超高效液相色譜儀-四級(jí)桿/靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查及不同酒類中64種非法添加化合物

周楠，黃姍，陳卓，袁利杰，李彤輝

（河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測(cè)所，河南鄭州 450000）

近年來，隨著市場(chǎng)局對(duì)保健食品監(jiān)管力度加大，很多不法商家將非法藥物由保健食品添加[1,2]轉(zhuǎn)向普通食品添加，如配制酒中添加那非類藥物[3-5]、咖啡中添加西布曲明類藥物[6]等。近幾年食藥監(jiān)局對(duì)偏遠(yuǎn)地區(qū)的酒類抽查中發(fā)現(xiàn)，一些不法企業(yè)為了掩蓋劣質(zhì)酒中的雜醇油和胺類等工藝副產(chǎn)物對(duì)人體的不良反應(yīng)，在酒中加入了對(duì)乙酰氨基酚等解熱鎮(zhèn)痛類藥物[7]，對(duì)此，有媒體也進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道。研究表明，解熱鎮(zhèn)痛藥和糖皮質(zhì)激素類藥物濫用會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道以及心血管系統(tǒng)，產(chǎn)生顯著的毒副作用和不良反應(yīng)[8-10]。多種相同效果的藥物同時(shí)作用于人體，會(huì)給消費(fèi)者生命安全造成更嚴(yán)重的危害[11-13]?！吨腥A人民共和國食品安全法》第三十八條明確規(guī)定“生產(chǎn)經(jīng)營的食品中不得添加藥品”[14]。由于缺乏快速有效的檢測(cè)方法，亟需建立酒類樣品中此類非法添加化合物的高靈敏、精確、快速的篩查檢測(cè)方法。

目前檢測(cè)解熱鎮(zhèn)痛類和激素類非法添加化合物的手段主要有薄層色譜法和拉曼光譜法[15]、ELISA檢測(cè)[16]、高效液相色譜法[17,18]、高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[19-22]等。常用的HPLC-MS方法采用低分辨的四級(jí)桿或離子阱，而食品種類繁多，基質(zhì)組分非常復(fù)雜，干擾因素多，容易出現(xiàn)假陽性。Orbitrap高分辨質(zhì)譜法具備超高效液相色譜的高度分離性能及軌道阱高分辨質(zhì)譜的高敏感性和檢測(cè)能力[23-25]，樣品消耗量小，選擇性強(qiáng)，分辨率可達(dá) 100萬以上，質(zhì)量精度可達(dá)10-7～10-6[26,27]，分析速度更快,適用于各種基質(zhì)食品藥品的安全分析[28-31]。

本文將采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查和定量分析方法，以酒類樣本為研究對(duì)象，采用Q-Exactive正負(fù)離子切換模式獲得一級(jí)數(shù)據(jù)，提取目標(biāo)化合物的一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)獲得定性和定量結(jié)果，同時(shí)通過自動(dòng)觸發(fā)獲得的二級(jí)碎片離子數(shù)據(jù)進(jìn)行再次確認(rèn)。該方法快捷、準(zhǔn)確、高通量，可實(shí)現(xiàn)酒類樣本中 64種解熱鎮(zhèn)痛類和激素類非法添加化合物的快速篩查和確證，為以后酒類食品中非法添加化合物的分析測(cè)定提供有效、快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

酒類來源：296批白酒、7批配制酒和3批葡萄酒均來自于2019年河南省地區(qū)國抽抽檢部分樣品。

Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括Ultimate 3000液相泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱以及Orbitrap高分辨質(zhì)譜，Thermo，德國；Mettler XS205電子天平，梅特勒，瑞士；Sigma3-30K高速冷凍離心機(jī)，Sigma，德國；KQ-500 TDB溫控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

