噬菌體合成生物學研究進展和應用

袁盛建，馬迎飛

（1 中國科學院深圳先進技術研究院，深圳合成生物學創(chuàng)新研究院，中國科學院定量工程生物學重點實驗室，廣東省合成基因組學重點實驗室，深圳市合成基因組學重點實驗室，廣東 深圳 518055； 2 中國科學院大學，北京 100049）

噬菌體（bacteriophage， phage）是專一感染細菌、古菌和藻類等微生物的病毒的總稱，在土壤、河水、空氣或生物體內(nèi)都廣泛存在。噬菌體于1915—1917 年被發(fā)現(xiàn)［1］，一個多世紀以來，由于噬菌體基因組較?。?～735 kb，中值約為50 kb［2-3］）、繁殖速度快和易于遺傳操作，噬菌體研究一直在推進生物學許多領域的發(fā)展，例如遺傳學、分子生物學和合成生物學。

遺傳學方面，科研工作者們利用噬菌體證實了DNA 是遺傳物質(zhì)［4］，并確定了三聯(lián)體密碼子［5］；分子生物學方面，噬菌體為科學家提供了許多分子生物學工具酶，如DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶等［6］，現(xiàn)在全球各地實驗室還都在使用著噬菌體來源或者噬菌體相關的工具酶。

噬菌體研究對合成生物學領域也有重要貢獻。第1個被測序的基因組就是φX174噬菌體，2003年這個噬菌體全基因組又被Ⅴenter 等［7］從頭合成并拯救成為有活性的噬菌體顆粒；也正是在研究細菌如何防御噬菌體的過程中，使得科學家發(fā)現(xiàn)了CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)［8］，該發(fā)現(xiàn)獲得 2020 年諾貝爾化學獎，并且正在推動一場重大的生物技術革命［9］；噬菌體在基因元件開發(fā)方面具有很大潛力，許多噬菌體衍生的基因元件已被改編用于構建基因電路。同時，噬菌體在生物圈的數(shù)量非常多，達到1031數(shù)量級［10］，而且進化出多種方式接管宿主細胞的資源來產(chǎn)生更多的噬菌體后代。因此，對于噬菌體的基因多樣性和功能多樣性的研究將為合成生物學研究提供極其豐富的基因元件庫。

盡管如此，我們對于噬菌體的認識還極其缺乏。比如：對于自然界中絕大多數(shù)噬菌體和宿主的關系及其在自然生態(tài)系統(tǒng)中的作用還不清楚。

采用合成生物學方法和思路理性設計、合成人工噬菌體，可以加強、改變或利用噬菌體某方面的特性，有望幫助我們回答噬菌體基礎研究和應用研究中一些普遍存在的問題［11-13］。通過在噬菌體基因組上添加功能基因（如抗菌肽和莢膜解聚酶基因）可增強噬菌體的侵染效率；盡可能去除毒力蛋白基因和未知功能的基因，甚至設計出底盤噬菌體基因組，以達到生物安全性高度可控的目的；在噬菌體基因組上添加抗細菌抗性的基因元件，解決細菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的問題［14］；噬菌體可搭載各種基因線路，用于改造細菌群落，敲除菌群中特定基因；人工改造噬菌體尾部蛋白基因，替換或拓展宿主譜［15］；溫和噬菌體改造為烈性噬菌體策略的開發(fā)，可以豐富噬菌體資源庫。同時，噬菌體強大的定向進化平臺、噬菌體展示技術、噬菌體DNA載體等功能也正在蓬勃發(fā)展。

高通量測序技術、DNA 大片段合成技術和合成生物學等方面的發(fā)展使科研工作者能夠合成出第一個最小基因組細菌（支原體）［16］。這些用于合成細菌基因組的新策略和方法，可以加速噬菌體基因組設計構建的能力，更深入挖掘噬菌體各方面的潛力。本文作者討論了噬菌體合成生物學研究最新進展、潛在的方向、如何應用合成生物學產(chǎn)生具有特定功能的噬菌體以及人工噬菌體的各種用途（圖1）。

1 噬菌體合成生物學研究方向

1.1 提高噬菌體侵染效率

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）是專性的細胞內(nèi)寄生病原體，因此細胞外環(huán)境中的噬菌體無法進入細胞內(nèi)對其進行攻擊。Bhattarai 等［17］為了抑制沙眼衣原體，將噬菌體人工改造使其能被真核細胞內(nèi)吞。在M13 噬菌體衣殼上融合兩個不同的功能肽：整合素結(jié)合肽（RGD）和沙眼衣原體部分膜蛋白肽段（PmpD），RGD 誘導細胞的內(nèi)吞作用，使噬菌體進入真核細胞，PmpD 能中斷沙眼衣原體的感染和增殖。用改造后的噬菌體預防或治療HeLa 細胞的衣原體感染，熒光顯微鏡檢查結(jié)果顯示改造噬菌體能明顯抑制沙眼衣原體的生長［17］。因此，改造噬菌體可用于有效防控沙眼衣原體或其他胞內(nèi)病原體。

生物膜（biofilm）通常與持續(xù)的慢性細菌感染有關，由各種生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類和DNA 等組成。生物膜可以限制分子和顆粒的擴散從而保護病原菌不易受到噬菌體和抗生素等抗菌劑的攻擊，是細菌防治中的一個重要阻礙因素，使許多臨床感染難以根治［18］。2007 年，Lu 等［18］在T7 噬菌體上整合生物膜降解基因DspB，改造后的噬菌體清除生物膜的效率比野生型強約3倍，能夠減少4～5 個數(shù)量級的生物膜細菌［圖1（a）］。這類研究還可以擴展到其他類似研究之中，例如在噬菌體上添加蛋白質(zhì)表面活性劑、抗菌肽和莢膜解聚酶［19-20］等。

淀粉歐文菌（Erwinia amylovora）是一種常見的植物病原體，其會產(chǎn)生莢膜以對抗噬菌體的侵染，因此很少有噬菌體能有效預防或治療淀粉歐文菌感染。將歐文菌噬菌體L1 的莢膜解聚酶基因dpoL1-C 克隆到噬菌體Y2 的基因組中，改造后的Y2 噬菌體能產(chǎn)生更大、更清晰的噬菌斑。盡管每個被感染細胞產(chǎn)生的噬菌體數(shù)量變少了，但是經(jīng)過改造的噬菌體能更有效地殺死歐文菌，與野生型相比，改造的噬菌體能減少歐文菌約3 個數(shù)量級［13］。噬菌體治療在花卉細菌感染中也得到了類似的結(jié)果，說明表達解聚酶可以幫助噬菌體更好地發(fā)揮作用［13］。

圖1 噬菌體合成生物學的應用［15，18，28］Fig.1 Application of synthetic phages［15，18，28］

絲狀噬菌體M13 通常被用作DNA 線路載體，以便將DNA轉(zhuǎn)導給細菌，這些類似的噬菌體改造載體被稱為噬菌粒（phagemids）［21-22］。在M13 噬菌粒上搭載小型抗菌肽基因（AMPs）和蛋白毒素基因可以將大腸桿菌的數(shù)量降低4個數(shù)量級，從而將無毒的M13噬菌體改造為有效的殺菌劑。在使用EMG2大腸桿菌作為病原體的腹膜炎感染模型中，該改造的M13可以有效保護小鼠免于死亡［23］。展示了噬菌體作為DNA線路傳遞載體的潛在應用價值。

工程噬菌體表達生物膜降解酶、解聚酶、抗菌肽或其他功能基因的例子表明合成生物學可用于大大改善天然噬菌體的性狀，更能有效對抗細菌感染。

1.2 改變噬菌體宿主范圍

噬菌體侵染細菌的第1個步驟是識別細菌表面的特異性受體，細菌表面受體可能是多糖、蛋白質(zhì)甚至是細胞器，例如菌毛或鞭毛［24］。這些受體是高度可變的，因此大多數(shù)噬菌體僅能侵染特定病原菌種的部分菌株和變體。這種專一性限制了噬菌體在耐藥菌感染防治上的應用?？赡苄枰啥喾N噬菌體組成的雞尾酒制劑來覆蓋足夠的病原菌種類。隨著病原菌種群在噬菌體侵染過程中不斷進化，這些噬菌體雞尾酒制劑需要定期更新?lián)Q代，這可能會給實踐和監(jiān)管帶來挑戰(zhàn)。

