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    重組大腸桿菌全細胞催化D,L-扁桃酸對映選擇性制備L-苯甘氨酸

    2021-01-20 08:16:26賈園園張振華楊露露唐存多
    食品科學 2021年2期
    關鍵詞:雙酶扁桃甘氨酸

    賈園園,李 祥,張振華,張 閃,楊露露,唐存多,2,*

    (1.南陽師范學院 昆蟲生物反應器河南省工程實驗室,河南省南水北調中線水源區(qū)生態(tài)安全重點實驗室,河南 南陽 473061;

    2.車用生物燃料技術國家重點實驗室,河南 南陽 473061)

    L-苯甘氨酸是一種高值的非天然芳香族α-氨基酸,是合成食品添加劑和藥物中間體重要的手性砌塊[1-2]。L-苯甘氨酸及其衍生物是合成紫杉醇[3]、β-內酰胺類抗生素[4]及重磅炸彈藥物——氯吡格雷的重要中間體[5]。隨著化工技術的不斷發(fā)展,L-苯甘氨酸的化學合成工藝已非常成熟。但其傳統(tǒng)的合成過程所使用的氰化物或強堿,對工人的安全威脅較大,且對環(huán)境極不友好[5]。此外,化學合成L-苯甘氨酸的對映選擇性較差,增大了后續(xù)純化精制的成本。與傳統(tǒng)的化學合成相比,新型的生物合成具有手性選擇性強、反應條件溫和、環(huán)境友好及對設備要求低等優(yōu)勢[6],隨著環(huán)境問題日益突出,綠色、環(huán)保的生物合成更受關注和青睞[7-10]。近年來,關于苯甘氨酸生物合成研究較多的主要有苯海因酶轉化法[11]、D-苯甘氨酸氨基轉移酶法[12]和氨基酸脫氫酶法[13]等。然而,它們仍存在一定的缺陷,例如需要硫酸輔助[11]、催化活性低[12]或需要額外的輔酶循環(huán)系統(tǒng)[13]等。因此,開發(fā)轉化率高、對映選擇性好、成本低廉且環(huán)境友好的L-苯甘氨酸生物合成工藝具有重要的學術意義和應用前景[14]。

    扁桃酸消旋酶(mandelate racemase,MR)能夠催化扁桃酸消旋反應[15-17],D-扁桃酸脫氫酶(D-mandelate dehydrogenase,DMDH)能選擇性地催化D-扁桃酸脫氫氧化[18-19],而L-亮氨酸脫氫酶(L-leucine dehydrogenase,L-LeuDH)能催化苯乙酮酸的胺化還原[20-21],它們在L-苯甘氨酸生物合成中有巨大的應用潛力。在前期研究中,本團隊成功以DMDH和L-LeuDH為核心催化劑,構建了能夠實現(xiàn)輔酶內循環(huán)的級聯(lián)反應體系,基于輔酶內循環(huán),在不引入輔底物及額外催化劑的前提下,實現(xiàn)了L-苯甘氨酸的高效生物合成。200 mmol/L的D-扁桃酸在合適條件下反應12 h,L-苯甘氨酸的得率可達98%,且對映體過量值(enantiomeric excess,e.e.)大于98%[7]。目前,生物催化常用的催化劑主要有酶、細胞器和微生物細胞[6],這3 種催化劑各有優(yōu)勢。其中,全細胞催化具有獨特的優(yōu)勢,尤其是在有氧化還原反應參與的生物催化過程中,以微生物細胞作為催化劑進行催化反應可以利用細胞體內的輔酶循環(huán)系統(tǒng),不需要額外添加輔酶;同時,以全細胞作為生物催化劑能夠提高催化劑的穩(wěn)定性,減少催化劑的用量[22-24],且便于催化劑使用后的回收利用以及后續(xù)與產(chǎn)物的分離,能降低催化劑的使用成本及后續(xù)的分離成本[25]。迄今為止,全細胞催化技術用于工業(yè)化生產(chǎn)的案例也越來越多[26-28]。

