水楊酸處理誘導(dǎo)采后甜瓜抗壞血酸-還原型谷胱甘肽循環(huán)代謝清除過氧化氫的作用及機(jī)制

楊 乾，范存斐，王 毅，任亞琳，畢 陽

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

化學(xué)誘抗劑可有效誘導(dǎo)厚皮甜瓜對多種采后真菌的抗性[1]，其誘導(dǎo)抗性的機(jī)制與激活苯丙烷、活性氧和能量等代謝密切相關(guān)[2]。氧爆是誘抗劑處理果實(shí)后的典型反應(yīng)[3]，氧爆初期產(chǎn)生的少量活性氧可作為信號分子激活相關(guān)防御反應(yīng)，而后期產(chǎn)生的大量活性氧則具有直接抑菌、促進(jìn)氧化交聯(lián)等作用[4]。然而，過量活性氧會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、降低果實(shí)的抗病性[5]。植物體內(nèi)已進(jìn)化出有效的清除系統(tǒng)來平衡活性氧，以防止過量活性氧的傷害[6]。清除系統(tǒng)包括酶促和非酶促兩類，前者包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶、過氧化氫酶（catalase，CAT）以及抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）-還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）循環(huán)相關(guān)酶，后者包括VE、VC、谷胱甘肽、多酚和類黃酮等[7]。有研究表明，采后水楊酸處理柑桔[8-9]、苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）處理蘋果[10]能誘導(dǎo)果實(shí)氧爆，同時(shí)提高其SOD活性，但會降低CAT活性。由此表明，誘抗劑所誘導(dǎo)的清除H2O2不依賴于過氧化氫酶。AsA-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)存在的一個(gè)重要抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，主要通過GSH和AsA的氧化還原來清除H2O2，在維持H2O2產(chǎn)生和清除平衡中發(fā)揮了重要作用[11]。有研究表明，水楊酸及其類似物BTH處理能促進(jìn)柑橘和蘋果AsA-GSH循環(huán)[9-10]。由此表明，AsA-GSH循環(huán)在誘抗劑激發(fā)的H2O2清除中具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采后BTH處理會通過激發(fā)厚皮甜瓜的氧爆來提高果實(shí)的抗病性[12]，但AsA-GSH循環(huán)如何系統(tǒng)參與誘抗劑激發(fā)的厚皮甜瓜H2O2清除鮮見報(bào)道。本研究以‘玉金香’厚皮甜瓜為試材，研究采后水楊酸（salicylic acid，SA）浸泡處理對果實(shí)活性氧的積累和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影響，測定處理后果實(shí)的SOD和CAT活力，以及AsA-GSH循環(huán)代謝酶活性和產(chǎn)物含量。以期為揭示AsA-GSH循環(huán)在清除誘抗劑激發(fā)的果實(shí)過量H2O2方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘玉金香’甜瓜于2 0 1 0 年7 月采自甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)露地大田。選取大小一致、成熟度大約九成、單果質(zhì)量約0.5～0.7 kg、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約12%～13%、無損傷、無病蟲害的果實(shí)，單果套發(fā)泡網(wǎng)袋，入包裝箱（20 個(gè)/箱），第2天運(yùn)抵甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，于常溫（（22±2）℃、相對濕度55%～60%）下貯藏待用。

SA（分析純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

3K30臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DW-HL218超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜處理

甜瓜處理參照范存斐等[13]的方法。SA用少量體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液溶解后加蒸餾水配制成濃度為4 mmol/L的溶液（內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80，用1 g/100 mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0）。取甜瓜果實(shí)表面用自來水沖洗干凈后晾干，將晾干后的果實(shí)浸入4 mmol/L的SA溶液中10 min，取出晾干后，單果套發(fā)泡網(wǎng)袋，放入包裝箱（20 個(gè)/箱），于常溫（（22±2）℃、相對濕度55%～60%）下貯藏待用。以清水（內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80，用1 g/100 mL NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0）處理作對照。每處理用果實(shí)40 個(gè)，重復(fù)3 次。

參照Ren Yalin等[14]的方法取樣，分別于處理后0、2、4、6、8、10 d用直徑5 mm打孔器打取皮下3～10 mm處組織3 g，錫箔紙包好后液氮冷凍，在－80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

1.3.2 MDA含量的測定

參照Hodges等[15]的方法測定MDA含量。取3 g冷凍組織，加5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液研磨，研磨后的勻漿于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，取上清液，加入相應(yīng)試劑后，分別測定其在450、532 nm及600 nm波長處的吸光度，MDA含量單位為μmol/g。

H2O2含量的測定參照Prochazkova等[16]的方法。取3 g冷凍組織，加入3 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮，冰浴條件下研磨成勻漿后，于4 ℃、12 000×g條件下離心20 min。取上清液，加入相應(yīng)試劑后測定其在410 nm波長處的吸光度。H2O2含量單位為mmol/g。

