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    基于子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)

    2021-01-20 10:44:24陸嘉逢楊祖冒燕薛永峰孔令印王挺梁波
    婦產(chǎn)與遺傳(電子版) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層磁珠子宮頸

    陸嘉逢 楊祖 冒燕 薛永峰 孔令印 王挺 梁波

    近年來,利用母體外周血中的胎兒游離DNA進(jìn)行高通量測(cè)序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(noninvasive prenatal testing,NIPT)逐漸興起。利用母體外周血游離胎兒DNA片段進(jìn)行產(chǎn)前診斷的前提是胎兒游離DNA 含量必須大于母體血漿總游離DNA 的4%,而胎兒游離DNA含量受孕周、母體體重和胎兒頂臀長(zhǎng)度的影響[1-2]。同時(shí),由于樣本中包括大量母體DNA 及胎兒基因組信息不完整,檢測(cè)結(jié)果會(huì)有一定的假陽性或者假陰性,因此該技術(shù)的臨床定位是進(jìn)行胎兒染色體非整倍體篩查,對(duì)于陽性結(jié)果需要借助羊膜穿刺(amniocentesis)或絨毛活檢(chorionic villus sampling,CVS)進(jìn)行確診[3]。

    19 世紀(jì)70 年代,Shettles LB[4]和Rhine SA[5]等先后從宮頸分泌物中檢測(cè)到男性胎兒的Y 染色體,隨著熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridiza?tion,F(xiàn)ISH)技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,證實(shí)了母體宮頸分泌物中確實(shí)含有胎兒的遺傳物質(zhì)。隨著免疫熒光、二代測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及Bol?nick在2014年報(bào)道一種利用免疫磁珠分離法從脫落宮頸細(xì)胞中分離出胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法,即TRIC,使得利用子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷成為可能。與母體外周血游離胎兒DNA 片段相比,利用子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法具有簡(jiǎn)便易行、可獲得細(xì)胞數(shù)量多、形態(tài)學(xué)識(shí)別容易等優(yōu)點(diǎn),具備開發(fā)為早期無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的潛質(zhì)。當(dāng)樣本中胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞比例達(dá)到90%以上時(shí),DNA 質(zhì)量可以與羊膜穿刺或CVS 獲得的DNA相媲美。本研究將TRIC 方法與全基因組測(cè)序方法結(jié)合,進(jìn)行胎兒染色體異常的分析,為子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷提供參考。

    材料和方法

    一、研究對(duì)象

    樣本來源:選擇2018 年1 月到2018 年5 月就診于蘇州市立醫(yī)院,自然受孕、要求終止妊娠的孕婦,孕5~20 周。本研究得到蘇州市立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批文號(hào):K-2018-019-H01),并與受試者簽署臨床研究知情同意書。

    樣本選取標(biāo)準(zhǔn):(1)婦科檢查及B 超證實(shí)為早孕,孕周在5~20 周;(2)取樣前未同房。按照以上標(biāo)準(zhǔn),共選取10例孕婦,年齡20 ~40歲。

    二、實(shí)驗(yàn)方法和步驟

    1.樣本采集和處理

    利用宮頸刷獲取宮頸管脫落細(xì)胞,然后將標(biāo)本置于20 mL PreservCyt(Holigic)溶液中。將含有20 mL PreservCyt 溶 液 的 標(biāo) 本,4 ℃400×g 離 心5 min,棄上清。加入10 mL 磷酸鹽緩沖液(phos?phate buffered saline,PBS),4 ℃400×g 離心5 min,棄上清;重復(fù)清洗3 次;加入10 mL PBS 重懸細(xì)胞,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光檢測(cè)

    10例樣本稀釋成200 μL PBS中含有50 ~100個(gè)細(xì)胞,手工涂片。在涂片區(qū)域,加入10 μg/mL β-HCG 一抗,4℃孵育過夜。次日洗片,加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記的二抗孵育1 h。洗片后加入4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)及防熒光淬滅封片劑,避光保存。熒光顯微鏡觀察樣本中是否存在陽性細(xì)胞。

    3.子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離及鑒定

    選取含有陽性細(xì)胞的樣本進(jìn)行陽性細(xì)胞分選,分選方法如下:在20 μL 含有250 nm 羊抗小鼠IgG磁性納米顆粒的混合液中補(bǔ)充無菌PBS 至100 μL,然后加入5 μg 小鼠人類白細(xì)胞抗原-G (human leucocyte antigen-G,HLA-G)抗體,混勻,4 ℃孵育過夜。使用DynaMa-旋轉(zhuǎn)磁力架,PBS 清洗磁珠顆粒三次。用1.5 mL PBS 懸起子宮頸細(xì)胞,加入抗HLA-G 偶聯(lián)磁珠,4℃混合孵育過夜。用磁力架結(jié)合HLA-G 陽性細(xì)胞,收集未結(jié)合的細(xì)胞,并用PBS 清洗3 次。分別回收HLA-G 結(jié)合陽性細(xì)胞(胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞)和陰性細(xì)胞(母體細(xì)胞)。將陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞分別進(jìn)行稀釋,稀釋后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),檢測(cè)方法同上述子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞熒光檢測(cè)。