氯苯那敏（Chlorpheniramine）、氨基比林（Aminopyrine）、羅通定（Rotundine）、甲氧芐啶（trimethoprim）、非那西?。≒henacetin）、苯海拉明（Diphenhydramine）、異丙安替比林（Propyphenazone）、氟米龍醋酸酯（Fluorometholone acetate）、安替比林（antipyrine）、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole）、甲基潑尼松龍（Methylprednisolone）、曲安奈德（Tramcinoloneacetonide）、曲安西龍雙醋酸酯（Triamcinolone diacetate）、布地奈德（Budesonide）、曲安奈德醋酸酯（Triamcinolone acetonide acetate）、倍他米松戊酸酯（Betamethasone diproionate）、地西泮（diazepam）、保泰松（Phenylbutazone）、潑尼卡酯(Prednicarbate)、氯倍他索丙酸酯（Clobetasol propionate）、倍他米松雙丙酸酯（Betamethasone diproionate）、倍氯米松雙丙酸酯（Beclometasone dipropionate）、對(duì)乙酰氨基酚（Acetaminophen）、美洛昔康（Meloxicam）、吡羅昔康（Piroxicam）、芬布芬（fenbufen）、醋氯芬酸（Aceclofenac）、咖啡因（Caffeine）、潑尼松龍醋酸酯（Prednisolone acetate）、氟輕松醋酸酯（Fluocinonide）、二氟拉松雙醋酸酯（Diflorasonediacetate）、安西奈德（Amcinonide）、阿氯米松雙丙酸酯（Alclomethasone dipropionate）、氟替卡松丙酸酯（Fluticasone propionate）、莫米他松糠酸酯（Mometasone furoate）、氯倍他松丁酸酯（Clobetasone butyrate）、潑尼松龍（Prednisolone）、可的松（Cortisone）、倍他米松（Betamethasone）、地塞米松（Dexamethasone）、氫化可的松丁酸酯（Hydrocortisone butyrate）、氫化可的松戊酸酯（Hydrocortisone valerate）、潑尼松（Prednisone）、氫化可的松（Hydrocortisone）、氟米松（Flumethasone）、倍氯米松（Beclomethasone）、酮洛芬（ketoprofen）、氫化可的松醋酸酯（Hydrocortisone acetate）、氟米龍（Fluoromethalone）、地夫可特（Deflazacort）、潑尼松醋酸酯（Prednisone acetate）、甲基潑尼松龍醋酸酯（Methylprednisolone acetate）、倍他米松醋酸酯（Betamethasone acetate）、地塞米松醋酸酯（Dexamethasone acetate）、甲芬那酸（mefenamic acid）、阿司匹林 (aspirin)、安乃近（analginum）、雙氯芬酸鈉（diclofenac）、吲哚美辛（Indometacin）、氟氫可的松醋酸酯（Fludrocortisone acetate）、曲安西龍（Triamcinolone）、氟氫縮松（Fludroxycortide）、哈西奈德（Halcinonide）、氯唑沙宗（Chlorzoxazone）均購阿爾塔公司 First Standard，以上化合物純度均大于97%。

甲醇、乙腈（色譜純），德國 Merck公司；甲酸（色譜純），美國Sigma公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25 ℃），美國Millipore公司；甲酸銨（質(zhì)譜純），美國Fishier公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品的配制

分別精密稱取上述對(duì)照品各10 mg至10 mL容量瓶，以甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 1 g/L的對(duì)照儲(chǔ)備液。分別精密移取氯苯那敏、氨基比林、羅通定、甲氧芐啶、非那西丁、苯海拉明、異丙安替比林、氟米龍醋酸酯、安替比林、磺胺甲惡唑、甲基潑尼松龍、曲安奈德、曲安西龍雙醋酸酯、布地奈德、曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯、地西泮、保泰松、潑尼卡酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、倍氯米松雙丙酸酯10 μL；對(duì)乙酰氨基酚、美洛昔康、吡羅昔康、芬布芬、醋氯芬酸、咖啡因、潑尼松龍醋酸酯、氟輕松醋酸酯、二氟拉松雙醋酸酯、安西奈德、阿氯米松雙丙酸酯、氟替卡松丙酸酯、莫米他松糠酸酯、氯倍他松丁酸酯、潑尼松龍、可的松、倍他米松、地塞米松、氫化可的松丁酸酯、氫化可的松戊酸酯25 μL；潑尼松、氫化可的松、氟米松、倍氯米松、酮洛芬、氫化可的松醋酸酯、氟米龍、地夫可特、潑尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸酯、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、甲芬那酸50 μL；阿司匹林、安乃近、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、氟氫可的松醋酸酯、曲安西龍、氟氫縮松、哈西奈德、氯唑沙宗250 μL，于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成混合對(duì)照中間溶液。置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑪?shù)據(jù)采集時(shí)用甲醇稀釋至一定的濃度。