1.3.4 SOD和CAT活力測定

粗酶液的提取參照Lacan等[17]的方法并略作修改。取3 g冷凍組織，分別向研缽內(nèi)加入3 mL 0.1 mol/L p H 7.5 磷酸鹽緩沖液（含5 m m o/L 二硫蘇糖醇和2 g/100 mL PVP），在冰浴條件下研磨成勻漿后于4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液即為粗酶液。

SOD活力測定參照Oberley等[18]的方法并略作修改，測定反應(yīng)液在560 nm波長處吸光度。以每克組織抑制氮藍(lán)四唑光化還原的50%定義為一個(gè)酶活力單位（U），SOD活力單位為U/g。

CAT活力測定參照Clairbone[19]的方法并略作修改，測定反應(yīng)液在240 nm波長處的吸光度。以每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位（U），CAT活力單位為U/g。

1.3.5 AsA-GSH循環(huán)代謝酶活力的測定

粗酶液的提取參照Nakano等[20]的方法。取3.0 g冷凍組織于預(yù)冷的研缽中，加5 mL預(yù)冷的50 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（含1 mmol/L抗壞血酸、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、2 g/100 mL PVP，0.25% TritonX-100）研磨，于4 ℃、16 000×g離心20 min，上清液即為粗酶液。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定參照Nakano等[20]的方法。取上清液加入相應(yīng)試劑后，測定其在290 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘氧化1 μmol AsA定義為一個(gè)酶活力單位（U），APX活力單位為U/g。

谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力的測定參照Halliwell等[21]的方法。取上清液，加入相應(yīng)試劑后測定其在340 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘氧化1 μmol煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）定義為一個(gè)酶活力單位（U），GR活力單位為U/g。

脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力的測定參照Nakano等[20]的方法并略作修改，取上清液，加入相應(yīng)試劑后測定其在265 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘還原1 μmol AsA定義為一個(gè)酶活力單位（U），DHAR活力單位為U/g。

單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）的活力測定參照Nakano等[20]的方法并修改，取上清液，加入相應(yīng)試劑后測定其在340 nm波長處的吸光度。以每克組織每分鐘還原1 μmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位（U），MDHAR活力單位為U/g。

1.3.6 AsA-GSH循環(huán)產(chǎn)物和底物含量的測定

AsA、脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量測定參照Turcsányi等[22]的方法并略作修改。取3 g冷凍組織，加入5 mL 100 mmol/L鹽酸，冰浴條件下充分研磨，于4 ℃、7 800×g離心10 min，取上清液立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。AsA含量的測定：取100 μL上清液加入2 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，再加入0.5 mL蒸餾水，在265 nm波長處測其吸光度，AsA含量單位為μg/g。

總抗壞血酸含量的測定：取100 μL上清液加入2 mL 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液和0.5 mL 2 mmol/L二硫蘇糖醇溶液，置于室溫下反應(yīng)8 min后，在265 nm波長處測定其吸光度，總抗壞血酸含量單位為μg/g?？偪箟难岷繙p去AsA含量即為DHA含量，DHA含量單位為μg/g。

GSH和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量的測定參照Brehe等[23]的方法并略作修改。取3 g冷凍組織，加入5 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)6%偏磷酸（pH 2.8），冰浴條件下研磨成勻漿，于4 ℃、12 500×g條件下離心20 min，所得上清液為粗酶液。

總谷胱甘肽含量測定：500 μL上清液加入2.5 mL反應(yīng)液，其中反應(yīng)液包含800 μL反應(yīng)液1（110 mmol/L Na2HPO4·7H2O、40 mmol/L NaH2PO4·H2O、15 mmol/L EDTA、0.3 mmol/L二硫代二硝基苯甲酸、0.04 g/100 mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、8 0 0 μ L 反應(yīng)液2（1 m m o l/L E D TA、5 0 m m o l/L咪唑和0.0 2 g/1 0 0 m L B S A）、8 0 0 μ L 反應(yīng)液3（5 g/100 mL pH 7.5 Na2HPO4）和100 μL 9 mmol/L NADPH，以體積分?jǐn)?shù)6%偏磷酸（pH 2.8）代替粗酶液作為對照，測定反應(yīng)體系在412 nm波長處的吸光度，總谷胱甘肽含量單位為μg/g。

GSSG及GSH含量測定：在500 μL粗酶液中共加入2.5 mL乙烯吡啶，25 ℃下水浴1 h，在412 nm波長處測定其吸光度，GSSG含量單位為μg/g。GSH的含量由總谷胱甘肽含量減去GSSG含量得到，單位為μg/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