有些噬菌體也能夠侵染一種以上的細菌。例如，噬菌體SH7 能同時侵染大腸桿菌、痢疾志賀菌、弗氏志賀菌和傷寒沙門菌［25］，噬菌體Mu能同時侵染大腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、索氏志賀菌和歐文菌［26］。但是，廣宿主范圍噬菌體數(shù)量較少。因而，噬菌體的宿主譜改造具有重要的研究和應用價值。

解決宿主范圍的一種方法是開發(fā)噬菌體基因模塊，對已經(jīng)被批準為安全有效的噬菌體基因模塊進行替換，以擴大噬菌體宿主范圍。2015 年，Ando 等［15］合理替換了T7-like 噬菌體的尾部基因，改變了其宿主范圍［圖1（b）］。在T7-like噬菌體中，宿主范圍主要由gp17編碼的尾部蛋白控制。當把尾部蛋白基因與其他相關噬菌體的類似基因進行替換時，出現(xiàn)了可預測的宿主范圍變化。而序列相對差異較大的克雷伯菌噬菌體，需要將整個尾部（gp11、gp12和gp17）設計成一個模塊，把整個尾部模塊相互替換，讓大腸桿菌的T7 噬菌體能夠侵染克雷伯菌。該方法需要在研究比較透徹的噬菌體（噬菌體已進行測序、分類和結(jié)構基因清晰）之間才能進行，而且結(jié)構差異越大，需要替換的基因可能越多，將急劇增加改造難度。

同樣，Yosef 等［27］建立了篩選替換 T7-like 噬菌體不同尾部蛋白的平臺，從而有效轉(zhuǎn)導DNA 到多種不同的細菌中。具體而言，將來自15 種不同的T7-like 噬菌體對應尾部蛋白基因gp11、gp12和gp17克隆到質(zhì)粒中，同時在這些基因片段兩端添加T7噬菌體基因組的同源DNA 片段，可同源重組至T7 噬菌體基因組上。用T7（缺失尾部蛋白基因）侵染攜帶這些質(zhì)粒的細菌時，質(zhì)粒表達的尾部蛋白可能組裝至T7 噬菌體頭部顆粒上，同時尾部蛋白基因也可同源重組至T7 噬菌體基因組，對子代噬菌體進行DNA 轉(zhuǎn)導測試，成功的轉(zhuǎn)導表明該質(zhì)粒編碼的噬菌體尾部蛋白可以組裝至T7 噬菌體顆粒上。同時，對成功替換尾部的質(zhì)粒進行誘變形成突變庫，可以篩選出更高轉(zhuǎn)導效率的噬菌體。這種方法能比較高效率擴展噬菌體轉(zhuǎn)導DNA的宿主譜。

T3 噬菌體通過尾絲蛋白上的4 個不同區(qū)域結(jié)合其宿主受體脂多糖（LPSs），進而侵染細菌，當把T3 噬菌體用于抑制宿主菌時，細菌的LPS 合成途徑基因能夠快速產(chǎn)生突變，導致LPSs 縮短，進而使細菌產(chǎn)生抗噬菌體抗性。2019 年，美國麻省理工學院團隊［28］通過對這4 個DNA 區(qū)域設計隨機簡并引物［圖1（d）］，并整合至噬菌體尾絲蛋白基因上，從而產(chǎn)生出了一個多樣性非常大的突變噬菌體庫（105～107）。用這個突變噬菌體庫，可以侵染耐受細菌，并且可以侵染進一步產(chǎn)生噬菌體抗性的細菌，而且這些策略也可以產(chǎn)生能夠感染新宿主的噬菌體。開發(fā)高通量方法來調(diào)節(jié)噬菌體宿主范圍對于噬菌體檢測與治療具有非常重要的應用價值。

1.3 溫和噬菌體的改造

噬菌體按生活周期分為溫和噬菌體（lysogenic）和烈性噬菌體（lytic），烈性噬菌體能在宿主菌體內(nèi)擴增并裂解細菌而使細菌死亡，而溫和噬菌體的主要存在方式是將自身的基因組整合至宿主菌基因組中，隨細菌基因組的復制而進行復制。前噬菌體所攜帶的大部分基因受到噬菌體本身表達的阻遏蛋白（repressor）的阻遏作用而不能表達，只在某些理化因素的影響下，阻遏物失活而進入裂解周期。

溫和噬菌體通常應避免直接用于治療用途，因為它們可能會把自身基因組整合至宿主菌內(nèi)，從而可能會把一些毒力基因整合至宿主菌中，并且使目標菌株免疫其他噬菌體的侵染［29］。但是，某些細菌尤其厭氧菌似乎很難分離到嚴格烈性的噬菌體［30］。另一方面，隨著宏基因組測序和生物信息學的飛速發(fā)展，科研工作者們發(fā)現(xiàn)溶原性細菌是廣泛存在的。細菌染色體中普遍存在溫和噬菌體基因組：目前已在約40%～50%的微生物基因組中鑒定到了溫和噬菌體［31-32］。

合成生物學的最新進展，使得科研工作者們開發(fā)出把溫和噬菌體轉(zhuǎn)變?yōu)榱倚允删w的策略［33-34］，或者利用溫和噬菌體攜帶基因線路，從而干擾細胞內(nèi)的重要生命過程導致死亡［35］或使細菌對抗生素重新敏感［36］。

CRⅠSPR、BRED（bacteriophage recombineering with eletroporated DNA）等技術可用于改造溫和噬菌體將其轉(zhuǎn)化為可用于治療的烈性噬菌體。比如完全刪除其阻遏進入裂解周期的阻遏蛋白基因［37］，去除毒力因子和整合酶等。2019 年，Spencer 團隊［38］改造了1 株分枝桿菌噬菌體ZoeJ，刪除了ZoeJ 噬菌體進入溶原周期的基因gp45，使其殺菌能力明顯增強，研究人員給患者靜脈注射由這株改造噬菌體和其他2 株噬菌體組成的雞尾酒制劑，經(jīng)過6 個月治療后，患者的臨床癥狀明顯有所改善，并且沒有產(chǎn)生其他副作用。Kilcher 等［33］構建了李斯特菌（Listeria monocytogenes）噬菌體P335的一株缺失主要裂解阻遏物的突變體，并通過表達另外一種不同的溶菌酶，提高了噬菌體的裂解活性。產(chǎn)生的改造噬菌體能有效殺滅單核細胞增生李斯特菌，并且能夠抑制細菌抗性的產(chǎn)生。

1.4 工程溶菌酶用于殺死細菌

噬菌體蛋白除了用作生物技術工具外，還可以作為治療用途。噬菌體的溶菌酶（lysins）是一種高度進化的蛋白，能夠特異性降解細菌細胞壁肽聚糖，從而使細胞裂解。溶菌酶目前已成功用于多種動物模型中，以控制在血液、感染組織和黏膜表面等發(fā)現(xiàn)的致病性超級耐藥菌。相對抗生素而言，溶菌酶的優(yōu)點是對病原體具有特異性，對正常菌群的影響小，并且具有殺死黏膜表面上定殖病原體的能力［39］。同時，溶菌酶令人激動的地方在于細菌似乎并未對它們產(chǎn)生有效的抗性。純化的溶菌酶對許多革蘭氏陽性細菌具有殺菌作用，因為它們的細胞壁直接暴露在外部而可以直接與溶菌酶接觸［40］，目前成功的例子包括肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）［41-42］、化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）［43-44］、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）［45-47］和 分 枝 桿 菌（Mycobacteria）［48］等。但是，革蘭氏陰性細菌的細胞壁夾在內(nèi)膜和外膜之間，因此大多數(shù)天然溶菌酶無法進入。