    本研究擬參照圖1 的合成路線, 考察攜帶Agrobacterium radiobacter來源MR(ArMR)、Lactobacillus harbinensi來源DMDH(LhDMDH)和Exiguobacterium sibiricumDSM 17290來源LeuDH(EsLeuDH)編碼基因的重組大腸桿菌全細胞,對D,L-扁桃酸的轉化情況,并對產(chǎn)物進行分離和鑒定,為實現(xiàn)L-苯甘氨酸規(guī)?;纳锖铣傻於▓詫嵉幕A。

    圖1 全細胞催化生成L-苯甘氨酸的流程圖Fig. 1 Flow chart showing whole-cell catalytic production of L-phenylglycine

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 試劑

    底物D,L-扁桃酸、L-苯甘氨酸標準品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG) 生工生物工程(上海)股份有限公司;甲醇(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;氘代二甲亞砜 上海麥克林生化科技有限公司;NAD+深圳邦泰生物工程有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.1.2 菌株、質粒和培養(yǎng)基

    Escherichia coliBL21(DE3)、攜帶LhDMDH基因的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pET28a-LhDMDH[7]和ArMR基因的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pET28a-ArMR菌株[1]由本課題組構建和保藏;攜帶EsLeuDH基因的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pETDuet-1-EsLeuDH[21]由許建和教授饋贈。共表達質粒pACYCDuet-1購自美國Invitrogen公司。LB培養(yǎng)基:10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化鈉和5 g/L酵母提取物,自然pH值,121 ℃滅菌20 min,用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

    1.2 儀器與設備

    核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;蛋白電泳儀美國Bio-Rad公司;EC 2006型高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng) 大連依利特分析儀器有限公司;Hypersil C18柱、LTQ Orbitrap XL高分辨質譜系統(tǒng) 美國Thermo Scientific公司;Chirobiotic T手性柱 美國Merck公司。

    1.3 方法

    1.3.1 重組大腸桿菌的構建

    分別將質粒pETDuet-1-EsLeuDH和pACYCDuet-1用限制性內切酶EcoR I和Hind III雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,用割膠回收試劑盒回收酶切后的EsLeuDH和pACYCDuet-1,用DNA連接試劑盒連接后轉化E. coliBL21感受態(tài)細胞,經(jīng)氯霉素抗性篩選、菌落聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測、雙酶切鑒定及測序鑒定后獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組菌。再分別將pET28a-LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH用NdeI和XhoI進行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,用割膠回收試劑盒回收酶切后的LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH,用DNA連接試劑盒連接后轉化E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)氯霉素抗性篩選、菌落PCR檢測、雙酶切鑒定及測序鑒定后獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組菌。最后,將pET28a-ArMR質粒轉化至E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH感受態(tài)細胞,經(jīng)卡拉霉素和氯霉素雙抗性篩選,獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR重組菌。

    將上述重組菌連續(xù)在無抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次,然后接種至含卡拉霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察的生長情況,通過雙重抗性篩選考察重組菌攜帶質粒的遺傳穩(wěn)定性[1]。

    1.3.2 重組大腸桿菌的誘導表達

    授課教師要根據(jù)評價結果進行充分的分析、討論,如果課程達成度高于要求值,說明該課程可以實現(xiàn)對指標點的支撐,如果課程達成度低于要求值,教師需要改進教學方法和教學水平。專業(yè)負責人要根據(jù)畢業(yè)要求達成度進行研究,如果個別指標點達成度低于要求值,需要與相關教師尤其是勉強支撐課程的教師溝通,幫助教師提高教學水平,如果總的畢業(yè)要求達成度低于要求值,需要對課程體系進行修訂。

    重組大腸桿菌的誘導表達采用低溫、低誘導劑濃度的誘導策略進行。分別將E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1和E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR單菌落接種至4 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h,2%接種量轉接至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)2.5 h,加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,16 ℃、200 r/min誘導培養(yǎng)20 h;取10 mL菌液于8 000 r/min、4 ℃離心5 min,收集菌體,重懸后進行超聲破碎,并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析[29]。

    1.3.3 酶活性分析

    DMDH氧化活性:以D-扁桃酸為底物,以NADH生成量為標準計算。MR活性:以L-扁桃酸為底物,根據(jù)文獻[7]用HPLC法測定D-扁桃酸的生成量,以此計算酶的消旋活性。L-LeuDH還原活性:以苯乙酮酸為底物、NADH為輔酶,加上合適的HN4+,30 ℃條件下用紫外分光光度計檢測340 nm波長處吸光度的變化量[21]。

