基于MnO2納米片類氧化酶特性的有機(jī)磷農(nóng)藥熒光分析方法建立

羅 林，鄧楚瑤，賈寶珠，林豪紅，廖彩霞，吳卓裕，何鎮(zhèn)熹，王 弘，徐振林,*

（1.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303）

農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用已成為確?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)豐收高產(chǎn)的必要條件之一，但是，由此產(chǎn)生農(nóng)藥殘留所引發(fā)的生態(tài)環(huán)境污染、食品安全問(wèn)題也日益嚴(yán)重[1]。有機(jī)磷農(nóng)藥是一類含3 個(gè)磷酯鍵、當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。在我國(guó)，有機(jī)磷農(nóng)藥的用量約占農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑總量的70%[2]。世界各國(guó)從本國(guó)的利益和食品安全的角度出發(fā)，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留要求和限制日益嚴(yán)格，這也要求有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)不斷更新，向更快、更準(zhǔn)的方向發(fā)展[3]。

檢測(cè)農(nóng)藥殘留的技術(shù)目前較為常見(jiàn)的有色譜法、免疫法、酶抑制劑法等[4-8]。色譜法如氣相色譜、液相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用的方法靈敏度、準(zhǔn)確度高，但需要昂貴儀器、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、需要專業(yè)操作人員、檢測(cè)成本高，不適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩查；免疫法對(duì)抗體的性能要求較高，有些農(nóng)藥小分子由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，免疫特性差難以獲得滿意的抗體；酶抑制法具有檢測(cè)快、成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，但是傳統(tǒng)酶抑制法是基于可見(jiàn)光吸收比色測(cè)定，存在靈敏度差（mg/kg級(jí)別），假陰性風(fēng)險(xiǎn)高，難以滿足檢測(cè)需求等問(wèn)題[2]。因此，開(kāi)發(fā)高靈敏度、快速簡(jiǎn)便檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的新方法顯得尤為重要。

過(guò)渡金屬硫化物是一類由IV、V和VI族元素的過(guò)渡元素與硫?qū)僭亟M成類石墨烯納米材料，具有超薄的二維平面結(jié)構(gòu)、高比表面積及突出的電子傳遞特性，已成為當(dāng)前材料科學(xué)及傳感分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[9-11]。MnO2納米片作為過(guò)渡金屬硫化物家族重要的一員，在紫外-可見(jiàn)光有寬的吸收范圍（300～600 nm）和較高的摩爾吸光系數(shù)，因此具有熒光猝滅特性可作為熒光猝滅劑[12]。與此同時(shí)，MnO2納米片具有類氧化酶特性，可氧化多種還原劑，如抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽。鑒于此，研究者們利用MnO2納米片構(gòu)建了多種檢測(cè)這些還原劑的熒光分析方法。Deng Renren等[13]首次將MnO2納米片作為熒光納米猝滅劑構(gòu)建了快速檢測(cè)谷胱甘肽的熒光分析方法。在該方法中MnO2納米片同時(shí)作為谷胱甘肽的識(shí)別材料及上轉(zhuǎn)換納米粒子的猝滅劑?；陬愃茩C(jī)理，Yan Xu等[14]以石墨烯量子點(diǎn)-MnO2納米片作為熒光探針構(gòu)建檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的熒光傳感平臺(tái)。Liu Juanjuan等[15]設(shè)計(jì)了基于MnO2納米片修飾的熒光碳點(diǎn)的混合體系，并將其用于食品中抗壞血酸檢測(cè)。此外，MnO2納米片作為氧化酶類似物，還可以用于建立檢測(cè)酶聯(lián)免疫分析方法及快速檢測(cè)堿性磷酸酶活性的熒光分析方法[16-18]?？傊?，利用MnO2納米片構(gòu)建新型傳感分析平臺(tái)方面引起了越來(lái)越多的關(guān)注[19]。

本研究利用MnO2納米片的優(yōu)異類氧化酶特性及熒光分析方法的高敏感性結(jié)合酶抑制原理構(gòu)建一種快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的熒光分析方法，其原理如圖1所示：鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）可被MnO2催化氧化生成熒光物質(zhì)2,3-二氨基吩嗪（2,3-diaminophenazine，DAP）。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）可催化水解底物硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine，ATCh）生成硫代膽堿（thiocholine，TCh），產(chǎn)物TCh可還原降解MnO2納米片生成Mn2+，而Mn2+對(duì)OPD沒(méi)有氧化能力。當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥存在時(shí)AChE酶活性受到抑制，從而阻止TCh的生成及MnO2納米片的分解。因此，通過(guò)測(cè)定體系熒光強(qiáng)度變化，可以檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的含量。