    4.熒光原位雜交(fluorescence in situ hybrid?ization,F(xiàn)ISH)檢測(cè)

    將HLA-G 陽性細(xì)胞涂片進(jìn)行FISH 檢測(cè)。選用美國(guó)Vysis 公司的染色體技術(shù)探針(chromosome enumeration probe,CEP)。其 中CEP X 用 綠 色 標(biāo)記,CEP Y用橙色標(biāo)記。

    5.全基因組擴(kuò)增

    由于磁珠分選后的細(xì)胞數(shù)量較少,無法通過提取gDNA 進(jìn)行高通量測(cè)序,因此先進(jìn)行細(xì)胞全基因組擴(kuò)增。使用PicoPLEXTMWGA Kit(美國(guó)Rubicon Genomic)對(duì)分選后的細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增:將分選后的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,隨后加入預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,最后加入指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。

    6.全基因組低覆蓋度測(cè)序分析

    取全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物,按照NEB Next dsDNA Fragmentase(NEB 公司產(chǎn)品)試劑盒說明書進(jìn)行片段化,配制反應(yīng)體系:2 μL Reaction buffer,2 μL dsDNA Fragmentase,300 ng 全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物,無核酸酶水補(bǔ)充至20 μL。37 ℃孵育25 min。片段化后的產(chǎn)物按照Ion Plus Fragment Library Kit(Thermo Fisher)說明書進(jìn)行高通量測(cè)序的文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫進(jìn)行上機(jī)測(cè)序模板制備,參照Ion Pi Hi-Q Template OT2 200 Kit(Thermo Fisher)說明書,測(cè)序過程按照Ion Pi Hiq Seq 200 Kit(Thermo Fisher)說明書進(jìn)行。

    7.測(cè)序數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控之后,使用TMAP (Torrent Mapper 4.6)軟件把測(cè)序得到的每個(gè)DNA 片段的堿基序列定位到人類基因組參考序列(NCBI Build37/hg19)上,使用Picard 篩去重復(fù)序列,選擇質(zhì)量值≥10 且長(zhǎng)度≥35 bp 的序列用于下游分析。把每條染色體劃分成200 kb 片段大小的非重疊區(qū)域,進(jìn)而計(jì)算樣本中每個(gè)200 kb 窗口上序列分布比例,過濾掉沒有信號(hào)或者reads 中帶“N”的窗口。最終利用環(huán)狀二元分割算法把每個(gè)200 kb 窗口的序列分布比例與參考數(shù)據(jù)庫中正常樣本進(jìn)行比較分析,得出檢測(cè)樣本相對(duì)于正常樣本某一條染色體區(qū)段的比值即CNV 值;若CNV 值大于0.37,則該染色體區(qū)段可判斷為三體或重復(fù);若比值<0.51,則該區(qū)段可判斷為單體或缺失。

    結(jié) 果

    一、胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞分離與鑒定

    10 例樣本經(jīng)免疫熒光檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)3 例樣本中存在表達(dá)β-HCG 信號(hào)的細(xì)胞,如圖1 所示,左側(cè)為DAPI 藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核信號(hào),中間為FITC 標(biāo)記β-HCG信號(hào),右側(cè)為DAPI和β-HCG組合信號(hào)。

    以上3例樣本采用HLA-G 偶聯(lián)磁珠對(duì)宮頸管脫落細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選,對(duì)HLA-G 陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞分別進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)β-HCG 表達(dá)情況。圖2左側(cè)為DAPI 藍(lán)色標(biāo)記細(xì)胞核信號(hào),中間為FITC 標(biāo)記β-HCG 信 號(hào),右 側(cè) 為DAPI 和β-HCG 組 合 信號(hào)。結(jié)果顯示,HLA-G 陽性細(xì)胞中表達(dá)β-HCG 的細(xì)胞比例增多(圖2,A-C),而HLA-G 陰性細(xì)胞中未檢測(cè)出β-HCG 的表達(dá)(圖2,D-F),表明磁珠分選的陽性細(xì)胞中含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞,但磁珠捕獲的特異性較低。

    二、HLA-G陽性細(xì)胞FISH檢測(cè)

    對(duì)HLA-G 陽性細(xì)胞進(jìn)行FISH 檢測(cè),分別檢測(cè)X 染色體和Y 染色體。表1 為受試者信息,共檢測(cè)3 個(gè)樣本,其中1 例樣本檢測(cè)結(jié)果顯示為男性胎兒(如圖3),另外2 例樣本檢測(cè)結(jié)果顯示為女性胎兒,選取男性胎兒的陽性細(xì)胞進(jìn)行全基因組低覆蓋度測(cè)序。

    表1 受試者信息

    三、陽性細(xì)胞低覆蓋度全基因組測(cè)序分析

    男性胎兒的子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞采用低覆蓋度全基因組測(cè)序分析,該檢測(cè)流程可以檢測(cè)出>4 Mb 的染色體片段缺失和重復(fù),檢測(cè)結(jié)果見圖4,未檢測(cè)到染色體異常。分析結(jié)果顯示性染色體存在嵌合現(xiàn)象,Y 染色體的嵌合比例為20%。這說明磁珠分選后的陽性細(xì)胞中還是混雜了大量的母體細(xì)胞,胎兒細(xì)胞的比例約為20%,磁珠分選的特異性有待進(jìn)一步提高。