現(xiàn)在有不少策略正在解決這個問題。比如Kim等［49］用廣宿主譜噬菌體SS3e的溶菌酶基因表達純化的溶菌酶，能同時抑制沙門菌（Salmonellasp.）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii）、大腸桿菌（E.coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），甚至對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌有一定抑制作用。Briers 等［50］開發(fā)了稱為 Artilysins 的人工合成溶菌酶，該溶菌酶融合了能滲透革蘭氏陰性細菌外膜的肽，能夠被主動轉(zhuǎn)運攝取進入外膜而發(fā)揮作用。Artilysins 對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌都具有殺菌作用，能將細菌數(shù)量降低4～5個數(shù)量級［51］。

溶菌酶的發(fā)展?jié)摿λ坪跏菬o限的。最近已經(jīng)使用生物信息學技術鑒定了數(shù)千種不同的溶菌酶，其中許多具有新穎的蛋白結(jié)構域［52］。新型溶菌酶的鑒定，溶菌酶晶體結(jié)構的解析以及細菌細胞壁結(jié)構的深入研究，將有力推動設計和構建可能針對任何病原體的“量身定制的溶菌酶”的發(fā)展。

1.5 噬菌體展示

噬菌體展示（phage display）是一種強大的、多功能的平臺技術，能在突變庫中篩選出具有優(yōu)良特性的多肽或蛋白［53］。在所有可用的分子展示技術中，噬菌體展示已被證明是最受歡迎的方法。2018 年，噬菌體展示技術相關科學家獲得了諾貝爾化學獎。噬菌體展示技術可以迅速把表型選擇與基因型聯(lián)系起來，比如將多肽與絲狀噬菌體M13 的外殼蛋白pⅠⅠⅠ融合，篩選出所需功能多肽，通過測序就能輕松得到對應多肽的基因型。目前已開發(fā)了T7、T4、Fd 和λ 噬菌體等展示系統(tǒng)，其中一些可用于篩選大型蛋白。

噬菌體展示技術可用于篩選：①B 細胞和T 細胞表面抗原決定簇。噬菌體展示法提供了一種經(jīng)濟、快速的方法來繪制抗原決定簇，目前，已經(jīng)繪制了包括嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒［54］、人乳頭瘤病毒（HPⅤ）［55］和禽流感病毒（AⅠⅤ）［56］等的抗原決定簇；②選擇與受體或蛋白質(zhì)結(jié)合的生物活性肽，疾病特異性抗原類似物，與非蛋白質(zhì)靶標結(jié)合的肽，細胞或器官的特異性肽；③肽介導的藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)和其他應用［57］。

抗體藥物現(xiàn)在變得越來越重要，在不同的抗體發(fā)現(xiàn)方法中，噬菌體展示技術已成為最強大的方法之一［58］。截至2016 年初，通過噬菌體展示發(fā)現(xiàn)或進一步開發(fā)的6 種人類抗體已批準用于治療。2002 年，阿達木單抗（Humira）成為首個獲得市場批準的噬菌體展示衍生抗體，也是首個獲批的人類抗體，并且它是目前市場上最暢銷的抗體藥物。目前，更多噬菌體展示來源的抗體正在進行臨床實驗［59］。可以看出，噬菌體展示技術能促進基礎研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學的發(fā)展。

1.6 噬菌體輔助的持續(xù)進化

噬菌體輔助持續(xù)進化（PACE，phage-assisted continuous evolution）是將噬菌體的生長與蛋白生物學功能的進化聯(lián)系起來，只有蛋白生物功能朝設計目標進化，噬菌體才能擴增，并且通過對成功擴增噬菌體的基因組進行測序來輕松獲取進化序列。該系統(tǒng)還可以通過使用低保真的DNA 聚合酶來提高突變頻率而加速進化。

在Esvelt 等［60］的開創(chuàng)性論文中，選擇的是T7 RNAP（RNA 聚合酶）。為了迫使T7 RNAP 定向進化，將其基因克隆到?jīng)]有外殼蛋白基因pIII的缺陷株M13中。而把pIII基因單獨克隆一個質(zhì)粒上，并用T3 啟動子進行啟動，這樣M13 的產(chǎn)生取決于T7 RNAP 獲得識別T3 啟動子的能力。在這樣的系統(tǒng)中，只有T7 RNAP 基因獲得功能性突變才能產(chǎn)生后代。該系統(tǒng)可以全自動進行，并在不到200 h的進化過程中成功獲得突變的T7 RNAP［60］。通過創(chuàng)造性地設計pIII表達的啟動子以及伴隨的選擇壓力，可以選擇獲得多種功能［61］。例如，PACE被用于進化新的氨基?；鵷RNA合成酶［62］，改變目標基序的蛋白酶［63］、轉(zhuǎn)錄因子［64］，甚至使蘇云金芽孢桿菌δ的突變體進化，降低昆蟲對毒素的抗性［65］。

抗生素生物合成基因簇（BGC，antibiotic biosynthetic gene clusters），長度范圍為15～100 kb，包含抗生素生物合成酶基因、調(diào)節(jié)基因、抗生素輸出基因和自身的耐藥性基因。Johnston 等［66］用PACE來實現(xiàn)BGC對抗生素雙環(huán)霉素（BCM）的生物活性依賴適應，BGC產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物BCM，從而為其生產(chǎn)者帶來競爭優(yōu)勢，促進異源宿主中BCM 的產(chǎn)量提高，推動BGC 的進化。這一研究表明，依賴PACE，可以改善代謝途徑和產(chǎn)品產(chǎn)量。

1.7 噬菌體基因元件的開發(fā)

細胞工廠的設計很大程度上依賴于模塊的正交設計，即各模塊各自執(zhí)行自身的功能，減少模塊之間和底盤細胞原有的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡的干擾，以簡化人工設計的復雜性。噬菌體為合成生物學提供了豐富的正交元件來源，因為它們已經(jīng)進化出許多不同的基因線路來控制相同的基因網(wǎng)絡，以接管宿主細胞的資源來產(chǎn)生噬菌體子代。

對生物體進行編程需要對基因表達進行精確控制。一種常見的策略是通過使用啟動子特異性RNA 聚合酶（RNAP）調(diào)節(jié)mRNA 的產(chǎn)生來執(zhí)行邏輯功能。一些噬菌體自身表達RNAP基因，并且只識別噬菌體本身的啟動子而不能識別宿主菌的啟動子。這些酶中研究最多的是噬菌體T7、SP6和N4［67-68］。而且，許多噬菌體彼此之間的RNAP只識別自身的啟動子，這種特異性使RNAP本質(zhì)上彼此正交。噬菌體RNAP 在很大程度上不依賴宿主，可以在大多數(shù)細胞環(huán)境中起作用，具有應用的普遍性。另外，基因工程可以增加噬菌體RNAP的多樣性。例如，通過替換或突變RNAP的特異性識別模塊來改變T7-like RNAP 識別啟動子的特異性［69-70］。

另外，噬菌體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因元件也被廣泛用于合成生物學中，λ阻遏物CⅠ已參與許多合成生物學應用，例如第1 個振蕩器（oscillator）的設計［71］、切斷開關（kill switch）［72］和脈沖檢測基因線路（pulse-detecting circuit）［73］。這些例子展示了如何通過噬菌體基因元件來實現(xiàn)對基因表達的模塊化和正交控制。

2 噬菌體合成生物學研究技術

2.1 噬菌體基因組編輯技術

噬菌體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了一個多世紀［1］，但大部分噬菌體基因的功能仍然未知。在大腸桿菌T4 噬菌體中，其278 個基因仍有128 個（46%）為未知功能基因［74］。在2016年，Kyrpides課題組［75］從全球各地超過5T 的測序數(shù)據(jù)中，分析了270 多萬條病毒蛋白序列，其中75%功能是未知的。大量的未知功能基因給噬菌體基因組編輯和人工合成設計帶來很大阻礙。噬菌體基因編輯可以鑒定必需基因與非必需基因。