圖1 有機(jī)磷農(nóng)藥熒光分析方法原理圖Fig. 1 Schematic diagram illustrating the principle of fluorescence analysis of organophosphorus pesticides

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AChE、對(duì)氧磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液 廣州齊湘生物科技有限公司；碘代ATCh 上海源葉生物科技有限公司；OPD 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

OSB-2200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、CA-1116AS型循環(huán)裝置EYELA東京理化器械株式會(huì)社；SpectraMax i3x多功能微孔板檢測(cè)平臺(tái) 美谷分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MnO2納米片的合成

參照文獻(xiàn)[20]的方法制備MnO2納米片，將0.1 mol/L十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sufate，SDS）溶液32 mL和0.1 mol/L的H2SO4溶液1.6 mL加入到283.2 mL蒸餾水中，并首先在95 ℃加熱15 min。然后將0.05 mol/L的KMnO4溶液3.2 mL迅速加入到SDS溶液中，開(kāi)始反應(yīng)，將反應(yīng)混合物加熱60～90 min，直到反應(yīng)液變無(wú)色透明并有棕色沉淀生成，停止加熱待自然冷卻后，4 000 r/min以上離心10～15 min，并用超純水和乙醇重復(fù)洗滌2～3 次沉淀。純化后的MnO2納米片加入超純水重新懸浮并超聲30 min得到MnO2納米片膠體懸浮溶液，并稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL備用。

1.3.2 檢測(cè)體系的優(yōu)化

AChE及ATCh濃度對(duì)檢測(cè)性能的影響：將濃度分別為150、75、37.5、18.75、9.375、4.687 5、2.343 75、1.171 88 U/L和0 U/L的AChE與濃度分別為12、10、8、5、2 mmol/L的ATCh構(gòu)建不同反應(yīng)體系，并測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。采用熒光抑制率與AChE濃度的關(guān)系評(píng)價(jià)不同條件下體系的靈敏度，抑制率按下式計(jì)算：

式中：F0為體系MnO2-OPD時(shí)熒光強(qiáng)度；F1為體系存在不同濃度AChE時(shí)熒光強(qiáng)度。

OPD與MnO2納米片作用時(shí)間對(duì)檢測(cè)性能的影響：以上述優(yōu)化的AChE及ATCh質(zhì)量濃度及1 mg/mL的OPD與0.5 mg/mL的MnO2納米片構(gòu)建反應(yīng)體系，測(cè)定熒光抑制率與OPD與MnO2納米片作用時(shí)間的關(guān)系。

1.3.3 對(duì)氧磷的檢測(cè)

取50 μL樣品或不同濃度的對(duì)氧磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和50 μL AChE（9.375 mU/mL）混合，38 ℃孵育30 min。然后，在該溫度下加入40 μL的ATCh（10 mmol/L）和60 μL的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 8.5，10 mmol/L）38 ℃孵育20 min，接著加入40 μL的MnO2納米片（0.5 mg/mL）與50 μL的OPD溶液（1 mg/mL），振蕩混勻11 min后，利用多功能微孔板讀數(shù)平臺(tái)，熒光分析模塊，在波長(zhǎng)430 nm激發(fā)下，測(cè)定反應(yīng)體系在波長(zhǎng)570 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度，激發(fā)光狹縫寬9 nm，發(fā)射光狹縫寬15 nm。

1.3.4 樣品前處理及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

自來(lái)水樣品：自來(lái)水樣品取自本實(shí)驗(yàn)室。取10 mL水樣經(jīng)過(guò)微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾，后加入10 mL PBS（20 mmol/L，pH 8.5），并分別添加2、10、50 ng/mL對(duì)氧磷標(biāo)準(zhǔn)品，然后通過(guò)建立的熒光分析方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算添加回收率。

燕麥與蔬菜樣品：取1 g樣品用研缽研碎，并按2、10、20 ng/g 3 個(gè)水平添加對(duì)氧磷標(biāo)準(zhǔn)品，過(guò)夜后與20 mL乙腈混合并超聲提取10 min，然后以4 000 r/min離心10 min。將上清液（10 mL）通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾并旋蒸。將剩余物用10 mL含10%甲醇的PBS溶解，然后通過(guò)建立的熒光分析方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算添加回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2017軟件繪制結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MnO2納米片的合成與表征