上述每項(xiàng)指標(biāo)測定至少重復(fù)3 次。用Excel 2010軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan's多重差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA處理對甜瓜果實(shí)貯藏過程中MDA含量的影響

圖1 SA處理對甜瓜果實(shí)貯藏過程中MDA含量的影響Fig.1 Effect of SA treatment on MDA content in melons

由圖1可知，SA處理組和對照組果實(shí)的MDA含量在貯藏期間逐漸升高，SA處理組果實(shí)的MDA含量在貯藏的中后期低于對照組，第10天時(shí)低于對照組14.6%（P＜0.05）。說明SA處理可以抑制甜瓜貯藏期間MDA的產(chǎn)生，有利于維持細(xì)胞膜的完整性。

2.2 SA處理對甜瓜果實(shí)貯藏過程O2－·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖2 SA處理對厚皮甜瓜果實(shí)貯藏過程中·產(chǎn)生速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.2 Effect of SA treatment on superoxide anion radial production rate (A) andH2O2 content (B) in melons

2.3 SA處理對甜瓜果實(shí)貯藏過程SOD及CAT活力的影響

貯藏期間，SA處理組和對照組果實(shí)的SOD活力均呈先下降后上升再下降的趨勢，SA處理組果實(shí)的SOD活力整體高于對照組，第6天較對照組高21.3%（P＜0.05）（圖3A）。SA處理組和對照組果實(shí)的CAT活力在貯藏期間總體呈下降趨勢，且SA處理組果實(shí)的CAT活力明顯低于對照組，第4天較對照組低22.9%（P＜0.05）（圖3B）。SOD和CAT活力的結(jié)果表明，SA處理提高了厚皮甜瓜果實(shí)的SOD活力，但抑制了CAT活力。

圖3 SA處理對厚皮甜瓜果實(shí)貯藏過程中SOD（A）和CAT（B）活力的影響Fig.3 Effect of SA treatment on SOD (A) and CAT (B) activities in melons

2.4 SA處理對甜瓜果實(shí)貯藏過程AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)物質(zhì)含量和酶活力的影響

貯藏期間，SA處理組果實(shí)的APX活力整體呈先上升后下降的趨勢，對照組果實(shí)的活力基本保持平穩(wěn)，后期緩慢降低再升高。SA處理組果實(shí)的APX活力明顯高于對照組，第2天較對照組高2.6 倍（P＜0.05）（圖4A）。SA處理組和對照組果實(shí)的MDHAR活力在貯藏期間呈先下降后上升的趨勢，SA處理組果實(shí)的活力明顯高于對照組，處理后第10天較對照組高70.8%（P＜0.05）（圖4B）。SA處理組和對照組果實(shí)DHAR活力在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，處理組果實(shí)的活力明顯高于對照組，第6天時(shí)較對照組高67.8%（P＜0.05）（圖4C）。SA處理組果實(shí)的GR活力在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，對照組果實(shí)的GR活力則緩慢上升并趨于平穩(wěn)，SA處理組果實(shí)GR活力明顯高于對照組，處理后第4天較對照組高1.3 倍（P＜0.05）（圖4D）。

貯藏期間，SA處理組和對照組果實(shí)中AsA含量呈先下降后上升的趨勢，但SA處理組果實(shí)的AsA含量明顯高于對照組，第8天較對照組高1.4 倍（P＜0.05）（圖4E）。SA處理組和對照組果實(shí)DHA含量在貯藏期間先上升后下降并趨于平穩(wěn)，SA處理組果實(shí)的DHA含量明顯低于對照組，處理后第4天低于對照組64.2%（P＜0.05）（圖4F）。對照組和SA處理組果實(shí)中GSSG含量在貯藏期間呈先下降后緩慢上升的趨勢，但SA處理組果實(shí)的GSSG含量明顯高于對照組，第8天高出對照組71.5%（P＜0.05）（圖4G）。SA處理組果實(shí)的GSH含量在貯藏期間呈先上升后降低再升高的趨勢，對照組果實(shí)的GSH含量呈先上升后平穩(wěn)降低的趨勢，但SA處理組果實(shí)的GSH含量明顯低于對照組，處理后第8天低于同期對照組66.1%（P＜0.05）（圖4H）。AsA-GSH循環(huán)中的4 種抗氧化酶（APX、MDHAR、DHAR和GR）與AsA、DHA、GSH和GSSG相互作用可以清除H2O2。上述結(jié)果表明，SA處理激活了厚皮甜瓜果實(shí)的AsA-GSH循環(huán)，促進(jìn)了H2O2的清除。

圖4 SA處理對厚皮甜瓜果實(shí)貯藏過程中AsA-GSH循環(huán)代謝相關(guān)物質(zhì)含量和酶活力的影響Fig.4 Effect of SA treatment on substance contents and enzyme activities related to AsA-GSH cycle in melons

