藥食同源新配方液體KH-0004的抗病毒作用和安全性研究

代 巖，景世鈺，吳杰軍，陳景才*，趙軟金*

（1.河南開懷藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450000；2.美國佛羅里達Sarasota中醫(yī)藥中心，河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450000）

隨著社會的發(fā)展，越來越多的人意識到不治已病治未病是健康管理之導向?！八幨惩础薄搬t(yī)食同源”等理念逐漸成為人們信奉的養(yǎng)生信條，并發(fā)展成為自成體系的食療養(yǎng)生文化[1]。植物飲料是指以植物或植物提取物，添加或不添加其他食品原輔料和食品添加劑，經(jīng)加工或發(fā)酵制成的飲料，植物飲料中最具代表性的是涼茶飲料[2]。目前植物功能性飲料還沒有統(tǒng)一的定義，這里主要強調的是植物來源的功能性飲料，通常來說，是以含有某種對人體有益的具有特殊功效成分的植物為原料，經(jīng)過加工、科學配比、專業(yè)品評制成的適合大眾需要的植物飲料產(chǎn)品[3]。以藥食同源為原料制成的產(chǎn)品的一大優(yōu)勢是其既可加工成食品供日常食用，起到食療的功效，又可以制成藥供臨床使用。

病毒是一類由核酸（DNA或RNA）與蛋白質構成的非細胞結構微生物。病毒感染是指病毒通過多種途徑侵入機體，并在易感的宿主細胞中增殖的過程，其實質是病毒與機體、病毒與易感細胞相互作用的過程。對人體致病病毒能夠侵入人體細胞并利用宿主細胞中的酶、細胞器及營養(yǎng)物質結合自身遺傳物質達到自我增殖的目的，最終將導致宿主細胞死亡，是一類嚴重危害人體生命健康的病原體[4]。如傳染性極強的艾滋病病毒、埃博拉病毒、SARS病毒[5-6]以及2020年初暴發(fā)的病毒性傳染病[7-10]等。然而，目前對大多數(shù)病毒感染缺乏特效藥物治療。

本研究選用藥食同源中藥材金銀花、菊花、菊苣、蒲公英、代代花、甘草、砂仁、淡竹葉為原料，通過優(yōu)化的配比及工藝，制備成無菌上清液KH-0004，然后利用體外細胞學實驗測試其抗冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒的活性，并評價其急性經(jīng)口毒性[11]、遺傳毒性[12-14]、28天經(jīng)口毒性[15]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（上海容威儀器有限公司），實驗室多功能提取機組（山東精誠醫(yī)藥裝備有限公司），超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），顯微鏡（日本Olympus公司），微孔板快速振蕩器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司），多標記讀板儀（美國Perkin Elmer公司Envision plate reader），熒光定量PCR儀（美國ABI公司），真空泵（美國INTEGRA Biosciences公司），12道移液器，單道移液器（美國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

雌、雄ICR小鼠：購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心。

SPF級SD大鼠：上海杰思捷實驗動物有限公司。

組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA1535，TA97，TA98，TA100和TA102：購自浙江省醫(yī)學科學院。

HepG2.2.15表達HBV病毒的人肝細胞[16-17]：購自上海復祥生物科技有限公司；Vero細胞，HEp2細胞ATCC CCL-23，人肝癌細胞Huh7細胞：購自美國ATCC。

金銀花、菊花、菊苣、蒲公英、代代花、甘草、砂仁、淡竹葉：購自河北省安國市一方藥業(yè)有限公司。

DMEM/F12，臺盼藍，0.4%（w/v），DMEM：購自美國G i b c o。胎牛血清（F B S）：購自法國Biosera。1XDPBS，0.25% Trypsin-EDTA，青霉素-鏈霉素雙抗（100×P/S），非必須氨基酸（NEAA），丙酮酸鈉（100mM）：購自美國Invitrogen。二甲基亞砜（DMSO），環(huán)磷酰胺：購自美國Sigma。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit：購自美國Promega。TB GreenTM Premix Ex TaqTM (TIi RNaseH Plus)：購自日本Takara。利巴韋林注射液：購自天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 KH-0004的制備

稱取金銀花1～30份、菊花1～30份、蒲公英1～30份、菊苣1～30份、代代花1～30份、甘草1～30份、砂仁1 ～3 0 份、淡竹葉1 ～3 0 份，先將金銀花、菊花、蒲公英、菊苣、代代花、甘草、砂仁、淡竹葉混合在一起，加入10～250倍純凈水浸泡30～60 min，然后煮沸25～60 min，待澄清冷卻到室溫（23±2?C），過濾、滅菌，即得KH-0004。