2.1.1 同源重組進行噬菌體編輯

溫和噬菌體可以在細菌中穩(wěn)定地保持，從而可以使用與細菌基因工程相同的方法來修改其基因組，但是烈性噬菌體的基因組由于細胞毒性等無法完整克隆到細菌中以進行后續(xù)的基因操作。

因此，烈性噬菌體基因組通常通過同源重組（等位基因交換）進行編輯，首先，將要編輯的DNA 整合到質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化至宿主細菌，然后用野生型噬菌體侵染該菌株，使噬菌體基因與質(zhì)粒上設計的DNA 片段進行同源重組。然而許多非模式菌的宿主（尤其革蘭氏陽性菌），沒有有效的轉(zhuǎn)化方案。其次重組頻率通常很低，等位基因交換產(chǎn)生重組體的頻率通常不超過1%，分離重組噬菌體工作量巨大［26］。為了增加噬菌體DNA 和重組模板（帶有設計DNA片段和上下游同源臂）之間的重組頻率，一個常用的策略是在宿主菌中高水平表達異源的重組功能蛋白，例如RecE/ RecT-like 蛋白質(zhì)，并通過將噬菌體基因組和重組模板共電轉(zhuǎn)化到重組菌株中來改造噬菌體，這種策略稱為電轉(zhuǎn)化DNA 的噬菌體重組（BRED，bacteriophage recombineering of electroporated DNA）［37］。電轉(zhuǎn)化后，回收細菌細胞，與野生型細菌宿主混合并鋪板。然后通過PCR 篩選平板中的突變噬菌斑。此技術首先由Marinelli 等［37］應用于編輯分枝桿菌噬菌體，并且此后被擴展到其他宿主菌的噬菌體，例如大腸桿菌和腸炎沙門菌［76-77］，BRED 可用于刪除、插入和替換基因，以及在噬菌體基因組中進行點突變。通過使用這種方法，已獲得了較高頻率（10%～15%）的突變噬菌體，但是需要高效率的宿主感受態(tài)細胞。

2.1.2 CRISPR/Cas：突變噬菌體的反篩系統(tǒng)與噬菌體編輯

CRⅠSPR/Cas 是細菌和古細菌在長期的演化過程中出現(xiàn)的一種對抗噬菌體入侵或外源DNA 的適應性免疫防御系統(tǒng)。CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)有兩個主要組成部分：①CRⅠSPR 全稱為成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat），轉(zhuǎn)錄的RNA 用于指導識別外來DNA 序列；②Cas 充當系統(tǒng)的催化核心并負責切割 DNA，導致 DNA 雙鏈斷裂。CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)的作用方式包括3 個主要過程，即CRⅠSPR 適應、RNA 表達和 CRⅠSPR/Cas 干擾［8，78-79］。2020 年諾貝爾化學獎授予了CRⅠSPR/Cas9 的發(fā)現(xiàn)者。由于噬菌體是CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)的天然靶標，因此它們可以被用作突變噬菌體的反篩，消除野生型噬菌體并富集稀有突變體。例如，嗜熱鏈球菌CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)能有效用于嗜熱鏈球菌噬菌體2972 基因組中的點突變、基因缺失和基因替換篩選［80］。同樣，使用 CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)來促進大腸桿菌噬菌體T7突變體的篩選［81］。

結(jié)合CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)和基因重組技術可以有效刪除、插入基因。Martel和Moineau［80］利用嗜熱鏈球菌的 ⅠⅠ-A 型 CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)在嗜熱鏈球菌噬菌體2972基因組中，有效引入了甲基轉(zhuǎn)移酶基因；Lemay 等［82］成 功 地 將 化 膿 性 鏈 球 菌 ⅠⅠ-A 型CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)用于編輯乳酸乳球菌的烈性噬菌體p2的基因組，實現(xiàn)了orf 47的單堿基突變、插入和orf 24、orf 42和orf 49的刪除。Tao 等［74］通過CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)成功對大腸桿菌T4 噬菌體的基因組進行單點和多點突變、插入和缺失，在T4 噬菌體DNA 受糖基化和羥甲基化修飾保護時，編輯效率有所降低。同時，在CRⅠSPR/Cas9核酸酶的選擇壓力下，短至50 bp 的同源臂足以篩選到目標突變體。另外，刪除了T4 噬菌體RNA 連接酶基因rnlB中的294 bp，仍然觀測到了噬菌斑，證明了這種編輯策略可以用于鑒定噬菌體基因必需基因和非必需基因。Shen等［83］應用化膿性鏈球菌的CRⅠSPR/Cas系統(tǒng)在肺炎克雷伯菌噬菌體phiKpS2中，成功刪除了1個啟動子和9個基因。應用短至30～60 bp的同源臂足以引入點突變、移碼突變、基因缺失等，有趣的是，可以刪除holin基因，對phiKpS2擴增影響很小，其中移碼突變可有效評估噬菌體基因是否必需。Schilling 等［84］應用 CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌噬菌體中能高效地插入、刪除或突變基因。除了使用先前表征的 ⅠⅠ-A 型系統(tǒng)外，Hupfeld 等［85］于2007 年已經(jīng)鑒定了李斯特菌的新型CRⅠSPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)隨后被改裝并用于李斯特菌大型烈性噬菌體的基因改造。

以上這些研究無不表明，CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)使得噬菌體基因編輯變得簡單而高效，同時，也可以用于獲得未知功能基因的新信息，快速鑒定噬菌體的必需基因與非必需基因，擴展我們對噬菌體-宿主相互作用的了解［圖2（a）］。

2.2 噬菌體基因組的設計與合成

圖2 噬菌體的合成生物學研究方法總結(jié)Fig.2 The methods for synthetic phages

人工噬菌體基因組的合成，分為4個步驟：設計、構建、拯救與測試（圖2）。設計：去除部分非必需基因，并添加基因元件，或模塊化設計整個噬菌體基因組，把設計的基因組序列拆分成利于合成的100 nt左右的Oligo序列［圖2（a）］；構建：合成Oligo 序列后，利用PCR 儀通過退火與延伸，把Oligo 片段組裝成1 kb 長度的雙鏈，通過酵母重組平臺、PCR 或Gibson 組裝成完整的噬菌體基因組［圖2（b）］；拯救：應用電轉(zhuǎn)化、無細胞表達體系或L型細胞把合成的人工噬菌體基因組拯救成為有活性的噬菌體顆粒［圖2（c）］；測試：通過一步生長曲線和抑菌曲線對人工噬菌體進行初步表征［圖2（d）］。

2.2.1 人工噬菌體基因組的設計

有尾噬菌體（the talled phage，Caudovius）具有較大的基因組，已知的這類噬菌體其基因組大小在16～735 kb，攜帶基因數(shù)量從十幾個至幾百個［3］。有尾噬菌體的核心基因（core gene）包括［86-87］：①結(jié)構蛋白基因模塊，衣殼蛋白基因（capsid）、尾絲蛋白基因（tail fiber）、尾梢蛋白基因（tail sheath）、尾板蛋白基因（base plate）、領蛋白基因（neck）等；②DNA 復制、修復和包裝基因模塊，DNA 聚合酶基因（DNA polymerase）、末端酶基因（terminase）、DNA 連接酶基因（DNA ligase）、DNA 解旋酶基因（DNA helicase）、外切酶基因（exonuclease）等；③基因轉(zhuǎn)錄和翻譯基因模塊，RNA 聚合酶基因（RNA polymerase）、tRNA 等；④其他基因模塊［88-89］。有尾噬菌體基因組的這些特點，使得模塊化設計、合成人工噬菌體成為可能?？紤]到噬菌體基因組的時序性表達，基因模塊化設計時，按照早期、中期和晚期基因順序，同時相應基因的啟動子、核糖體結(jié)合位點（RBS）和終止子等也必須同時進行移動［16］。還可以通過在不同基因功能模塊之間的區(qū)域整合其他功能基因，如生物膜解聚基因等，賦予人工噬菌體新的特性。如在人工噬菌體的基因組中引入PCR-tags 和在非關鍵區(qū)域中引入其他功能性序列如多酶切位點等［90］，可方便后續(xù)的基因測序和其他工程化的處理。