3 討 論

氧爆是SA及其類似物處理果實(shí)后的典型反應(yīng)[3]，即產(chǎn)生大量的·和H2O2。氧爆期間，NADPH電子通過NADPH氧化酶（NADPH oxidases，NOX）轉(zhuǎn)移給O2，從而產(chǎn)生·[14]，·很快在SOD作用下歧化為H2O2[7]。氧爆早期的少量H2O2可作為信號分子激活相關(guān)防御反應(yīng)，而后期產(chǎn)生的大量H2O2則具有直接抑菌、促進(jìn)氧化交聯(lián)等作用[24]。有研究表明，BTH處理可提高蘋果果實(shí)NOX和SOD活力，進(jìn)而導(dǎo)致·和H2O2的積累[10]，該結(jié)果與本研究水楊酸處理甜瓜后得到的結(jié)果基本一致。由于活性氧會提高脂氧合酶和磷脂酶D的活力，導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的降解，從而增加脂質(zhì)飽和度，改變膜的流動性，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物[25]。雖然本研究發(fā)現(xiàn)SA處理導(dǎo)致了厚皮甜瓜果實(shí)·和H2O2的顯著積累，但同時(shí)抑制了MDA產(chǎn)生。由此表明，SA處理還激活了厚皮甜瓜果實(shí)的抗氧化系統(tǒng)，避免了過量活性氧對細(xì)胞膜的傷害。

AsA-GSH循環(huán)是存在于植物體內(nèi)重要的H2O2清除系統(tǒng)，在有效清除H2O2水平中發(fā)揮著重要作用[31]。在此循環(huán)中，APX分解H2O2形成H2O和單脫氫抗壞血酸（monodehydroascorbate，MDHA），MDHA可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為DHA，DHAR可催化DHA向AsA轉(zhuǎn)變，AsA也可在MDHAR作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸DHA，同時(shí)，GSH在DHAR作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG，GSSG經(jīng)GR和NADPH的作用還原為GSH[12]（圖5）。APX是AsA-GSH循環(huán)中的第一個(gè)酶，能專一性地催化AsA與H2O2反應(yīng)形成MDHA[30]。GR是一種黃素蛋白氧化還原酶，能將谷胱甘肽二硫化物還原為巰基形式[7]；也是重要的抗氧化酶，可保護(hù)酶蛋白的巰基，在NADPH的作用下能將GSSG轉(zhuǎn)化為GSH，進(jìn)一步降低氧化應(yīng)激[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，SA處理能通過增強(qiáng)APX和GR活力來清除過量的H2O2，該結(jié)果與BTH增強(qiáng)草莓[5]和蘋果[10]果實(shí)APX和GR活力結(jié)果類似。MDHAR是一種黃素腺嘌呤二核苷酸酶，以葉綠體和細(xì)胞溶質(zhì)同工酶的形式存在。MDHAR可以協(xié)同APX清除H2O2[7]。DHAR是另一種重要的酶，在GSH和NADH存在的條件下催化DHA向AsA轉(zhuǎn)變[33]。本研究發(fā)現(xiàn)SA處理提高甜瓜DHAR和MDHAR活力的結(jié)果與SA處理蘿卜觀察到的結(jié)果[34]類似。AsA是植物組織普遍存在的重要抗氧化劑[31]，可去除·OH、淬滅1O2、降低·產(chǎn)生速率，并催化H2O2分解為H2O和O2[35]。AsA可被APX氧化為MDHA，然后形成DHA，在MDAR和DHAR同時(shí)存在時(shí)，AsA可由MDHA和DHA再生[36]。此外，AsA再生也與GSH通過DHAR氧化為GSSG有關(guān)[36]。有研究表明，SA是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的重要調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，SA處理可以提高植物組織AsA含量[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，SA處理明顯促進(jìn)了厚皮甜瓜果實(shí)的AsA積累，抑制了DHA的生成，該結(jié)果與BTH處理增強(qiáng)蘋果果實(shí)AsA含量[10]和SA處理抑制柑橘果實(shí)DHA含量[9]的結(jié)果相似。谷胱甘肽是具有抗氧化功能的小分子短肽[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，SA處理會使厚皮甜瓜果實(shí)GSSG含量升高，GSH含量降低，可能是DHAR和GR活力的升高促使GSSG向GSH轉(zhuǎn)化。

圖5 SA處理誘導(dǎo)采后甜瓜AsA-GSH循環(huán)代謝清除H2O2模式Fig.5 Scheme of AsA-GSH cycle participates in H2O2 scavenging in muskmelons induced by salicylic acid

4 結(jié) 論