    討 論

    子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的來源是由于胎盤的快速擴(kuò)展,滋養(yǎng)層細(xì)胞從胎盤邊緣的基底層侵入子宮腺體及血管,隨著腺分泌物一起進(jìn)入子宮腔,隨后進(jìn)入子宮頸。隨著胎盤的不斷擴(kuò)張,不斷的有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)入宮頸管,在胎盤擴(kuò)張停止后(約20周),子宮頸內(nèi)的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞迅速消失[6]。目前獲取子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法有四種:宮腔灌洗法、宮頸管灌洗法、細(xì)胞刷取樣法、宮頸黏液抽吸法。Gerit Moser等通過觀察1 000例經(jīng)宮頸刷取樣患者妊娠結(jié)局,發(fā)現(xiàn)取樣與否與流產(chǎn)、大出血、和宮腔感染沒有相關(guān)性[6]。宮腔灌洗法雖然可以得到80%~90%的陽性細(xì)胞,但是造成的創(chuàng)傷也較大,對(duì)胎兒存在潛在傷害,其安全性有待進(jìn)一步研究[7]。本研究選用了安全性最高的宮頸刷取樣法,但是結(jié)果表明宮頸刷取樣法獲得胎兒細(xì)胞成功率較低,10 例樣本中僅3 例樣本中觀察到β-HCG 陽性細(xì)胞,后續(xù)研究中可嘗試套管拭子或者雙取器宮頸毛刷法取樣[8-9],提高取樣的成功率。

    HLA-G 是胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞分化并侵入子宮腺體及血管的標(biāo)記,也是區(qū)分胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體細(xì)胞的標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)HLA-G 陽性細(xì)胞中有94%以上呈β-HCG 陽性,HLA-G 陰性細(xì)胞也呈β-HCG陰性,最終得到胎兒基因組含量大于95%的DNA[10]。本研究得到的陽性細(xì)胞中胎兒基因組含量約為20%,低于文獻(xiàn)報(bào)道,需要進(jìn)一步研究提高免疫磁珠分離胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性。

    子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞最初與FISH 和PCR 技術(shù)結(jié)合,用于胎兒性別診斷,正確率從24%到95%不等[11]。隨著STR 分型檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,實(shí)現(xiàn)了在孕早期進(jìn)行準(zhǔn)確的性別診斷和染色體異常的檢測(cè)[12],也可以預(yù)測(cè)異位妊娠和空孕囊[13]。有研究者將顯微切割法和單細(xì)胞測(cè)序結(jié)合,分離出單一的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞用于單基因遺傳疾病的檢測(cè)[14]。Jain等利用分離出的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞,對(duì)全基因組59個(gè)STR 位點(diǎn)和94個(gè)已知的單基因遺傳疾病位點(diǎn)進(jìn)行深度測(cè)序,對(duì)胎兒基因位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析[15]。本研究在前人研究基礎(chǔ)上,利用全基因組低覆蓋度測(cè)序檢測(cè)男性胎兒樣本中的染色體異常,證明利用免疫磁珠法分離出的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞可以與已建立的高通量測(cè)序方法相兼容,實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前胎兒全部染色體拷貝數(shù)變異的檢測(cè)。

    利用脫落的子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷具有無創(chuàng)和早期診斷的優(yōu)勢(shì),發(fā)現(xiàn)異常胎兒可及時(shí)終止妊娠,減輕孕婦心理創(chuàng)傷,且不受妊娠結(jié)局、胎盤病變(如子癇前期)、母體體重指數(shù)、產(chǎn)次及母體年齡的影響[16],可以為臨床提供可靠的胎兒基因組樣品來源。本研究采用的細(xì)胞分離方法操作簡(jiǎn)單,分離出的胎兒細(xì)胞可以在懷孕初期(5 ~20周)進(jìn)行快速精準(zhǔn)的染色體異常檢測(cè)。本研究一個(gè)潛在的局限性是樣本量較少,無法說明檢測(cè)的特異性和靈敏度。另外利用脫落的子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行染色體異常檢測(cè)還受到以下因素的制約:首先,目前沒有分離和鑒定目標(biāo)細(xì)胞的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),不同實(shí)驗(yàn)室得到的陽性細(xì)胞率不等;其次,目前的研究尚無大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照、產(chǎn)前妊娠及活產(chǎn)的隨訪記錄,其臨床準(zhǔn)確性和安全性還有待評(píng)估;最后,目前只能對(duì)單胎妊娠進(jìn)行診斷,多胎妊娠及嵌合體妊娠診斷方案還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

    綜上所述,雖然基于子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)還存在很多問題。相信隨著細(xì)胞分離方法的不斷優(yōu)化以及測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,子宮頸胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞有望發(fā)展成一種安全可靠的產(chǎn)前診斷技術(shù),在孕早期對(duì)全基因組染色體異常、單基因遺傳疾病進(jìn)行診斷。

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