同時，在自然界中，生物體的競爭優(yōu)勢直接取決于其存活和繁衍的能力及進化并持續(xù)進化以適應環(huán)境變化的能力，天然生物系統(tǒng)是自然選擇進化的結(jié)果，而進化可能會導致系統(tǒng)復雜使其難以理解和操縱。Chan 等［90］重新設計了T7 噬菌體的基因組。設計目標是在DNA 序列上分開重疊的基因元件，實現(xiàn)對主要遺傳元件的獨特操作并簡化生物系統(tǒng)。通過酶切酶連方式將12 179 bp 的工程DNA 替換了野生型基因組的左邊11 515 bp，轉(zhuǎn)化至ⅠJ1127細胞中并得到了有活性的噬菌體，所得的嵌合基因組編碼的T7 噬菌體似乎保持了原始噬菌體的關鍵特征，同時更易于建模和操作。初步設計構建的可行性表明，可以對天然生物系統(tǒng)的基因組進行系統(tǒng)的重新設計和構建以服務于科學理解或人類意圖。我們可以根據(jù)已有的知識和理解，優(yōu)化設計噬菌體基因組，人工合成促使噬菌體更快地進化以滿足噬菌體應用的要求。

2.2.2 人工噬菌體基因組的合成

根據(jù)設計的噬菌體基因組序列，在體外合成短的Oligo 片段（100 nt），隨后通過PCR 擴增、Gibson 組裝［91］或者酵母重組平臺［16］進行組裝，形成完整的噬菌體基因組［圖2（b）］。近些年來，人工設計合成大片段噬菌體基因組的技術已經(jīng)成熟，可分為體內(nèi)組裝和體外組裝兩種方式。

體外組裝即通過PCR、酶切酶連、Gibson 組裝和Golden Gate等方法進行噬菌體基因重組組裝，然后轉(zhuǎn)化至宿主菌中進行噬菌體基因組拯救。2003 年，Ⅴenter 課題組［7］人工合成了大腸桿菌的φX174 噬菌體（5386 bp），先通過人工合成42 nt長度Oligo 序列，隨后通過PCR 連接成更長序列并得到其全基因組，環(huán)化后，電轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，拯救出有活性的φX174噬菌體。

Gibson 組裝為一種無縫克隆的方法，通過核酸外切酶，將有重疊序列的DNA 雙鏈消化出黏性末端，通過黏性末端序列互補，使兩條鏈相互連接起來。在DNA 聚合酶的作用下，補全缺口，在連接酶的作用下形成完整的雙鏈。Gibson 組裝在體外進行，50 ℃反應1 h 即可完成多片段的拼接，速度快，操作方便，但是大片段拼接的通量和長度都不如酵母重組平臺高［91］。

一些噬菌體（例如絲狀噬菌體M13 或RNA 噬菌體MS2）的基因組足夠?。ǎ?0 kb），可以在體外輕松進行組裝。但是，大多數(shù)有尾噬菌體的基因組太大（＞20 kb）［2］，在體外操作并不容易，且在細菌體內(nèi)擴增噬菌體基因片段時，可能抑制細菌生長［92］。在國內(nèi)外，已有不少科研工作者對體內(nèi)組裝噬菌體基因組進行了探索。酵母容易攝取外源DNA 及本身擁有強大的同源重組系統(tǒng)，使酵母成為一個高效拼接大片段DNA 的平臺［93］，同時可避免噬菌體基因相關的細胞毒性。

Jaschke等［94］在酵母中從頭合成了φX174 噬菌體5.5 kb長的基因組。他們還重構了基因組，分開重疊基因，調(diào)節(jié)RBS（核糖體結(jié)合位點）和啟動密碼子以簡化噬菌體的基因組成［94］。利用這一原理，Ando 等［15］應用 PCR 方法，把整個 T7-like 噬菌體的基因組片段化，并在每個DNA 片段末端加上30 bp 長的同源臂，轉(zhuǎn)化進入啤酒酵母后，可以重建各種T7-like 噬菌體基因組。同時可以在PCR過程中將各種所需的突變添加到基因組中的任何位置，從而為基因組設計提供了前所未有的靈活性。隨后從酵母中提取合成的噬菌體基因組，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，從而產(chǎn)生突變型噬菌體顆粒［圖2（b）］。

2015 年，Ando 等［15］通過 PCR 和酵母重組系統(tǒng)，把T7 噬菌體的尾部識別基因模塊替換成K11噬菌體相應基因模塊，使大腸桿菌噬菌體能侵染克雷伯菌，人工創(chuàng)造出了新的能侵染克雷伯菌的噬菌體；2017 年，Oldfield 等［95］以酵母重組方法從頭合成了具有較大基因組的單純性皰疹病毒（herpes simplex virus，152 kb）。

這些進展無不表明合成生物學的進步對噬菌體基因組人工合成的巨大推動，使我們從頭設計、從頭合成噬菌體變得可行和簡便。

2.3 噬菌體基因組拯救與功能鑒定

將合成的噬菌體基因組直接化學轉(zhuǎn)化或電轉(zhuǎn)化導入到宿主細胞中進行拯救，需要很高的轉(zhuǎn)化效率，尤其是對于大型噬菌體基因組。盡管針對某些細菌（例如大腸桿菌和銅綠假單胞菌）已經(jīng)設計了高效的轉(zhuǎn)化方案，但是許多其他細菌物種卻極難轉(zhuǎn)化，很難產(chǎn)生有活性的噬菌體顆粒。這成了噬菌體基因組體外合成或基于酵母合成的限制瓶頸。目前，無細胞表達體系和L 型細胞表達［圖2（c）］為該問題提供了潛在的解決方案。

由于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制之間存在巨大差異，革蘭氏陽性菌的噬菌體無法用大腸桿菌機器進行拯救。針對此限制，Kilcher 等［96］使用 L 型細菌作為拯救宿主。L 型細菌是經(jīng)過改造或人工選擇而不含細胞壁的細菌。當存在聚乙二醇時，細胞非常脆弱，但易于攝取外源DNA。使用單核細胞增生性李斯特菌L 型，Kilcher 等［33］拯救了常見感染革蘭氏陽性細菌（如單核細胞增生李斯特菌、枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌）的多種噬菌體。作者還拯救了由Gibson 組裝［91］合成的噬菌體基因組。為了證明這種新的拯救宿主的功能多樣性，還拯救了多個李斯特菌溫和噬菌體的基因組［圖2（c）］。

無細胞表達體系（cell free system）是一種高效、快速的體外合成蛋白手段［97］，即在細胞抽提物的基礎上，加入外源補充成分，如RNA聚合酶、氨基酸、tRNA 等，體外把DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA 并翻譯成蛋白。通過對無細胞表達體系的不斷優(yōu)化，能用于蛋白的高通量表達及體外基因線路的驗證［98］。近幾年，應用大腸桿菌無細胞表達體系，Noireaux 課題組將包括 T7（dsDNA，40 kb）［77］、φX174 （ssDNA， 5.6 kb）［99］和 T4 （dsDNA，169 kb）［100］等在內(nèi)的一系列噬菌體基因組，成功拯救成為有活性的噬菌體顆粒，其中T4 噬菌體顆粒組成來自大約50 個不同基因的1500 多種蛋白質(zhì)。其中頭部涉及24 種蛋白質(zhì)組件，在尾部組件中為22 種，尾絲結(jié)構中為6 種［101］，說明了無細胞表達體系在噬菌體基因組拯救方面應用的潛力。