1.2.2 樣品的制備

稱取酒樣10.0 g，置于50 mL燒杯中，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容并搖勻，渦旋2 min，超聲30 min，經(jīng)0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾后備用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：C18（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A：5 mmol/L甲酸銨溶液[含0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸]，B：0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，B相保持5%；1～17 min，B相從5%線性升至37%；17～27 min，B相從37%線性升至85%；27～28 min，B相從85%線性升至95%；28～31 min，B相保持95%；31～33 min，B相從95%線性將至5%；33～35 min，B相保持5%。

1.2.4 質(zhì)譜條件

Q Exactive TM質(zhì)譜系統(tǒng)配有HESI源，采用正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，噴霧電壓為3.0 kV（正離子模式）和2.5 kV（負(fù)離子模式），毛細(xì)管溫度和噴霧溫度分別為350 ℃和250 ℃。鞘氣流速為：35 Arb，輔助氣流速為：15 Arb，S-lensRF電壓為50 V。質(zhì)譜掃描方式為Full MS/dd-MS2模式。Full MS（一級(jí)質(zhì)譜全掃描）分辨率設(shè)為70000FWHM，質(zhì)譜掃描范圍為150～600m/z，自動(dòng)增益控制（AGC）1.0 e5、最大注入時(shí)間（IT）50 ms；dd-MS2（數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描）分辨率設(shè)為17500FWHM，AGC設(shè)為1.0 e5，IT設(shè)為50 ms，Isolation window設(shè)為4.0m/z，Intesity threshold設(shè)為1.6 e4，同位素排除設(shè)為“on”，動(dòng)態(tài)排除設(shè)為10.0 s。各化合物的步進(jìn)歸一化碰撞能量（NCE）統(tǒng)一設(shè)為20、40、60。64種化合物的一級(jí)質(zhì)譜信息及二級(jí)質(zhì)譜信息見表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

通過全掃描獲得64種化合物的質(zhì)譜圖，得到保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)等信息，同時(shí)載入相應(yīng)的二級(jí)碎片離子數(shù)據(jù)信息，利用Trace finder軟件建立目標(biāo)化合物的數(shù)據(jù)庫，對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物進(jìn)行定性篩查，確定化學(xué)成分。以母離子作為定量離子，采用外標(biāo)法定量。