2.2 KH-0004抗單純皰疹病毒（HSV-1, HSV-2）活性檢測

2.2.1 細胞毒實驗：Vero 細胞用完全培養(yǎng)基DMEM（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天Vero細胞加入96-孔細胞培養(yǎng)板10000細胞/孔。實驗當天，棄去細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的待測樣品。加入100 μL/孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細胞活性[18]。細胞毒實驗結果由至半數(shù)細胞死亡濃度（CC50）表示，結果見表1。

2.2.2 抗H S V-1 實驗：Ve r o 細胞用完全培養(yǎng)基DMEM（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天Vero細胞加入96-孔細胞培養(yǎng)板10000細胞/孔。實驗當天，棄去細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的化合物及待測樣品。冰上融化HSV-1病毒儲存液，用含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基配制成大約10000倍的病毒稀釋液，充分混勻。細胞檢測板每孔加入100 μL病毒稀釋液，共200 μL每孔，20000倍的病毒稀釋液（MOI=0.004）。HEP（100%作用）加入200 μL每孔檢測培養(yǎng)基，不加病毒，ZPE（0%作用）加入20000倍的病毒稀釋液200 μL每孔。將細胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細胞活性?？共《緦嶒灲Y果由至半數(shù)病毒生長抑制濃度（EC50）表示，結果見表1。結果表明，KH-0004具有較強的抗HSV-1活性，選擇指數(shù)SI=3.3。

2.2.3 抗HSV-2實驗：實驗過程同2.2.2抗HSV-1實驗步驟，冰上融化HSV-2病毒儲存液，用含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基配制成大約1 0 0 0 倍的病毒稀釋液充分混勻，病毒稀釋液加入細胞檢測板后最終為2 0 0 0 倍稀釋（MOI=0.007）?？共《緦嶒灲Y果由至半數(shù)病毒生長抑制濃度（EC50）表示，結果見表1。結果表明，KH-0004具有很強的抗HSV-2活性，選擇指數(shù)SI=20。

表1 KH-0004抗單純皰疹病毒實驗結果

2.3 KH-0004抗乙型肝炎病毒（HBV）活性檢測

2.3.1 細胞毒實驗：96孔細胞培養(yǎng)板中鋪HepG2.2.15細胞20000個/孔，每孔200 μL細胞培養(yǎng)基。在37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天至細胞長至滿孔。在測試第0天，棄去細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基加入100 μL/孔配制好的化合物。加入100 μL/孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基，最終200 μL每孔，化合物最高檢測濃度2倍稀釋。培養(yǎng)基對照孔作為ZPE孔加入200 μL檢測培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細胞活性。細胞毒實驗結果由至半數(shù)細胞死亡濃度（CC50）表示，結果見表2。

2.3.2 抗乙肝病毒實驗：9 6 孔細胞培養(yǎng)板中鋪HepG2.2.15細胞20000個/孔，每孔200 μl細胞培養(yǎng)基。在37?C，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天至細胞長至滿孔。在測試第0天，棄去細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基加入100 μL/孔配制好的化合物。再加入100 μL每孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基，最終200 μL每孔，化合物最高檢測濃度2倍稀釋。ZPE（0%作用）孔加入200 μL檢測培養(yǎng)基，HPE（100%作用）孔，每孔加入200 μL含有1 μL 0.2 mM的陽性對照化合物的檢測培養(yǎng)基。96孔細胞測試板在37?C CO2培養(yǎng)箱中孵育7天，每隔一天（第2，4，6天）換一次液（2% FBS），并加入新鮮配置的樣品。在第7天每孔取150 μL上清作病毒DNA的qPCR檢測。結果見表2。結果表明，KH-0004具有較強的抗乙型肝炎病毒活性，選擇指數(shù)SI=4.95。

表2 KH-0004抗乙型肝炎病毒實驗結果

2.3.3 qPCR方法檢測病毒基因組DNA：qPCR引物如表3。按以下成分配制qPCR反應體系：TB Premix Ex TaqTM II（2×）5 μL，HBV-For-202（10 μM）0.4 μL，HBVRev-315（10 μM）0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.2μL，病毒上清1 μL，加水至10 μL。按以下條件設置ABI ViiA7 qPCR儀：階段1：Reps：95?C，30秒，一個循環(huán)；階段2：Reps：95?C，5秒和60?C，34秒，40個循環(huán)。

表3 HBV引物序列

2.4 KH-0004抗呼吸道合胞病毒（RSV）活性檢測

2.4.1 細胞毒實驗：HEp2細胞用完全培養(yǎng)基DMEM/F12（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天HEp2細胞加入96-孔細胞培養(yǎng)板5000細胞/孔。實驗當天，棄去細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的化合物。加入100 μL每孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基，最終200μL每孔，化合物最高檢測濃度2倍稀釋。ZPE孔加入200 μL每孔檢測培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用Promega CellTiter Cell Viability kit檢測細胞活性。細胞毒實驗結果由至半數(shù)細胞死亡濃度（CC50）表示，結果見表4。