本研究以KMnO4和SDS為原料，通過(guò)氧化還原反應(yīng)合成超薄MnO2納米片。如圖2A所示，MnO2納米片的橫向平均長(zhǎng)度在100 nm左右，表明MnO2的納米結(jié)構(gòu)提供了很大的表面積供OPD反應(yīng)。圖2B顯示MnO2納米片的紫外-可見(jiàn)光譜一般以寬吸收帶（300～600 nm）為特征，其特征吸收位于380 nm左右。圖2C可以看到，在529.6 eV和641.9 eV有2 個(gè)明顯峰，表明樣品中存在O1s與Mn2p。Mn2p的精細(xì)譜顯示有2 個(gè)分別屬于Mn2P3/2和Mn2P1/2峰，分別位于642.0 eV和653.9 eV（圖2D）。這些結(jié)果與文獻(xiàn)[20]得出的MnO2納米片圖像基本一致，表明MnO2納米片制備成功。

圖2 MnO2納米片的透射電鏡圖（A）、紫外吸收光譜（B）、X射線能譜全譜（C）和Mn2p譜（D）Fig. 2 TEM image (A), UV absorption spectrum (B), high-resolution XPS spectrum (C), and Mn2p spectrum (D) of MnO2 nanosheets

2.2 方法可行性驗(yàn)證

圖3 不同成分下反應(yīng)體系的熒光光譜圖變化情況（A）、不同質(zhì)量濃度MnO2納米片與OPD反應(yīng)生成DAP熒光強(qiáng)度的關(guān)系（B）和MnO2納米片在與AChE/ATCh作用下紫外-可見(jiàn)光譜變化情況（C）Fig. 3 Fluorescence spectra of reaction systems with different compositions (A), relationship between fluorescence intensity and concentration of manganese dioxide nanosheets (B), and UV absorptionspectra MnO2 nanosheets under the action of AChE/ATCh

MnO2納米片具有類氧化酶特性可氧化常見(jiàn)氧化酶底物四甲基聯(lián)苯胺顯色已有報(bào)道[17,21]。本研究將MnO2納米片和另一種常見(jiàn)氧化酶底物OPD混合后生成在波長(zhǎng)570 nm處出現(xiàn)強(qiáng)特征峰熒光物質(zhì)（如圖3A a線所示），這與氧化酶催化OPD生成的熒光物質(zhì)DAP的發(fā)射峰一致[12]，再一次驗(yàn)證MnO2納米片的類氧化酶活性。并且MnO2納米片質(zhì)量濃度在0.007 8～1 mg/mL范圍內(nèi)與OPD反應(yīng)，其質(zhì)量濃度與生成DAP的熒光強(qiáng)度呈正比且線性很好（R2=0.997）（圖3B）。AChE的酶解產(chǎn)物TCh與谷胱甘肽均含有巰基有還原性可以使MnO2納米片降解，從而阻止OPD氧化。通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜驗(yàn)證（圖3C），當(dāng)體系含有AChE與底物ATCh時(shí)，MnO2納米片在波長(zhǎng)380 nm處的吸收峰明顯降低，表明酶解產(chǎn)物TCh可使MnO2納米片降解為Mn2+。熒光光譜圖3A顯示僅加入AChE后體系熒光值基本不變（圖3A b線），而加入AChE與ATCh后體系，由于AChE催化底物ATCh產(chǎn)生TCh，TCh含有巰基具有還原性會(huì)分解MnO2納米片，從而阻止OPD氧化，體系熒光值大幅度下降（圖3A c線），而加入對(duì)氧磷后，體系的熒光值又重新增大（圖3A d線），這是因?yàn)閷?duì)氧磷抑制了AChE的活性，導(dǎo)致AChE無(wú)法催化ATCh生成TCh，從而無(wú)法分解MnO2納米片。這些結(jié)果表明本方法原理完全可行。

2.3 方法條件的優(yōu)化

圖4 不同AChE及ATCh濃度下體系熒光抑制率變化情況Fig. 4 Changes in fluorescence inhibition rate of different systems at different concentrations of AChE and ATCh