表1 64種化合物質(zhì)譜信息Table 1 Mass parameters for the 64 kinds of compounds

40 地塞米松 C22H29FO5 24.63 [M+H]+ 393.20718 393.20823 2.7 147.08066,355.19052 41 氫化可的松丁酸酯 C25H36O6 26.45 [M+H]+ 433.25847 433.25894 1.1 121.06507,345.20642 42 氫化可的松戊酸酯 C26H38O6 27.24 [M+H]+ 447.27412 447.27435 0.5 121.06507,345.20612 43 潑尼松 C21H26O5 22.85 [M+H]+ 359.18530 359.18539 0.3 147.08067,341.17517 44 氫化可的松 C21H30O5 23.55 [M+H]+ 363.21660 363.21683 0.6 121.06506,105.07015 45 氟米松 C22H28FO5 24.34 [M+H]+ 411.19766 411.19755 0.3 253.12262,121.06505 46 倍氯米松 C22H29ClO5 24.86 [M+H]+ 409.17763 409.17685 1.9 391.16739,147.08075 47 酮洛芬 C16H14O3 25.10 [M+H]+ 255.10157 255.10196 1.5 105.03381,209.09650 48 氫化可的松醋酸酯 C23H31FO6 24.83 [M+H]+ 405.22717 405.22699 0.4 327.19589,309.18530 49 氟米龍 C22H29FO4 25.14 [M+H]+ 377.21226 377.21353 1.5 279.17477,321.18542 50 地夫可特 C25H31NO6 25.56 [M+H]+ 442.22241 442.22296 1.2 142.05026,124.03963 51 潑尼松醋酸酯 C23H28O6 24.74 [M+H]+ 401.19582 401.19588 0.1 147.08072,295.16977 52 甲基潑尼松龍醋酸酯 C24H32O6 25.81 [M+H]+ 417.22717 417.22614 2.5 253.15895,399.21698 53 倍他米松醋酸酯 C24H31FO6 25.54 [M+H]+ 435.21774 435.21658 2.7 279.17474,319.16971 54 地塞米松醋酸酯 C24H31FO6 25.71 [M+H]+ 435.21774 435.21692 1.9 237.12784,309.18521 55 甲芬那酸 C15H15NO2 28.65 [M+H]+ 242.11756 242.11774 0.7 224.10727,209.08391 56 阿司匹林 C9H8O4 1.24 [M-H]- 178.87989 178.88013 1.3 134.96956,90.99904 57 安乃近 C13H16N3NaO4S 9.01 [M-Na]- 310.08560 310.08542 0.6 191.04959,175.01787 58 雙氯芬酸鈉 C16H13Cl2NO4 23.48 [M-Na]- 294.00831 294.00846 0.5 250.01932,193.15935 59 吲哚美辛 C19H16ClNO4 23.39 [M-H]- 356.06951 356.06924 0.8 312.07947,282.03320 60 氟氫可的松醋酸酯 C23H31FO6 24.73 [M+H]+ 423.21774 423.21796 0.5 239.14326,181.10214 61 曲安西龍 C21H27FO6 21.41 [M+H]+ 395.18644 395.18729 2.2 357.17004,225.12776 62 氟氫縮松 C24H33FO6 25.34 [M+H]+ 437.23390 437.23407 0.4 361.18118,181.10208 63 哈西奈德 C24H32ClFO5 27.27 [M+H]+ 455.19951 455.1998 0.6 121.06503,105.07011 64 氯唑沙宗 C7H4ClNO2 21.82 [M-H]- 168.98578 168.98589 0.7 132.00912,76.01917

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈、50%（V/V）甲醇水溶液和 50%（V/V）乙腈水對(duì)酒類樣本中非法添加化合物的提取效果，及不同超聲提取時(shí)間（10、20、30 min）的提取效果。結(jié)果表明有機(jī)溶劑的提取可以明顯提高對(duì)乙酰氨基酚、氨基比林等化合物的提取率。超聲提取20或30 min均可達(dá)到較好的提取效果。考慮到對(duì)人體傷害、環(huán)保和成本等方面的因素，故處理方法選擇甲醇超聲提取30 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了 Waters ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1，100 mm，1.7 μm）柱、Thermo Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）柱和Agilent Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）三種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，普通的色譜柱柱效偏低，不能保證每種目標(biāo)物都有較好的峰形，Thermo Hypersil GOLD C18柱采用亞微米填料技術(shù)，具有更高的分離度，更快的分析速度，該柱在較短的時(shí)間內(nèi)能夠梯度洗脫出64種解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物，且各目標(biāo)化合物的保留良好，峰形對(duì)稱，對(duì)甲氧芐啶、磺胺甲惡唑等的峰形起到了較好的改善作用，并能實(shí)現(xiàn)倍他米松和地塞米松等分子量相同保留時(shí)間相近化合物的有效分離，因此選定該色譜柱進(jìn)行本方法的研究。

流動(dòng)相的選擇，對(duì)比了用乙腈和甲醇作為有機(jī)相以及水、5 mmol/L甲酸銨溶液、甲酸水作為水相對(duì)64種解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物分離作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為5 mmol/L甲酸銨溶液-乙腈體系時(shí)，可獲得最佳的色譜峰形和分離效果，且可同時(shí)應(yīng)用在正離子和負(fù)離子模式，不同化合物均能獲得較高的質(zhì)譜響應(yīng)；在（ESI+）條件下，甲酸的加入有助于目標(biāo)物離子化，從而提高分離效率和信號(hào)的強(qiáng)度；梯度洗脫分成四個(gè)階段，逐級(jí)放緩，將采集時(shí)間延長至 35 min，能更好的解決氟輕松醋酸酯和二氟拉松雙醋酸酯、潑尼松龍和可的松等分子量相同或結(jié)構(gòu)相似的化合物保留時(shí)間相近的問題。64種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流色圖見圖1。