2.4.2 抗呼吸道合胞病毒實驗：HEp2細胞用完全培養(yǎng)基DMEM/F12（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天HEp2細胞加入96-孔細胞培養(yǎng)板5000細胞/孔。實驗當天，棄去細胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的化合物。冰上融化RSV病毒儲存液，用含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基配制成大約4000倍的病毒稀釋液，充分混勻。細胞檢測板每孔加入100 μL病毒稀釋液，共200 μL每孔，最終病毒稀釋8000倍（MOI=0.1）。HEP（100 %作用）加入200μL每孔檢測培養(yǎng)基，不加病毒，ZPE（0%作用）加入8000倍的病毒稀釋液200 μL每孔。將細胞培養(yǎng)板放入37?C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細胞活性?？共《緦嶒灲Y果由至半數(shù)病毒生長抑制濃度（EC50）表示，結果見表4。結果表明，KH-0004具有很強的抗RSV活性，選擇指數(shù)SI=21.7。

表4 KH-0004抗乙型肝炎病毒實驗結果

2.5 KH-0004抗冠狀病毒活性檢測

實驗在傳代Huh7細胞中進行，細胞以1.5×104個/孔接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后將100 TCID50 HCoV-229E病毒液感染96孔板內細胞，待測樣品用培養(yǎng)液液稀釋，于感染同時給藥進行測定，待測樣品以三倍稀釋8個劑量的樣品進行實驗，每個劑量設2個平行孔，待病毒對照組病變達4+號時觀察結果，記錄并用Reed-Muench法計算待測樣品對病毒的半數(shù)抑制濃度及選擇指數(shù)（SI=EC50/CC50）。結果見表5。結果表明，KH-0004具有一定的抗冠狀病毒活性，選擇指數(shù)SI＞1.3。

表5 KH-0004抗冠狀病毒實驗結果

2.6 KH-0004急性經(jīng)口毒性試驗

20只ICR小鼠，雌雄各半，采用最大限量法，灌胃劑量為原液10031.4 mg/kg，試驗前禁食4小時，試驗開始后，對動物用經(jīng)口灌胃法一次染毒，染毒后繼續(xù)禁食1小時，觀察并記錄染毒存活動物并進行解剖。結果表明，實驗動物在染毒14天內未見任何中毒癥狀和中毒死亡；雌雄動物的平均體重重未見異常。實驗觀察結束，對受試動物進行大體解剖也未見異常變化。LD50>10031.4 mg/kg。按照《GB15193.3-2014-食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗》標準，該樣品對IC小鼠的急性經(jīng)口LD50>5000 mg/kg。根據(jù)急性毒性分級，屬于實際無毒級。檢測結果來自寧波海關技術中心。

2.7 KH-0004遺傳毒性試驗

2.7.1 細菌回復突變試驗：實驗中所用到的菌株為組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA1535，TA97，TA98，TA100和TA102。實驗劑量設置：分別在加和不加S9的情況下選擇0.05 mg/皿，0.16 mg/皿，0.50 mg/皿，1.58 mg/皿共5個劑量為正式試驗劑量，選擇0.01 mg/皿，0.04 mg/皿，0.20 mg/皿，1.00 mg/皿，5.00 mg/皿共5個劑量為驗證試驗劑量，同時空白對照組，陰性對照組，陽性對照組。菌株增菌后加入受試品、增菌液、S9混合液，涂布均勻，37?C培養(yǎng)48小時，計算每皿的回變菌落數(shù)。結果表明，受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過未處理對照菌落數(shù)2倍，不同劑量組間無劑量-反應關系。經(jīng)驗證試驗確證受試物結果依然為陰性。檢測結果來自寧波海關技術中心。

2.7.2 哺乳動物紅細胞微核試驗：實驗動物為ICR清潔級小鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，經(jīng)口灌胃給藥，灌胃體積為20 ml/kg體重。三組受試樣品組的濃度分別為2500 mg/kg體重、5000 mg/kg體重、10000 mg/kg體重，陰性對照組為純水，陽性對照組為40 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺。實驗采用30小時受試物法，兩次給受試物間隔24小時，第2次給藥6小時后頸脫臼處死小鼠，去股骨，以小牛血清清洗骨腔，制成細胞懸液，涂片、染色、鏡檢。結果表明，各受試樣品組的嗜多染紅細胞微核率與陰性對照組比無顯著性差異（P＞0.05），在劑量≦10000 mg/kg體重的情況下，該樣品的微核試驗為陰性。檢測結果來自寧波海關技術中心。