    1.3.4 重組大腸桿菌全細胞轉化D,L-扁桃酸合成L-苯甘氨酸

    取50 mL上述誘導后的重組大腸桿菌E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-

    ArMR,4 ℃、8 000 r/min離心5 min,收集菌體,重懸于10 mL 500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O緩沖液中(pH 9.5),50 mmol/LD,L-扁桃酸,溫度30 ℃,反應48 h后取1 mL轉化液于8 800×g離心1 min,取上清液,稀釋100 倍后用0.22 μm的濾膜進行過濾,最后用HPLC法檢測L-苯甘氨酸含量。

    1.3.5L-苯甘氨酸的定性分析

    先對產(chǎn)物進行普通C18柱的HPLC分析,HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱,檢測波長215 nm,柱溫30 ℃,流動相為甲醇-水(20∶80,V/V),流速1 mL/min。然后,利用Chirobiotic T手性柱對產(chǎn)物及L-苯甘氨酸標準品進行HPLC分析,流動相為甲醇-水-三氟乙酸(20∶80∶0.1,V/V),流速0.5 mL/min,檢測波長254 nm,柱溫30 ℃,以此計算產(chǎn)物中L-苯甘氨酸的e.e.值。根據(jù)在相同分析條件下,產(chǎn)物在普通Thermo Hypersil C18柱以及Chirobiotic T手性柱中的保留時間,與L-苯甘氨酸標準品的保留時間對比,對產(chǎn)物進行初步的定性分析。最后,將底物和產(chǎn)物委托基云(上海)生物技術有限公司,利用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL高分辨質譜系統(tǒng)進行分析,進一步基于質荷比對其進行定性分析。

    1.3.6L-苯甘氨酸的定量分析

    將L-苯甘氨酸標準品用超純水分別配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的溶液,然后分別取20 μL進行HPLC分析,獲得各濃度L-苯甘氨酸的峰面積后,進行線性擬合獲得回歸方程及相關系數(shù)。HPLC色譜柱為Thermo Hypersil C18柱,檢測波長215 nm,柱溫30 ℃,流動相為甲醇-水(20∶80,V/V),流速1 mL/min。待檢樣品產(chǎn)物按照同樣的條件進行HPLC分析,根據(jù)測得的峰面積可以由回歸方程計算出相應的樣品濃度。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

    圖片均用Adobe Photoshop CS 8.0軟件進行色階、對比度調節(jié)及標注等處理,圖片中所用的化學式采用ChemDraw Ultra 8.0進行繪制。簡單的數(shù)據(jù)處理及分析均借助Origin 9進行。

    2 結果與分析

    2.1 重組大腸桿菌的構建

    按照1.3.1節(jié)方法將質粒pETDuet-1-EsLeuDH和pACYCDuet-1進行雙酶切,酶切后的EsLeuDH和pACYCDuet-1經(jīng)電泳分離和割膠回收,再用DNA連接試劑盒連接后轉化E. coliBL21感受態(tài)細胞,經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選獲得陽性重組子。挑取陽性重組子用通用引物進行PCR檢測,結果如圖2A所示,片段長度約1 400 bp,大小與預期相符。進一步提取質粒進行雙酶切驗證,結果如圖2B所示,能夠釋放出與EsLeuDH長度一致的目的片段(約1 200 bp)。將經(jīng)PCR檢測和酶切驗證的重組子送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,結果表明EsLeuDH的序列及在載體上的插入位置與預期的完全一致,表明成功獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組菌。

    圖2 E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH重組子的菌液PCR檢測(A)及雙酶切驗證(B)Fig. 2 PCR detection and double digestion detection of recombinant E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH

