分析孕婦血漿游離胎兒DNA檢測在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值

楊元伍，鐘文富

（廣西貴港市人民醫(yī)院，廣西 貴港 537100）

隨著國內(nèi)醫(yī)療技術(shù)條件的提高和對遺傳性疾病認(rèn)識的加深，孕婦對產(chǎn)前檢查的重視程度越來越高。以往國內(nèi)主要是通過羊水穿刺、絨毛膜活檢或臍靜脈穿刺術(shù)等方法進(jìn)行產(chǎn)前檢查，由于檢查方法都有一定的創(chuàng)傷性，給孕婦和胎兒都帶來了感染、出血等風(fēng)險，嚴(yán)重者甚至流產(chǎn)。而進(jìn)行血清標(biāo)記物或超聲波檢測雖無創(chuàng)，但靈敏度較低[1]。如何通過無創(chuàng)檢查對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷一直是臨床醫(yī)務(wù)工作者努力攻破的課題。自國外第一次證實(shí)孕婦血漿中存在胎兒的游離DNA開始，一種新的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測方法誕生了。為進(jìn)一步驗(yàn)證孕婦血漿游離胎兒DNA檢測在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值，本次研究應(yīng)用高通量基因測序技術(shù)檢測220例孕婦血漿游離胎兒DNA的產(chǎn)前診斷結(jié)果，分析胎兒染色體的情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2018年12月-2019年12月在貴港市人民醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前診斷的220例孕婦，所有孕婦均為孕周14周以上（含14周），所有孕婦均自愿選擇高通量基因測序進(jìn)行唐氏篩查，并簽署知情同意書。孕婦的年齡最小為22歲，最大為42歲，平均年齡（27.4±5.3）歲；其中首次懷孕的有180例，再次或多次懷孕的有40例，排除存在嚴(yán)重貧血的孕婦。

1.2 檢測方法

①血漿分離：抽取孕婦外周血5 ml，采用EDTA抗凝并于4℃暫存。要求要在2 h以內(nèi)完成該步驟操作。1600 r/min離心10 min后，吸取上層血漿；然后16000 r/min離心10 min，吸取血漿送檢。②采用美國Qiagen公司生產(chǎn)的產(chǎn)品高鹽吸附低鹽洗脫方法來將每份血漿過柱提取游離DNA。然后將獲得的有力DNA經(jīng)過末端補(bǔ)平、加“A”、加接頭、PCR富集，最終獲得對應(yīng)樣本的DNA文庫。③將獲得的DNA文庫經(jīng)過nglent2100檢測和Q．PCR定量后，按規(guī)格進(jìn)行文庫Pooling，然后經(jīng)C-bot橋式反應(yīng)擴(kuò)增，最后送HiSeq上機(jī)測序，獲得原始數(shù)據(jù)直接傳送到大型機(jī)。④每一測序reads染色體定位通過比對到Ensemble數(shù)據(jù)庫的人類基因組參考序列來確定。然后計算每一母體血漿樣本中21、18、13號染色體序列數(shù)目比率。Y染色體來源的reads比率也通過同樣的方法計算獲得并且用于估計該男胎孕婦血漿中胎兒DNA濃度。通過測試樣本的21、18、13號染色體reads比率減去對照組（懷有正常胎兒孕婦）的21、18、13號染色體reads比率的均值后再除以對照組內(nèi)21、18、13號染色體reads比率的標(biāo)準(zhǔn)差，最終得出測試樣本21、18、13號染色體的標(biāo)準(zhǔn)化z值。若z值≥3，即認(rèn)為待測樣本為三體高危；若z值≤-3，則為單體高危[2]。

羊膜腔穿刺及臍血穿刺術(shù)按照常規(guī)方法進(jìn)行，然后采用VideoTesT—Kary03.1（美國）全自動染色體分析系統(tǒng)進(jìn)行胎兒染色體核型分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA檢測（高通量基因測序）結(jié)果

220例孕婦中共檢出11例染色體高風(fēng)險胎兒，其中1例為X單體，5例2l-三體、3例18-三體和1例13-三體，1例可疑高風(fēng)險胎兒，敏感度為100%（10/10），特異度為99.5%（209/210）。

2.2 羊水/臍血細(xì)胞核型分析結(jié)果

經(jīng)過檢查證實(shí)有1 0 例為染色體異常，分別為6 例2l-三體、3例18-三體和1例13-三體，詳見表1。

表1 DNA檢測與產(chǎn)前診斷結(jié)果對比

3 討 論

有專家認(rèn)為，從免疫學(xué)角度，腫瘤和機(jī)體的關(guān)系類似于胚胎和母體之間的關(guān)系，既然從腫瘤患者血漿中分離出的DNA可以作為腫瘤診斷的指標(biāo)，那么從胚胎母體分離出的DNA可能有部分來自于胎兒，自從孕婦母體血漿和血清中檢側(cè)胎兒來源的游離DNA后，產(chǎn)前診斷的無創(chuàng)化成為研究者們關(guān)心的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)比較，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)對胎兒沒有任何風(fēng)險，只需要抽取孕婦5 ml的血漿就可以進(jìn)行檢測[3]。相關(guān)的研究顯示，DNA檢測技術(shù)對于檢測2l-三體、18-三體以及13-三體的敏感度和特異度都非常高，本次研究的結(jié)果與這些研究的結(jié)果是類似的，敏感度達(dá)到100%，特異度為99.5%，說明了孕婦血漿游離胎兒DNA檢測對于分析胎兒染色體的異常情況在臨床上是可行的，與傳統(tǒng)的方法比較，該技術(shù)的準(zhǔn)確性高，且沒有創(chuàng)傷，減少了不良事件的發(fā)生。

由于高通量基因測序的準(zhǔn)確率較常規(guī)的血清學(xué)唐氏篩查，即檢測孕婦血清標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）、游離雌三醇（uE3）、絨毛膜促性腺激素（B—HCG）三聯(lián)篩查的準(zhǔn)確率高，臨床上對該法的接受度也逐步提高。有些孕婦甚至直接選擇基因測序技術(shù)來代替血清學(xué)唐氏篩查，忽視了該法除非整倍體疾病外的微缺失、易位、微重復(fù)或其他染色體異常不能檢出的缺點(diǎn)。而篩查高風(fēng)險不僅僅對Ds有篩查異常，經(jīng)產(chǎn)前唐氏篩查21-三體高風(fēng)險而行產(chǎn)前診斷的病例中有約30%為性染色體或其他染色體異常，這一結(jié)論提示高通量基因測序技術(shù)存在一定的片面性，不能完全取代血清學(xué)唐氏篩查技術(shù)。

此外，在本次研究中檢測中1例X單體的孕婦，最終經(jīng)過羊水細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)為46.XX的正常核型。相關(guān)的研究中也提示，“Y染色體偏多”和“X染色體偏

少”的孕婦。經(jīng)羊水細(xì)胞染色體核型分析分別為“47，XYY”和“45,x”。這樣的結(jié)果說明目前DNA檢測在分析性染色體上的準(zhǔn)確率還比較低，是需要進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)才能夠進(jìn)行確診，而且該方法除整倍體疾病外的微缺失、易位、微重復(fù)或其他染色體異常該法也不能檢出，加上目前的檢測費(fèi)用還比較高，在臨床上的推廣還需要有待改進(jìn)。

綜上所述，孕婦血漿游離胎兒DNA檢測可用于篩查胎兒染色體拷貝數(shù)異常的檢測，其靈敏度和特異度高，在檢測過程中無創(chuàng)傷，減少不良事件的發(fā)生，值得臨床推廣使用。