在未來的工作中，優(yōu)化這兩種方法用于更廣泛的噬菌體基因組拯救，擴展其普適性，將變得非常重要。

人工合成的噬菌體基因組，拯救出有活性的噬菌體顆粒后，主要檢測其一步生長曲線、抑菌曲線及形態(tài)［圖2（d）］，進一步鑒定合成的人工噬菌體的功能。一步生長曲線，即噬菌體一個子代生長的時間和繁殖的數(shù)量。根據(jù)抑菌曲線可以初步判斷噬菌體對宿主菌的抑制能力。利用透射電鏡觀察人工噬菌體的形態(tài)，結(jié)構蛋白模塊替換后，噬菌體形態(tài)也會發(fā)生相應變化。

3 噬菌體合成生物學研究應用

由于噬菌體對宿主具有極高的特異性，因此它們在診斷和治療細菌感染方面有著巨大的醫(yī)學潛力，而我們不斷提高的合成生物學研究能力進一步增強了這種潛力。通過基因工程改造噬菌體可以增加噬菌體的殺菌效率，而且噬菌體作為“致死因子”“靶向藥物”“抗生素輔助劑”或“裂解酶”等的基因載體，可增加殺菌方式的多樣性［92，102］，同時，可以利用噬菌體的精準靶向性實現(xiàn)對菌落調(diào)控。人工噬菌體還被用于疫苗開發(fā)、納米材料等。人工改造噬菌體的優(yōu)勢在于能夠設計各種快速組裝的模塊化組件，可以降低技術開發(fā)成本，提高靈活性，創(chuàng)建新性能的噬菌體以滿足不斷變化的市場需求［103］。

3.1 人工噬菌體用于病原菌感染預防和治療

噬菌體發(fā)現(xiàn)伊始，就被成功用于細菌感染性疾病的治療［104］，抗生素的出現(xiàn)，使噬菌體治療受到阻礙，但是隨著超級耐藥菌的威脅日益嚴重［105］，噬菌體治療又重新受到重視［106-107］。實際上，噬菌體療法在俄羅斯等國家已有近百年的歷史［108］。應用噬菌體預防和治療細菌感染具有獨特的優(yōu)勢［10，109］：①噬菌體具有極高的宿主特異性，識別特定的宿主細菌，對整個菌群的影響比抗生素小很多；②噬菌體能利用宿主菌進行繁殖，擴增自身數(shù)量，效率高；③在成功應用噬菌體治療耐藥菌感染的案例中，還未發(fā)現(xiàn)噬菌體對于人體有明顯的副作用。

噬菌體在預防與治療細菌感染方面，已取得了非凡的成果。已有報道的噬菌體治療成功案例包括口腔、肺部、生殖道、腸道、心臟和皮膚等感染；給藥方式從口服、外敷到靜脈注射、霧化給藥等；目前，多個國家有噬菌體治療案例的發(fā)表，如美國、法國、比利時、英國、德國、荷蘭、意大利、澳大利亞、以色列、波蘭和格魯吉亞［110］，中國也有成功治療案例的報道［111］。

波蘭噬菌體治療中心2008—2010 年期間，對153 例感染了超級耐藥菌的患者進行了噬菌體治療，40%的患者根除了病原菌，獲得了良好的治療效果［112］。2016 年，大學教授 Tom Patterson 在埃及旅游時感染多重耐藥鮑曼不動桿菌而處于昏迷，醫(yī)生束手無策，使用鮑曼不動桿菌的噬菌體雞尾酒制劑進行治療，完全治愈。2019 年，Spencer 團隊［38］給分枝桿菌患者靜脈注射噬菌體雞尾酒制劑，患者的臨床癥狀明顯有所改善，并且沒有產(chǎn)生其他副作用等。

國內(nèi)近幾年也出現(xiàn)了幾例應用噬菌體成功治愈超級耐藥菌感染的患者。

上海噬菌體與耐藥研究所已應用噬菌體治愈了數(shù)位超級細菌感染患者。2018年8月成功治愈了一例多重耐藥肺炎克雷伯菌全尿路感染的患者。2019 年7 月應用非敏感型抗生素-噬菌體聯(lián)用方案（non-active antibiotic and bacteriophage synergism，NABS）成功治愈多重耐藥肺炎克雷伯菌尿路感染。抗生素復方新諾明單獨使用，即使?jié)舛仍俑?，也無法抑制細菌生長，僅使用噬菌體時，抗噬菌體細菌很快出現(xiàn)，但是，高濃度復方新諾明和噬菌體聯(lián)用時，可徹底抑制超級細菌的生長［111］。本文作者團隊和深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科陳懷生團隊、深圳市呼吸疾病研究所黃維團隊共同開展深圳市第1例應用噬菌體治療耐藥鮑曼不動桿菌肺部感染的臨床試驗。采取抗生素和針對耐藥鮑曼不動桿菌的專一性噬菌體聯(lián)合霧化給藥的方式，經(jīng)過連續(xù)兩個星期的治療，成功清除了患者肺部感染的耐藥鮑曼不動桿菌（待發(fā)表）。

目前，噬菌體治療還處于小規(guī)模應用階段，要滿足噬菌體的大規(guī)模實際應用，仍需要解決噬菌體本身的一些限制因素［113-114］：①經(jīng)驗證據(jù)表明，噬菌體是安全的，但是一些研究表明，野生型噬菌體可以參與細菌毒力的進化［115］并引起免疫反應［116］，這使得噬菌體的應用有著不可預知的風險；②細菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的可能性；③噬菌體具有較高的宿主特異性，噬菌體治療必須有一個足夠大的噬菌體庫，才能快速找到相關病原菌的噬菌體用于治療；④噬菌體的最適應用條件，如最佳治療時間、最佳治療劑量、細菌被裂解時的副作用及最佳治療方式等都需要進行系統(tǒng)的研究來確定。⑤為了規(guī)范噬菌體治療方法，必須根據(jù)噬菌體產(chǎn)品的復雜性而更新監(jiān)管策略［117］。合成生物學可以潛在解決這些限制因素，如上文提到的，通過人工改造噬菌體，可以表達生物膜降解蛋白或莢膜解聚酶提高噬菌體的侵染效率，替換或突變尾部蛋白改變噬菌體的宿主范圍等。此外，人工噬菌體可應對細菌對噬菌體抗性［11，118］。細菌快速獲得噬菌體抗性的最常見方式是通過突變、遮蔽噬菌體受體、CRⅠSPR 系統(tǒng)或調(diào)整基因表達［119］?？蓪⑹删w受體設計為病原菌高度保守的或者毒力因子所在的區(qū)域［120］，提高細菌進化的代價。噬菌體與細菌相互對抗，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量抗性系統(tǒng)的對應對抗基因元件，通過在噬菌體基因組中人工整合這些對抗元件，能夠應對細菌相應的噬菌體抗性［圖1（c）］。

噬菌體治療的優(yōu)勢之一是噬菌體在殺死它們目標細菌的同時復制自己。然而，噬菌體不受控制的自我擴增，可能使細菌大量裂解，導致內(nèi)毒素突然釋放而引起相關的副作用［121］。為了解決這個問題，可以將噬菌體設計為非復制性的，僅作為納米注射器將基因線路注入到特定細菌種群中。與噬菌體裂解細菌并產(chǎn)生子代相比，噬菌體預期可以將DNA注入更多種類的細菌中，因為噬菌體要產(chǎn)生子代，不僅要將基因組注入到細菌中，還要能抵抗諸如限制性酶、CRⅠSPR系統(tǒng)和毒素-抗毒素等細菌防御系統(tǒng)［122-123］，從而擴大噬菌體治療范圍。

3.2 合成噬菌體用于病原菌檢測

對病原菌進行快速而有效的檢測，不僅能指導疾病診斷，減少藥物的使用，同時也是感染性疾病預防控制的重點。傳統(tǒng)的病原菌檢測方法建立在對細菌的選擇性培養(yǎng)和標準生化試驗及免疫學試驗之上。過程相當耗時，開發(fā)一種快速有效檢測病原菌的方法具有重大的意義。