圖1 64種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流色圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the mixed standard solution of 64 compund

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用一級(jí)質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)質(zhì)譜掃描模式（Full MS/dd-MS2）對(duì)選定的質(zhì)量數(shù)（100～1000m/z）做一級(jí)質(zhì)譜全掃描，發(fā)現(xiàn)母離子自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描，在得到一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)的同時(shí)又得到了二級(jí)質(zhì)譜的全掃描信息。Orbitrap具有不同的分辨率（17500、35000、70000和140000 FWHM），較高的分辨率越高可以更好的區(qū)分目標(biāo)化合物與其他質(zhì)量數(shù)相近組分，但會(huì)存在掃面速度慢，掃描點(diǎn)數(shù)少的問題，考慮到篩查和定量的準(zhǔn)確性，最終采用分辨率 R=70000，TopN=5，一個(gè)掃描循環(huán)的時(shí)間大概是0.8 s，此掃描速度與實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相的速度相匹配，掃描點(diǎn)數(shù)滿足篩查與定量分析要求，且質(zhì)量偏差均小于3.5×10-6（見表1），掃描準(zhǔn)確度符合要求。

二級(jí)質(zhì)譜掃描主要利用碎片離子的質(zhì)譜圖和離子信息進(jìn)行定性，因此采用相對(duì)較低的分辨率R=17500，C-trap存儲(chǔ)離子數(shù)（AGC target）設(shè)置為1×105，采用20%、40%、60% 3種不同歸一化碰撞能對(duì)化合物進(jìn)行碎裂，能夠得到碎片離子信息豐富的加合圖，靈敏度滿足分析要求，可對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行更準(zhǔn)確的定性。70000 FWHM的分辨率作為全掃描分辨率，在該分辨率下，64種化合物保留時(shí)間、準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息見表1，單次測(cè)定在35 min內(nèi)基本實(shí)現(xiàn)分離，互無干擾。理論質(zhì)量數(shù)與實(shí)際測(cè)得的質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差越小，篩查結(jié)果準(zhǔn)確度越高，采用理論質(zhì)量數(shù)±5對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取離子流（EIC）處理，可以獲得有效的選擇性。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

由于酒類樣本基質(zhì)復(fù)雜，在前處理凈化后并不能完全去除雜質(zhì)的干擾，基質(zhì)中的非揮發(fā)性組分與目標(biāo)化合物在離子化的過程中產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，可能會(huì)產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)待測(cè)物的離子化效率，產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)[32,33]，高分辨質(zhì)譜較三重四級(jí)桿相比有更強(qiáng)的抗干擾能力[34]。本實(shí)驗(yàn)考察了 64種標(biāo)準(zhǔn)品分別以白酒和配制酒配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，與空白溶劑甲醇配制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，通過峰面積比值（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積/試劑標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積）及各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)、斜率及截距等，綜合評(píng)價(jià)樣品的基質(zhì)效應(yīng)[35]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酒類樣品為液體樣品，基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，并未對(duì)這64種標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生較明顯的基質(zhì)效應(yīng)，考慮到操作方便，因此在定量時(shí)采用溶劑甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 方法學(xué)的考察

2.5.1 方法的線性范圍

高分辨質(zhì)譜可以提供待測(cè)組分可能的元素組成，僅需采用全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)色譜圖即可完成定性定量，利用自動(dòng)觸發(fā)的二級(jí)質(zhì)譜采集完成準(zhǔn)確定性。只要保證多種藥物能夠全部檢出并能準(zhǔn)確定即可，本實(shí)驗(yàn)采用在溶劑中添加一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、各組分對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)做線性回歸方程，64種解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均＞0.99，線性范圍寬。試驗(yàn)各化合物不同濃度點(diǎn)在儀器上的響應(yīng)，選取以信噪比（S/N≥10）的濃度點(diǎn)作為各化合物的定量限，此濃度也作為方法中標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)。（結(jié)果見表2）。

2.5.2 回收率和精密度

在白酒和配制酒樣品中分別添加 64種標(biāo)準(zhǔn)溶液制成陽性加標(biāo)樣品，添加水平為標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度，并對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）。結(jié)果見表 3，方法回收率的范圍在 88.3%～127.9%，RSD為0.2%～6.2%，該方法具有較好的回收率和重復(fù)性，符合檢驗(yàn)方法要求。