作為酶抑制法的核心試劑AChE的濃度及底物ATCh濃度不僅關(guān)乎檢測(cè)性能，還與檢測(cè)成本直接掛鉤。因此，有必要對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。由圖4所示，當(dāng)AChE濃度高于9.375 U/L，熒光抑制率增長(zhǎng)速率變緩慢，當(dāng)濃度高于18.75 U/L時(shí)，熒光抑制率變化趨于平緩接近100%。因此，9.375 U/L為AChE的最優(yōu)濃度。而ATCh的濃度在2～12 mmol/L范圍內(nèi)對(duì)熒光抑制率變化趨勢(shì)影響不大。因此，綜合考慮ATCh用量盡量小，檢測(cè)靈敏度盡量高的條件。由圖4可知，ATCh 10 mmol/L時(shí)，熒光抑制率變化斜率最大，故選擇10 mmol/L為ATCh的最佳濃度。

圖5 MnO2納米片與OPD反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化Fig. 5 Optimization of reaction time of MnO2 nanosheets with OPD

以最優(yōu)的AChE及ATCh濃度及1 mg/mL OPD與0.5 mg/mL MnO2納米片構(gòu)建反應(yīng)體系，測(cè)定熒光抑制率與OPD、MnO2納米片作用時(shí)間的關(guān)系。由圖5可以看出，隨著MnO2納米片和OPD反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光抑制率逐漸增大，而且增加的速度是由快變慢最后趨于穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為11 min時(shí)，抑制率的增加開(kāi)始變得極為緩慢，說(shuō)明11 min正是MnO2納米片與OPD最佳的反應(yīng)時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在最優(yōu)條件下構(gòu)建MnO2-OPD-AChE-ATCh的反應(yīng)體系，并向其中加入分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng/mL的對(duì)氧磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定體系熒光強(qiáng)度，以熒光恢復(fù)效率（F2-F1）/（F0-F1）為縱坐標(biāo)，對(duì)氧磷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中F2表示不同質(zhì)量濃度的對(duì)氧磷溶液測(cè)得的熒光值，F(xiàn)1表示不添加對(duì)氧磷所測(cè)得的熒光值，F(xiàn)0表示既不添加對(duì)氧磷也不添加AChE所測(cè)得的熒光值。以四參數(shù)邏輯方程擬合得：（F2-F1）/（F0-F1）={-1.347/[1+（X/121.3）0.871]}+1.475，（R2=0.998），檢出限為0.5 ng/mL（RSN=3）。如表1所示，與其他方法比較，本研究建立的熒光分析方法具有較好的檢測(cè)性能，可用于對(duì)氧磷的靈敏檢測(cè)。

表1 不同有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方法檢測(cè)性能比較Table 1 Performance comparison among different OPs detection methods

2.5 方法的加標(biāo)回收率及精密度

為證明方法的準(zhǔn)確性，選用3 種樣品，自來(lái)水、卷心菜和燕麥進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。如表2所示，3 個(gè)樣品的3 個(gè)添加水平50、10、2 ng/mL所得加標(biāo)回收率在83.4%～105.9%之間，變異系數(shù)低于8.9%，表明所建立的方法具有較好的準(zhǔn)確性及精密度，可用于食品中對(duì)氧磷的檢測(cè)分析。

表2 不同樣品的添加回收情況Table 2 Recoveries of paraoxon spiked into different samples by the proposed method

3 結(jié) 論

本研究受MnO2納米片類氧化酶特性的啟發(fā)，構(gòu)建一種快速、簡(jiǎn)便、高靈敏的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)氧磷的熒光分析方法。MnO2納米片能夠催化氧化典型的氧化酶底物OPD產(chǎn)生熒光物質(zhì)DAP，在波長(zhǎng)570 nm處有熒光發(fā)射峰。而AChE催化底物ATCh產(chǎn)TCh可以使MnO2納米片降解Mn2+進(jìn)而抑制OPD氧化，使體系熒光強(qiáng)度減弱，而有機(jī)磷農(nóng)藥可使AChE酶活性抑制從而使體系熒光增強(qiáng)。在最優(yōu)條件下，該方法對(duì)對(duì)氧磷動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍在1.56～200 ng/mL之間，檢出限為0.5 ng/mL。對(duì)自來(lái)水、卷心菜、燕麥的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在83.4%～105.9%之間，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性。本研究說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)已成功構(gòu)建一種快速、簡(jiǎn)便、高靈敏的有機(jī)磷農(nóng)熒光免疫分析方法。本研究構(gòu)建了基于MnO2納米片（模擬酶）與AChE的“雙酶”體系，提升有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度，也為模擬酶在食品安全檢測(cè)中應(yīng)用提供了新的思路。