由于噬菌體能指數(shù)擴增信號且讀數(shù)簡單（噬菌斑），這使得噬菌體用于細菌診斷成為可能。表達報告基因的人工噬菌體提供了一種更獨特而簡單的方法。常見的報告基因有綠色熒光蛋白基因（gfp）［124］、細菌熒光素酶基因（lux）［125-126］和發(fā)光酶基因（luxAB）［16］等，通過噬菌體的擴增同時引起報告基因的表達，目標菌體可快速通過檢測報告基因的表達而得到檢測。

熒光蛋白基因較小，很容易克隆到噬菌體基因組中。被噬菌體侵染的細菌發(fā)出熒光而被顯微鏡觀察到，而且熒光信號可被細胞分選儀識別。

從分枝桿菌噬菌體TM4 開始，已經(jīng)開發(fā)了幾代具有熒光表達功能的噬菌體，用于檢測結(jié)核分枝桿菌和評估相應的抗生素耐藥譜［127-128］。研究人員在T4 噬菌體基因組上整合綠色熒光蛋白基因（gfp），能在數(shù)小時內(nèi)檢測污水中的大腸桿菌［124］。

盡管如此，由于生物樣品中的天然熒光容易產(chǎn)生背景信號，熒光噬菌體系統(tǒng)信噪比較差。生物發(fā)光是一種通過化學底物的酶促氧化產(chǎn)生光的過程，它不會遭受與自發(fā)熒光有關的背景問題，并且通常比熒光系統(tǒng)更亮。比如熒光素酶是一種生物發(fā)光酶，已被用于各種噬菌體系統(tǒng)中，以檢測廣泛存在的病原菌，其敏感性通常低至單個CFU。目前已有的研發(fā)包括結(jié)核分枝桿菌［129-130］、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）［131］、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）［132］、鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）［133-134］、痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae）［135］、 炭 疽 芽 孢 桿 菌 （Bacillus anthracis）［126，136-137］和 致 病 性 大 腸 桿 菌（Escherichia coliO157：H7）［138］等。

更重要的是，把檢測樣本與合適濃度的抗生素作用后，抗生素殺死藥物敏感菌而耐藥菌則存活下來，然后重組噬菌體即可指示這些活的病原菌的存在，進而檢測出細菌的耐藥性［139］。

應用攜帶報告基因的噬菌體能快速、有效地指示病原菌的存在。該種方法操作簡單，檢測迅速，成本低，然而噬菌體檢測病原菌的報道大都限于實驗室而沒有進入臨床，其主要原因是噬菌體識別病原菌株過于單一，且噬菌體檢測敏感性沒有達到某些樣本（如血液）的檢測閾值［140］。

另外，噬菌體只能在特定的活菌內(nèi)繁殖，具有特異性和避免死菌干擾的特點。然而，當很大一部分細菌種群處于持久休眠狀態(tài)或者病原菌存在防御機制而噬菌體不能正常侵染時，噬菌體檢測有可能產(chǎn)生假陰性。為了避免這種局限性，Schmidt 等［141］利用 P22 和 9NA 噬菌體尾絲蛋白對沙門菌O 抗原的特異性結(jié)合來研發(fā)類似ELⅠSA 的診斷工具，他們將其稱為ELⅠSA-like 尾絲吸附測定（ELⅠTA）。ELⅠTA 可以檢測和區(qū)分 O4、O4、O5 和O9 血清型的沙門菌［141］。通過使用識別不同表面多糖的尾絲蛋白或其他噬菌體蛋白，可以很容易地對其他沙門菌或其他細菌進行檢測［142-143］。

3.3 噬菌體對菌群的調(diào)控

微生物群落（microbial community）遍布我們的整個星球，并在生物圈、農(nóng)業(yè)、生物技術和人類健康中發(fā)揮著至關重要的作用。而我們編輯細菌群落的工具非常有限?？股赝ǔＪ菑V譜的，不僅能殺死有害細菌，也能殺死益生菌。噬菌體具有高度特異性的宿主范圍，因此有望能精準地敲除微生物群落中某個菌株或編輯微生物群落中的特定基因［144］。

Wang 等［145］研究了不同噬菌體組合對番茄青枯雷爾菌感染的生物防治。在單季作物中，利用田間分離的4株噬菌體組合可使青枯病發(fā)病率降低80%。發(fā)病率降低的原因是病原體密度降低，雖然病原菌產(chǎn)生了對噬菌體的抗性，但生長變得緩慢，同時出現(xiàn)了拮抗青枯菌的細菌種類，增加了群落多樣性。另外，噬菌體處理不影響其他的微生物菌群。特定的噬菌體組合有潛力成為控制植物病原細菌的精密工具。

Hsu 等［146］研究了噬菌體對微生物組的動態(tài)影響。小鼠體內(nèi)被明確種屬的人類腸道共生細菌定殖，并通過噬菌體處理，發(fā)現(xiàn)噬菌體捕食不僅直接影響靶細菌，而且還通過菌群間相互作用導致對其他細菌的級聯(lián)效應。代謝組學分析表明，由噬菌體捕食引起的微生物組變化對腸道代謝組有直接影響。

噬菌體M13 的基因組也可以構建包含CRⅠSPR 系統(tǒng)的噬菌粒，以很高的準確性和效率從微生物群中特異性去除抗生素抗性基因或毒力基因［147］。Yosef 等［36］利用 λ 噬菌體傳遞 CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)，并將CRⅠSPR 系統(tǒng)整合至細菌基因組上，這個CRⅠSPR 系統(tǒng)能同時針對抗生素抗性基因和該細菌的烈性噬菌體基因組。CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)一旦被輸送到病原體中，便可以清除耐藥菌體內(nèi)的抗性基因，從而使其再次對抗生素敏感。此外，CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)保護被清除耐藥基因的病原體不受烈性噬菌體侵染，從而可有效減少抗生素耐藥病原體而為抗生素敏感細菌提供生態(tài)位，為醫(yī)院提供了一種潛在的防控超級耐藥菌的生物系統(tǒng)。

噬菌體合成生物學研究的進展，加上噬菌體生態(tài)學的定量表征，將允許對微生物群落進行更復雜的原位操作，使噬菌體精準調(diào)控微生物群落具有治療疾病的潛力。開發(fā)有效的載體平臺，高通量地將非致命性基因線路傳遞給細菌物種，對于微生物組工程將非常有價值，尤其是增加微生物組的特定細菌菌株的代謝能力將非常有用。

3.4 基于噬菌體的藥物遞送

噬菌體衣殼可用于將藥物運輸?shù)教囟ńM織并防止藥物降解。通常使用單鏈RNA 噬菌體MS2，因為它的外殼蛋白在大腸桿菌中表達時能自發(fā)組裝成不含遺傳物質(zhì)的病毒樣顆粒（ⅤLP）。同時MS2 外殼蛋白可以耐受多個位置插入標簽，從而能搭載的有效成分包括藥物、酶、核酸、歸巢肽等，使其能靶向特定動物組織部分以及提高其抗降解能力［148-150］。

噬菌體M13 是另一種常用的藥物遞送載體。Ⅴaks 和 Benhar［151］通過酯鍵將抗生素附著到 M13顆粒表面，使M13 顆粒掛滿氯霉素，而血清酯酶能觸發(fā)其緩慢釋放。當存在葡萄球菌的抗體片段時，這些生物納米顆粒會聚集在病原體附近，并釋放出較大濃度的氯霉素，甚至殺死耐氯霉素的細菌［151］。這種靶向的，噬菌體介導的局部高濃度抗生素的遞送可普遍用于治療其他抗生素耐藥性感染，這種方法使抗生素變得有靶向性，并且大大降低了所需劑量和相關毒性，在臨床上非常有意義。噬菌體顆粒也可用于其他類型的藥物遞送。沙門菌噬菌體P22的衣殼被人工改造攜帶止痛肽齊考諾肽。隨后對所得的ⅤLP 進行化學修飾，以在衣殼表面上連接來自人免疫缺陷病毒Tat 的穿膜肽。經(jīng)過改造的ⅤLP 能夠穿越血腦屏障并在各種動物和人類腦細胞模型中釋放活性肽［152］。通過將Cas9 蛋白融合到噬菌體衣殼蛋白的一個片段上，ⅤLP-Cas9-gRNA 復合體能成為一個具有DNA 導向性的藥物載體［153］。這些例子凸顯了噬菌體在藥物傳遞中的廣泛用途。