    同樣按照1.3.1節(jié)方法將質粒pET28a-LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH進行雙酶切,酶切后的LhDMDH和pACYCDuet-1-EsLeuDH經(jīng)電泳分離和割膠回收,再用DNA連接試劑盒連接后轉化E. coliBL21感受態(tài)細胞,經(jīng)氯霉素抗性LB平板篩選獲得陽性重組子。挑取陽性重組子用通用引物進行PCR檢測,結果如圖3A所示,片段長度約1 300 bp,大小與預期相符。進一步提取質粒進行雙酶切驗證,結果如圖3B所示,能夠釋放出與LhDMDH長度一致的目的片段(約1 100 bp)。將經(jīng)PCR檢測和酶切驗證的重組子送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,結果顯示LhDMDH的序列及在載體上的插入位置與預期完全一致,表明成功獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組菌。最后,將pET28a-ArMR質粒轉化至E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH感受態(tài)細胞,經(jīng)卡拉霉素和氯霉素雙抗性篩選,獲得E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR重組菌。重組菌連續(xù)在無抗LB培養(yǎng)基上傳代10 次,接種至含卡拉霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng),生長狀況良好,表明該重組菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性,攜帶的雙質粒在傳代過程不會發(fā)生質粒不相容的現(xiàn)象。

    圖3 E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH重組子的菌液PCR檢測(A)及雙酶切驗證(B)Fig. 3 PCR detection and double digestion verification of recombinant E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH

    2.2 重組大腸桿菌的誘導表達及鑒定

    分別將E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1、E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH和E. coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR菌株按照1.3.2節(jié)方法進行誘導表達,將誘導后的菌液取10 mL離心收集,經(jīng)重懸和超聲破碎后進行SDSPAGE及酶活性分析。如圖4所示,E. coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR的裂解上清液在38 kDa和40~43 kDa處有明顯的特異性條帶,分別與LhDMDH、EsLeuDH[20]和ArMR的理論分子質量一致,表明3 個目標酶均成功實現(xiàn)可溶性表達。結果顯示,經(jīng)換算后,發(fā)酵液中的LhDMDH、EsLeuDH和ArMR活性分別為195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。酶活性測定結果進一步表明,借助雙質粒共表達系統(tǒng),實現(xiàn)了3 個目標酶有活性形式的共表達。

    圖4 重組大腸菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE profile of the expression products of recombinant E. coli

    2.3 L-苯甘氨酸標準品及底物的HPLC分析

    按照1.3.6節(jié)方法,將分析純的L-苯甘氨酸在Thermo Hypersil C18柱上進行HPLC分析,在該分析條件下,L-苯甘氨酸的保留時間約為3.43 min(圖5A),將L-苯甘氨酸不同濃度值對相應的峰面積進行線性擬合,獲得的L-苯甘氨酸的標準曲線,得出L-苯甘氨酸濃度對應的回歸方程為y=0.000 2x-0.011,相關系數(shù)為0.999 0,結果表明在該HPLC分析條件及濃度范圍下,L-苯甘氨酸濃度與峰面積呈良好線性相關,因此,利用此法可以對L-苯甘氨酸進行精確定量分析。同樣條件下對底物D,L-扁桃酸進行HPLC分析,底物的保留時間約為2.33 min(圖5B),這也說明D,L-扁桃酸的極性明顯大于L-苯甘氨酸。同時,由于受D,L-扁桃酸極性的影響,且它的pH值比L-苯甘氨酸高,在與L-苯甘氨酸同樣的分析條件下不利于其有效分離,因此D,L-扁桃酸的色譜峰始終不能對稱(呈三角形)。而這一現(xiàn)象對產(chǎn)物鑒定的影響不大,且在與產(chǎn)物共存時,D,L-扁桃酸的色譜峰反而能呈現(xiàn)較好的對稱性。

    圖5 L-苯甘氨酸(A)及D,L-扁桃酸(B)在Thermo Hypersil C18柱上的HPLC分析Fig. 5 HPLC profiles of L-phenylglycine (A) and D,L-mandelic acid (B) on Thermo Hypersil C18 column

    2.4 重組大腸桿菌全細胞催化D,L-扁桃酸合成L-苯甘氨酸

    按照1.3.4節(jié)方法對D,L-扁桃酸進行全細胞催化的生物轉化。在D,L-扁桃酸的初始濃度為50、500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O緩沖液(pH 9.5)的條件下,180 r/min、30 ℃反應48 h后,反應產(chǎn)物經(jīng)過離心取樣稀釋100 倍后,按照1.3.4節(jié)方法進行HPLC分析,結果如圖6所示。在保留時間約為3.43 min的位置有明顯特征峰,它與相同分析條件下L-苯甘氨酸的保留時間一致(圖5A),表明在該反應條件下有L-苯甘氨酸的生成,經(jīng)過計算其得率約為77.48%,較低的得率及底物濃度有待下一步對反應條件進行優(yōu)化。

