CD4+CXCR3+T細(xì)胞、IP-10及IFN-γ在原發(fā)免疫性血小板減少癥中的表達(dá)及臨床意義

趙雪蕓，段曉靜，賈瑞萍*

（1.包頭市中心醫(yī)院血液科，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.赤峰學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（P r i m a r y i m m u n e thrombocytopenia，ITP），是一種臨床常見(jiàn)的獲得性自身免疫性出血性疾病[1]。根據(jù)病程及嚴(yán)重程度可將ITP分為新診斷的ITP、持續(xù)性ITP、慢性ITP、重癥ITP、難治性ITP[2]。成年ITP易發(fā)展為慢性、重癥及難治性ITP，且存在易復(fù)發(fā)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等疾病特點(diǎn)，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。然而迄今為止，ITP的發(fā)病機(jī)制尚不完全明了。

趨化因子是多成員構(gòu)成的細(xì)胞因子超家族，與其受體結(jié)合后，控制免疫細(xì)胞定向遷移，使后者到達(dá)炎性反應(yīng)部位，行使清除抗原、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、維持組織細(xì)胞平衡、消滅異常增殖細(xì)胞等功能[3]。趨化因子及其受體的異常表達(dá)和分布將導(dǎo)致免疫細(xì)胞的錯(cuò)誤定位和功能障礙，這將嚴(yán)重影響機(jī)體的正常免疫平衡。輔助性T細(xì)胞（Helper T cell，Th）是機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要功能的免疫細(xì)胞，根據(jù)分泌的細(xì)胞因子和功能可分化成不同亞群，如Th1、Th2、Th17等。每個(gè)亞群的分化過(guò)程中也伴隨一些標(biāo)志性趨化因子受體的表達(dá)變化，比如趨化因子受體3（Chemokine receptor 3，CXCR3）標(biāo)志性表達(dá)于Th1細(xì)胞。干擾素誘導(dǎo)蛋白10（Interferon-inducible protein 10，IP-10）是CXCR3的配體，它可以由體內(nèi)多種類型細(xì)胞分泌（如單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）。IP-10能夠根據(jù)其濃度梯度吸引表面表達(dá)CXCR3的Th1細(xì)胞，二者結(jié)合后發(fā)揮作用并使后者發(fā)生遷移定位至炎癥部位，參與炎性免疫反應(yīng)。目前已有很多研究檢測(cè)ITP中的Th1、Th2細(xì)胞比例，確認(rèn)ITP是一種Th1優(yōu)勢(shì)性免疫疾病[4]。推測(cè)IP-10/CXCR3趨化軸可能在增強(qiáng)Th1細(xì)胞的募集和活化中發(fā)揮作用，進(jìn)而參與ITP的免疫病理過(guò)程。我們分別檢測(cè)新診斷的ITP糖皮質(zhì)激素治療前及治療1周后外周血CXCR3表達(dá)與IP-10、IFN-γ水平，進(jìn)一步探討IP-10/CXCR3趨化軸在ITP發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年03月～2019年01月就診于包頭市兩所三級(jí)甲等醫(yī)院（包頭市中心醫(yī)院、包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）新診斷的成年ITP患者30例作為病例組，其中男性14例，女性16例，年齡22～82歲，平均52歲，血小板計(jì)數(shù)（2～38）×109/L；選擇健康志愿者20例為對(duì)照組，其中男性8例，女性12例，年齡23～80歲，平均45.8歲，兩組性別與年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)價(jià)均依據(jù)侯明等編著的《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）》。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他繼發(fā)性血小板減少癥。

1.2 治療方法及療效分組

所有ITP患者均靜脈滴注甲潑尼龍琥珀酸鈉0.8 mg/kg.d治療，PLT≥100×109/L后改為甲潑尼龍片口服。如治療前血小板水平低于10×109/L，且伴有出血或有出血風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，給予輸注單采血小板及丙種球蛋白。入組ITP患者接受糖皮質(zhì)激素治療1周后的療效分組：完全反應(yīng)組：19例，治療后PLT≥100×109/L且無(wú)出血；有效組：11例，治療后PLT≥30×109/L或大于初診時(shí)血小板計(jì)數(shù)的2倍且無(wú)出血。

1.3 主要試劑與儀器

鼠抗人C D 4 異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）抗體、鼠抗人CXCR 3 藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、紅細(xì)胞裂解液（1X）、人IP-10 ELISA試劑盒（96T）、人IFN-γ ELISA試劑盒（96T）均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。FACS Canto TM Ⅱ型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dckinsoni公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.4 標(biāo)本采集及處理

抽取病例組（新診斷時(shí)和治療1周后）與對(duì)照組晨起空腹外周靜脈血3ml，放入EDTA抗凝管，充分混勻，吸取200 ul在4小時(shí)內(nèi)完成CD4+CXCR3+T細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；剩余全血3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min，將上清液移入2ml的Eppendorf管中，置于超低溫冰箱冰凍（-80℃）保存，用于IP-10及IFN-γ的定量檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率

在流式細(xì)胞管中加入混合均勻的50ul EDTA抗凝全血、5ul FITC-CD4抗體、5ul PE-CXCR3抗體，設(shè)空白對(duì)照管，在室溫下避光孵育30分鐘；向每個(gè)流式管加入300ul 1x紅細(xì)胞裂解液以裂解紅細(xì)胞，輕輕混合，在室溫下避光15分鐘；加入PBS緩沖液lml，輕輕混合，1800轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘，棄上清液；加入200ul PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。以前向角（Forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向角（Side scatter，SSC）為雙參數(shù)，圈定CD4+T淋巴細(xì)胞門，在CD4+T淋巴細(xì)胞門內(nèi)以FITC及PE為雙參數(shù)，圈定CD4+CXCR3+T細(xì)胞群，所得數(shù)據(jù)即為CD4+CXCR3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占比例（%），記錄各標(biāo)本CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）雙抗體夾心法檢測(cè)IP-10、IFN-γ