3.5 基于噬菌體的疫苗

疫苗開發(fā)的一個重要方面是選擇合適的抗原和佐劑，人體疫苗佐劑容易引起副作用，從注射部位疼痛到肝功能不全等。噬菌體疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，其具有強大的免疫優(yōu)勢，噬菌體的表面結(jié)構規(guī)則、大小合適，使其能同時激活先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)以引發(fā)免疫反應，而且在血清中的半衰期較長［154-155］，因此可以將編碼目的抗原的基因整合到噬菌體基因組中，從而與噬菌體衣殼蛋白融合來展示抗原性蛋白質(zhì)或肽。最近，對絲狀噬菌體f88 進行了工程改造，以展示來自甲型流感病毒的免疫抗原，f88-抗原復合物可以由腸道定植的益生菌大腸桿菌連續(xù)產(chǎn)生。該大腸桿菌菌株經(jīng)過改造后可表達假結(jié)核耶爾森菌invA基因，該基因可促進其與腸黏膜的黏附，使其能夠長期定居，該系統(tǒng)可有效預防甲型流感病毒感染［156］。這種方法的好處包括易于口服不用注射，并且由于益生菌的定植和持續(xù)遞送抗原而不用二次加強接種，這使得該方法非常適合于貧困地區(qū)的疫苗接種。目前，已經(jīng)開發(fā)了用于預防口蹄疫［157］、乙型肝炎［158］、EB 病毒［159］等的噬菌體疫苗。

另外，由于噬菌體已經(jīng)經(jīng)歷了數(shù)億年的選擇過程，因此它們在侵染細菌時傾向于最大可能地擴增自己，可能引起過度免疫刺激。因此，開發(fā)人工噬菌體以控制噬菌體的擴增，對于疫苗載體有著重要意義。受RNA 噬菌體MS2 等的啟發(fā)，Baker 及其同事［160］在計算機上設計了一種完全人工合成的衣殼，并包裝了自己的mRNA。隨后從隨機突變文庫中，選擇出具有更高包裝效率的衣殼，同時能更好地模塊化插入外源片段，從而證實完全合成噬菌體顆粒也能獲得類似的功能。

3.6 噬菌體納米材料

因為易于在噬菌體表面展示具有特定功能的肽，絲狀噬菌體引起材料科學家的極大興趣。例如，篩選噬菌體展示文庫，鑒定出能夠?qū)⒔饘俳Y(jié)晶到絲狀噬菌體上以生產(chǎn)用于生物電子學的納米線的肽［161-162］。

同時，M13 噬菌體外殼蛋白 gpⅤⅠⅠⅠ被修飾以顯示帶負電荷的氨基酸的肽，并且能夠與陽離子金屬（例如鈷和錳）相互作用，從而形成高產(chǎn)量的過度氧化物。這些氧化物形成了LiO2電池電極，與碳電極相比，它們具有更高的循環(huán)壽命和比熱容［163］。

噬菌體M13 也可以通過改造其外殼蛋白而能與碳納米管結(jié)合［164］。M13 pⅤⅠⅠ蛋白第 381 位的天冬酰胺突變?yōu)榫彼崾故删w能選擇性地識別并結(jié)合碳納米管，從而能使碳納米管形成特定的三維結(jié)構［165］?，F(xiàn)在，M13 已被工程化為納米金顆粒以及由其他金屬制成的納米顆粒的載體，展現(xiàn)了人工噬菌體在新型生物納米材料中應用的功能多樣性［166］。

噬菌體衣殼也可以用來增強酶的活性。把酶緊密地排列在噬菌體衣殼上，可以保護酶級聯(lián)反應中的不穩(wěn)定中間體，從而增加代謝通量。在噬菌體MS2 上編碼SpyTag 并使用其連接兩種不同的酶，將其變成了一個微反應器［167］。所得的ⅤLP 復合物使酶至少保持7 天活性，并且與用游離酶相比，產(chǎn)量增加了60%。由于某些底物和產(chǎn)物在富含脂質(zhì)的環(huán)境中更易溶解，因此同一研究人員使用含脂質(zhì)的噬菌體φ6 作為載體，成功開發(fā)了含脂質(zhì)的納米反應器［168］。

4 總結(jié)與展望

噬菌體一直是生物學發(fā)展中不可或缺的參與者，并為生物技術的發(fā)展做出了巨大貢獻。噬菌體許多基因元件是構建合成生物學中基因回路的重要組成部分，通過噬菌體基因組學，我們看到了噬菌體驚人的多樣性［169］，噬菌體基因組中許多有用的功能元件有待我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)，如溫和噬菌體裂解阻遏蛋白、終止因子和整合酶等，可以幫助我們建立精細調(diào)節(jié)的遺傳回路。噬菌體溶菌酶是一個必將增長的研究領域，不少公司也正在把噬菌體溶菌酶推入臨床或獸醫(yī)測試的各個階段［170］。噬菌體的衣殼結(jié)構還推動了各種有機和無機化合物的合成。

近十年來，由于大量耐藥菌的出現(xiàn)，針對細菌感染性疾病的噬菌體療法又重新受到人們的重視。作為抗菌劑和細菌診斷試劑，噬菌體表現(xiàn)出巨大的醫(yī)療潛力。2014 年，噬菌體療法被美國國家過敏與傳染病研究所列為應對抗生素抗性的重要武器之一。然而，噬菌體療法臨床上的大規(guī)模應用受到各種因素的制約。噬菌體的人工改造可能突破這些制約因素，因此，合成生物學家關注的另一個領域是創(chuàng)建用于預防和治療的人工噬菌體。噬菌體基因組添加熒光基因后，可以用來檢測病原菌；尾部蛋白基因的替換可以擴展噬菌體宿主譜；添加生物膜降解基因可降解生物膜，添加抑菌藥物或裂解酶可以提高天然噬菌體治療潛力等［92］，并且我們預見到，隨著多重耐藥菌對全球健康威脅的日益增加，人們對噬菌體的臨床應用需求日益迫切，噬菌體治療將繼續(xù)作為一種抗生素的補充應用而增長。我們希望人工合成的噬菌體將能夠緩慢替代天然噬菌體。與天然噬菌體相比，人工構建的噬菌體更容易模塊化。另外，我們必須防止這種為獲得最大殺滅效率而構建的噬菌體擴散到環(huán)境中，因為這些人工噬菌體可能會使自然環(huán)境中的菌群產(chǎn)生對噬菌體的抗性或破壞自然菌落結(jié)構。

前文綜述了噬菌體合成生物學研究的進展和應用，人工噬菌體不僅用于防控細菌感染，還用于病原體檢測、食品安全、菌群調(diào)控、疫苗開發(fā)和納米材料等，但是，自然界中噬菌體類型和基因庫的巨大多樣性尚未得到充分利用［10］，其潛力還遠沒有被挖掘，噬菌體研究仍處于起步階段。實際上，大多數(shù)天然噬菌體尚未在實驗室得到培養(yǎng)。在已知的天然噬菌體中，許多尚未表征或沒有適合的遺傳操作平臺。因此，到目前為止，噬菌體合成生物學研究僅涉及現(xiàn)有噬菌體類型的一小部分。隨著DNA 測序技術的不斷發(fā)展，噬菌體基因數(shù)據(jù)將急劇增加，而我們合成DNA 的能力也在不斷增強，使得我們無需在實驗室中分離這些天然噬菌體，可以直接通過合成這些DNA 來挖掘這些噬菌體的功能基因元件，以重構天然噬菌體或設計出結(jié)合了各種噬菌體基因元件的新型噬菌體。噬菌體基因組的人工合成必將更好地解決噬菌體大規(guī)模應用的各種限制問題，推動噬菌體應用更快發(fā)展。