    圖6 催化產(chǎn)物在Thermo Hypersil C18柱上的HPLC分析Fig. 6 HPLC profile of catalytic products on Thermo Hypersil C18 column

    將底物及純化產(chǎn)物送至基云(上海)生物技術有限公司進行高分辨質譜分析,結果如圖7、8所示。在圖7中,由質荷比可以推出物質的分子式可能為C8H8O3Na+[M+Na]+,表明該物質是C8H8O3(扁桃酸)結合了1 個Na+;在圖8中,由質荷比可以推出物質的分子式可能為C8H10NO2+[M+H]+,表明該物質是C8H9NO2(苯甘氨酸)結合了一個H+。

    圖7 底物的高分辨質譜分析Fig. 7 High-resolution mass spectrum of the substrate

    圖8 產(chǎn)物的高分辨質譜分析Fig. 8 High-resolution mass spectrum of the product

    圖9 L-苯甘氨酸(A)及D-苯甘氨酸(B)在Chirobiotic T手性C18柱上的HPLC分析Fig. 9 HPLC profiles of L-phenylglycine (A) and D-phenylglycine (B)on Chirobiotic T chiral C18 column

    用Chirobiotic T手性柱參照1.3.5節(jié)方法對L-苯甘氨酸、D-苯甘氨酸及純化產(chǎn)物進行手性柱的HPLC分析,L-苯甘氨酸和D-苯甘氨酸的保留時間分別約為7.40 min和8.91 min(圖9),大部分產(chǎn)物的保留時間在7.40 min左右(圖10),在8.91 min左右的峰面積較小。結合普通C18柱HPLC分析及高分辨質譜的分析結果,進一步表明該級聯(lián)反應的終產(chǎn)物主要為L-苯甘氨酸,且其e.e.值大于99%,該級聯(lián)反應具有較高的對映體選擇性。本研究與Liu Qiaoli等[14]設計的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共表達體系相比較,不需要額外添加甲酸鈉之類的輔底物,另外,外消旋扁桃酸相對苯乙酮酸來說也更廉價、更易得,具有更大的產(chǎn)業(yè)化應用前景。

    圖10 純化產(chǎn)物在Chirobiotic T手性C18柱上的HPLC分析Fig. 10 HPLC profile of purified product on Chirobiotic T chiral C18 column

    3 討 論

    隨著酶工程技術的發(fā)展,利用2 個或更多酶進行多酶級聯(lián)反應在手性純的化學品的合成中更受青睞[30]。通常這些級聯(lián)反應可以用全細胞、細胞裂解液或游離酶作催化劑。與其他2 個相比,全細胞催化具有更多的優(yōu)點,包括催化劑更穩(wěn)定、更易回收利用,在一些氧化還原反應中無需添加輔酶等。因此,共表達多個酶的全細胞催化已被廣泛用于眾多化學品的生物合成。

    本研究成功構建了攜帶LhDMDH、EsLeuDH和ArMR編碼基因的重組大腸桿菌,重組菌的遺傳穩(wěn)定性良好。經(jīng)誘導表達后,發(fā)酵液中LhDMDH、EsLeuDH和ArMR活性分別為195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。共表達時,3 個酶各自的表達水平與單獨表達時差別不大,進一步表明大腸桿菌具有強大的表達外源蛋白能力。此外,以誘導后的全細胞為催化劑、D,L-扁桃酸為底物,實現(xiàn)了L-苯甘氨酸高對映選擇性的生物合成,在測定條件下L-苯甘氨酸的得率可達77.48%,e.e.值大于99%。與Liu Qiaoli等[14]設計的亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共表達體系相比,不需要額外的添加甲酸鈉之類的輔底物,另外,D,L-扁桃酸相對苯乙酮酸也更廉價、更易得,具有更大的產(chǎn)業(yè)化應用前景。本研究具有較大的產(chǎn)業(yè)化潛力,為實現(xiàn)L-苯甘氨酸規(guī)?;纳锖铣傻於藞詫嵉幕A。

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