操作步驟嚴(yán)格按照聯(lián)科生物技術(shù)有限公司人IFN-γ ELISA試劑盒（96T）及人IFN-γ ELISA試劑盒（96T）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（百分比）表示，病例組與對(duì)照組比較采用x2檢驗(yàn)；正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，病例組與對(duì)照組均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，治療前、后組均數(shù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；對(duì)部分指標(biāo)作兩樣本直線相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析

ITP組與健康對(duì)照組相比性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；血小板計(jì)數(shù)（Platelet，PLT）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 ITP組與健康對(duì)照組臨床資料分析

2.2 CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率及IP-10、IFN-γ表達(dá)水平

ITP組CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10、IFN-γ表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。完全反應(yīng)組治療前CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10、IFN-γ表達(dá)水平均明顯高于治療后及健康對(duì)照組（P＜0.05），且治療后與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有效組治療前CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10、IFN-γ表達(dá)水平均明顯高于治療后及健康對(duì)照組（P＜0.05），治療后IP-10、IFN-γ水平與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 病例組及對(duì)照組中 CD4+CXCR3+T、IP-10、IFN-γ的表達(dá)

2.3 ITP組CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率與IP-10、IFN-γ水平、PLT相關(guān)性分析

ITP組中CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率與IP-10、IFN-γ表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r1=0.293，P1=0.002，r2=0.248，P2=0.005）；IP-10與IFN-γ水平呈正相關(guān)（r=0.188，P=0.017）。CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10、IFN-γ三者與PLT均沒(méi)有明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 ITP組CD4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10、IFN-γ表達(dá)水平相關(guān)性分析

3 討 論

趨化軸由趨化因子、趨化因子受體及相關(guān)細(xì)胞因子構(gòu)成，多途徑參與T細(xì)胞分化、分子粘附、白細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等過(guò)程。CXCR3作為活化的T淋巴細(xì)胞特別是Th1和CD8+T細(xì)胞表面的標(biāo)志物，是體內(nèi)Th1細(xì)胞分化所必需的。CXCR3在Th1細(xì)胞向炎癥外周組織的運(yùn)輸中起重要作用，被報(bào)道為Th1細(xì)胞極化的多種自身免疫性疾?。ㄈ缍喟l(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）中的關(guān)鍵因子[5-6]。CXCR3存在三種特異性配體Mig、IP-10、I-TAC，均屬于IFN-γ誘導(dǎo)型趨化因子[7]。Groom等[8]通過(guò)小鼠模型證明IP-10是CXCR3三種配體中對(duì)Th1細(xì)胞的發(fā)育以及遷移過(guò)程最重要的趨化因子。有研究證明，新診斷的ITP患者中IP-10水平升高，當(dāng)接受糖皮質(zhì)激素治療或者脾切除病情緩解后，該值降至正常水平。Zhou等研究證明ITP患者脾臟中CXCR3的表達(dá)顯著增加，認(rèn)為在患者脾臟中也存在Th1極化現(xiàn)象，CXCR3及其配體異常表達(dá)可能參與了ITP患者的脾臟免疫紊亂。IFN-γ是一種主要由Th1細(xì)胞分泌的糖蛋白。它可以參與并正向調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過(guò)程，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞的發(fā)育[11]。體外實(shí)驗(yàn)已證明使用IFN-γ誘導(dǎo)后多種類型細(xì)胞（如單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等）可以表達(dá)IP-10，說(shuō)明干擾素-γ是IP-10的生理誘導(dǎo)劑。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)新診斷的ITP患者外周血中CX4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10及 IFN-γ的表達(dá)水平均較健康對(duì)照組顯著增高，接受糖皮質(zhì)激素治療1周后CX4+CXCR3+T細(xì)胞表達(dá)率、IP-10及 IFN-γ的表達(dá)水平較治療前下降，且與健康對(duì)照無(wú)明顯差異。因此在ITP患者外周血中，IP-10/CXCR3趨化軸相關(guān)因子均存在高表達(dá)，且IP-10、CXCR3、IFN-γ三者間呈正相關(guān)。以上結(jié)果印證了ITP中存在著Th1活化模式，IP-10/CXCR3趨化軸可能通過(guò)趨化機(jī)制在ITP免疫機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，糖皮質(zhì)激素可以糾正IP-10/CXCR3趨化軸異常表達(dá)，提示糖皮質(zhì)激素可能是通過(guò)此種作用對(duì)ITP發(fā)揮治療作用。

目前，在一系列實(shí)驗(yàn)及自身免疫性疾病中研究了IP-10/CXCR3趨化軸的靶向治療。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心臟移植的小鼠疾病模型檢測(cè)到CXCR3表達(dá)升高，并且使用相應(yīng)抗體可以減輕疾病表現(xiàn)。鑒于ITP患者外周血中IP-10/CXCR3趨化軸的表達(dá)變化及其在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用，針對(duì)趨化軸的藥物干預(yù)及中和抗體或相應(yīng)的受體拮抗劑的使用也許能成為治療Th1優(yōu)勢(shì)型自身免疫性疾病的新方向。