制因素，為實(shí)現(xiàn)達(dá)托霉素高效生物合成提供理論依據(jù)。

縱觀已有達(dá)托霉素相關(guān)調(diào)控研究報(bào)道，主要集中于基因轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)制研究，著眼點(diǎn)在于次級代謝的信號通路的關(guān)鍵基因。但真正發(fā)揮調(diào)控作用的是調(diào)控通路，如玫瑰孢鏈霉菌初級代謝過程不到50 h，而其達(dá)托霉素的生物合成過程歷時(shí)200 h 左右，正是調(diào)控通路支撐了如此漫長的次級代謝生物合成過程。在如此漫長的發(fā)酵過程中，不管是單個(gè)鏈霉菌還是整個(gè)種群，其生長形態(tài)及代謝水平均有著顯著的差異，遠(yuǎn)非某一個(gè)基因或某一條調(diào)控通路的表達(dá)水平的改變所能解釋。生命是動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的，而抗生素的合成只不過是細(xì)菌代謝過程中的一個(gè)重要的副產(chǎn)物。因此，我們不僅要關(guān)注基因轉(zhuǎn)錄水平，更需對關(guān)鍵蛋白全生命過程進(jìn)行追蹤分析，揭示其時(shí)序調(diào)控機(jī)制。

另外，以往的很多研究表明，很多關(guān)鍵基因的遺傳改造往往牽一發(fā)而動(dòng)全身，并且很多高產(chǎn)改造也往往得不到更佳的改造效果。這是因?yàn)榧?xì)菌的生理代謝進(jìn)程如同一個(gè)黑盒子，我們無法看到其中的關(guān)聯(lián)性與復(fù)雜度，很容易顧此失彼。隨著科技的不斷發(fā)展，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，我們得以從更加微觀的空間尺度及更加細(xì)密的時(shí)間尺度上一窺細(xì)胞中正在發(fā)生的生理進(jìn)程，這有助于我們擺脫傳統(tǒng)研究中盲人摸象的困境，從而更好地進(jìn)行創(chuàng)新和改革。

因此，對調(diào)控通路中關(guān)鍵調(diào)控蛋白的魯棒性需要進(jìn)一步探究，包括調(diào)控蛋白的修飾與降解機(jī)制，以及從動(dòng)力學(xué)角度對級聯(lián)調(diào)控通路進(jìn)行解剖。從基因轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)向蛋白水平，是放線菌次級代謝調(diào)控領(lǐng)域研究全新的角度，這樣才能更加深入理解達(dá)托霉素生物合成過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性。在前期的研究基礎(chǔ)之上，借助大數(shù)據(jù)的挖掘，構(gòu)建一個(gè)囊括整個(gè)次級代謝通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實(shí)時(shí)跟蹤每個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白的表達(dá)水平，從而最終形成一個(gè)從基因轉(zhuǎn)錄到次級代謝生物合成的動(dòng)態(tài)蛋白組學(xué)圖譜網(wǎng)絡(luò)，由點(diǎn)及面，深入直觀地體現(xiàn)放線菌中復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的生理代謝進(jìn)程，通過計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行輔助模擬設(shè)計(jì)，挖掘隱藏的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，探索最佳組合策略，從而為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)改造提供更為精準(zhǔn)的工具。