表2 64種化合物的線性方程、線性范圍、r2和定量限Table 2 Linear equation, linear range, correlation coefficients (r2), and limits of quantitation (LOQ) of the 64 kinds of compounds

25 吡羅昔康 0.9979 5～50 Y=7.483×104X+7.362×106 0.25 26 芬布芬 0.9959 5～50 Y=7.221×102X-8.47×101 0.25 27 醋氯芬酸 0.9940 5～50 Y=2.141×104X+4.984×103 0.25 28 咖啡因 0.9964 5～50 Y=9.75×104X-7.138×104 0.25 29 潑尼松龍醋酸酯 0.9927 5～50 Y=3.214×104X+9.142×104 0.25 30 氟輕松醋酸酯 0.9967 5～50 Y=7.215×104X+8.994×104 0.25 31 二氟拉松雙醋酸酯 0.9908 5～50 Y=6.022×104X+3.202×104 0.25 32 安西奈德 0.9907 5～50 Y=5.273×104X+1.146×105 0.25 33 阿氯米松雙丙酸酯 0.9969 5～50 Y=5.475×104X+1.017×105 0.25 34 氟替卡松丙酸酯 0.9919 5～50 Y=1.190×105X-1.588×105 0.25 35 莫米他松糠酸酯 0.9942 5～50 Y=1.654×104X+3.787×103 0.25 36 氯倍他松丁酸酯 0.9941 5～50 Y=1.075×105X+1.359×104 0.25 37 潑尼松龍 0.9901 5～50 Y=4.414×104X+5.199×104 0.25 38 可的松 0.9952 5～50 Y=1.162×105X+1.591×104 0.25 39 倍他米松 0.9945 5～50 Y=3.571×104X+5.868×104 0.25 40 地塞米松 0.9933 5～50 Y=3.630×104X+5.080×104 0.25 41 氫化可的松丁酸酯 0.9939 5～50 Y=2.754×105X-3.280×104 0.25 42 氫化可的松戊酸酯 0.9911 5～50 Y=2.448×105X-1.990×105 0.25 43 潑尼松 0.9992 10～100 Y=2.622×104X-1.660×104 0.25 44 氫化可的松 0.9997 10～100 Y=1.152×105X-1333×104 0.5 45 氟米松 0.9995 10～100 Y=3.729×104X+3.764×103 0.5 46 倍氯米松 0.9992 10～100 Y=2.556×104X-5.407×103 0.5 47 酮洛芬 0.9994 10～100 Y=6.889×105X+4.676×105 0.5 48 氫化可的松醋酸酯 0.9991 10～100 Y=5.438×104X+1.718×104 0.5 49 氟米龍 0.9972 10～100 Y=4.469×104X-2.848×104 0.5 50 地夫可特 0.9996 10～100 Y=1.006×105X+7.919×104 0.5 51 潑尼松醋酸酯 0.9963 10～100 Y=3.497×104X+4.408×104 0.5 52 甲基潑尼松龍醋酸酯 0.9985 10～100 Y=1.369×104X-4.175×103 0.5 53 倍他米松醋酸酯 0.9979 10～100 Y=3.516×103X+5.047×103 0.5 54 地塞米松醋酸酯 0.9994 10～100 Y=7.405×103X+8.680×103 0.5 55 甲芬那酸 0.9996 10～100 Y=8.968×105X+9.552×105 0.5 56 阿司匹林 0.9916 5～500 Y=2.535×104X-1.404×104 2.5 57 安乃近 0.9963 5～500 Y=2.016×103X+1.654×105 2.5 58 雙氯芬酸鈉 0.9983 5～500 Y=1.535×104X+1.098×105 2.5 59 吲哚美辛 0.9940 5～500 Y=1.085×103X-5.482×102 2.5 60 氟氫可的松醋酸酯 0.9993 5～500 Y=2.444×104X-1.148×105 2.5 61 曲安西龍 0.9993 5～500 Y=1.151×104X-4.383×104 2.5 62 氟氫縮松 0.9952 5～500 Y=3.486×104X+8.284×105 2.5 63 哈西奈德 0.9979 5～500 Y=3.711×104X+1.541×105 2.5 64 氯唑沙宗 0.9970 5～500 Y=9.310×104X+1.718×106 2.5