2.7.3 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗：實驗動物為ICR清潔級小鼠，隨機分為3組，每組10只，雌雄各半，經(jīng)口灌胃給藥，灌胃體積為20 ml/kg體重。受試樣品組的濃度分別為10000 mg/kg體重，陰性對照組為純水，陽性對照組為40 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺。實驗采用兩次給與受試物，每次間隔24小時，于末次給與受試物后18小時處死動物采樣。處死動物前4小時，按4 mg/kg體重腹腔注射秋水仙素，頸脫臼處死小鼠，取骨髓細胞，制成細胞懸液，涂片、染色、鏡檢。結果表明，受試樣品組的染色體結構畸變細胞百分率與陰性對照組比無顯著性差異（P＞0.05），在劑量≦10000 mg/kg體重的情況下，該樣品的哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗為陰性。檢測結果來自寧波海關技術中心。

2.8 KH-0004 28天經(jīng)口毒性試驗

根據(jù)GB 15193.22-2014食品安全國家標準28天經(jīng)口毒性試驗規(guī)范，及KH-0004人體推薦攝入量1000 ml/天，進行KH-0004 SD大鼠28天經(jīng)口毒性試驗，受試樣品為10倍濃縮液。試驗選擇5周齡健康SPF級SD大鼠（雌雄均未交配過），試驗初始雄性SD大鼠體重（83.4±3.6）g，雌性SD大鼠體重（85.1±3.5）g。試驗設置4個劑量組，分別為5 g/kg·BW、10 g/kg·BW和20 g/kg·BW劑量組，分別相當于人體攝入的30倍、60倍和120倍，同時設立溶媒對照組（給予最大灌胃容量溶媒），每個試驗組20只SD大鼠，雌雄各半，灌胃受試樣品28天，灌胃容量20 ml/kg·BW；同時設置恢復期，即對照組和20 g/kg·BW劑量組（每組5雌5雄）在染毒28天后進行14天恢復期觀察。染毒期限：28天，染毒頻率：1次/天，染毒途徑：灌胃，灌胃容量：2.0 ml/100g·BW。

結果表明，未見受試樣品對SD大鼠存在潛在的毒性效應，未見受試樣品對SD大鼠存在明顯的靶器官毒性；14天恢復期結束未見各項檢測指標變化；受試樣品對SD大鼠28天經(jīng)口毒性試驗的未觀察到有害作用劑量（NOAEL）為大于20 g/kg·BW。檢測結果來自寧波海關技術中心。

3 討 論

由病毒感染引起的疾病長期以來一直困擾著人類，然而由于其結構的特殊性，對于由病毒引起的疾病至今仍缺乏特異性的有效治療藥物。因此，面對威脅著人類生命健康的病毒，我們迫切地需要研制出療效確切、安全性較高的藥物。相比西藥，中藥具有許多優(yōu)勢，比如毒性較低，藥性溫和，材料豐富，價格低廉等[19]。因此，越來越多的人將抗病毒藥物的研究投向傳統(tǒng)的中草藥。

本研究以八種中草藥為原料，研制出了一款口感適宜，具有體外抗HSV-1，HSV-2，HBV，RSV，HCoVOC43，HCoV-229E作用的安全的功能性植物飲料，為進一步研究抗病毒藥物提供依據(jù)，有望成為廣譜抗病毒的新產(chǎn)品。組方中金銀花、菊花、菊苣、蒲公英、代代花、淡竹葉氣味辛涼，甘淡，清熱解毒，砂仁和甘草溫通陽氣，調和諸藥，制約了清熱藥的寒涼，不傷胃氣，可以長期服用。既有五味消毒飲[20]的方義，又融入了封髓丹[21]的精神。配方和選藥完全符合中醫(yī)學的藥學理論。

中草藥是我國的瑰寶，社會的發(fā)展促使人們對疾病的認識，從治療轉換為預防，中藥治療病毒感染性疾病也已有了數(shù)千年的經(jīng)驗，以藥食同源中草藥為原料加工制得食品以用于對疾病的預防及治療，值得我們進一步的深入探索，從而挖掘出更多有效的抗病毒的食品或藥物。

感謝為本研究提供研發(fā)外包服務的單位：上海輝源生物科技有限公司提供抗單純皰疹病毒實驗、抗乙型肝炎病毒實驗、抗呼吸道合胞病毒實驗；中國醫(yī)學科學院醫(yī)生技所提供抗冠狀病毒實驗；浙江省寧波海關技術中心提供急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗、28天經(jīng)口毒性實驗。