表3 64種化合物在白酒和配制酒的樣品中的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSD) of the 64 kinds of compounds in white spirit and mixed liquor

41 氫化可的松丁酸酯 20 98.3 1.6 99.3 2.2 42 氫化可的松戊酸酯 20 106.2 2.4 102.7 3.8 43 潑尼松 40 96.7 1.7 94.4 3.5 44 氫化可的松 40 93.4 0.8 93.5 2.6 45 氟米松 40 96.7 4.0 91.3 2.8 46 倍氯米松 40 98.4 3.3 96.5 5.2 47 酮洛芬 40 94.5 2.9 90.8 1.4 48 氫化可的松醋酸酯 40 92.3 0.8 93.6 1.4 49 氟米龍 40 94.6 5.2 87.9 3.5 50 地夫可特 40 90.8 0.9 89.6 2.2 51 潑尼松醋酸酯 40 92.7 0.5 93.3 1.8 52 甲基潑尼松龍醋酸酯 40 96.5 5.7 89.0 2.3 53 倍他米松醋酸酯 40 99.6 2.0 98.5 1.9 54 地塞米松醋酸酯 40 99.3 1.8 98.3 1.8 55 甲芬那酸 40 94.4 0.6 96.0 0.3 56 阿司匹林 200 87.3 2.7 86.5 1.8 57 安乃近 200 90.1 3.1 91.5 2.8 58 雙氯芬酸鈉 200 96.8 0.7 101.2 1.5 59 吲哚美辛 200 102.7 2.9 98.6 1.1 60 氟氫可的松醋酸酯 200 94.2 0.9 95.0 2.8 61 曲安西龍 200 96.2 1.3 95.0 0.3 62 氟氫縮松 200 96.0 0.8 97.1 3.5 63 哈西奈德 200 89.6 3.3 93.9 2.6 64 氯唑沙宗 200 102.9 3.6 97.8 5.5

2.6 快速定性篩查數(shù)據(jù)庫的建立

利用四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，直接采集了 64種解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物的一級(jí)全掃描和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（raw格式），導(dǎo)入Trace Finder軟件，以建立定性、定量篩查方法數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)篩查。如果樣品中某個(gè)離子的4個(gè)篩查選項(xiàng)（即分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時(shí)間、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量及同位素分布）均符合篩查標(biāo)準(zhǔn)（篩查通過Flag顯示綠燈），則判定樣品為陽性。在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，可在不使用對(duì)照品的情況下，直接利用數(shù)據(jù)庫中的一級(jí)離子和二級(jí)離子的精確質(zhì)量數(shù)及譜圖進(jìn)行初步確證和初步定量，可以將樣品假陽性和假陰性的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

選取了296批白酒、7批配制酒和3批葡萄酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間對(duì)樣品中64種解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物進(jìn)行定性篩查，并結(jié)合二級(jí)特征碎片離子確證，均未檢出陽性樣品。由于目前所檢樣本均為2019年河南省地區(qū)國抽抽檢部分樣品、品牌，種類覆蓋面不夠廣泛，樣品數(shù)據(jù)有一定的局限性。所檢樣品未檢出此類非法添加，不能說明酒類樣本中一定不存在藥物濫用，但可以說明整體酒類環(huán)境是好的。以后會(huì)繼續(xù)利用此方法對(duì)國抽抽檢酒類樣品進(jìn)行篩查。

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-Q-Orbitrap測(cè)定酒類樣品中64種解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物，采用Trace Finder軟件構(gòu)建了Orbitrap高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，建立了篩查方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。該方法簡(jiǎn)單高效、選擇性好、靈敏度高，滿足快速定性、準(zhǔn)確定量的需要，適用于大量酒類樣品中解熱鎮(zhèn)痛和激素類藥物非法添加物的檢測(cè)，也可為其他食品基質(zhì)中非法藥物添加的快速篩查提供方法參考，為監(jiān)管食品中非法添加藥物提供有力的技術(shù)支持。