葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及骨代謝的影響

陳文明 胡芯源

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院脊柱外科，江西 萍鄉(xiāng) 337000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)指絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退，雌激素分泌水平下降，骨代謝失衡，導(dǎo)致骨量減少，骨強度下降，骨結(jié)構(gòu)退變，骨脆性增加為特征的一種代謝性骨骼疾病[1]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)影響骨細(xì)胞的分化、增殖、凋亡，參與骨重建過程和PMOP發(fā)生和發(fā)展[2]。葛根素(puerarin，Pue)屬于植物雌激素，可以產(chǎn)生雌激素樣活性，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞分化，改善骨代謝，增加骨量，增加骨密度，減少骨吸收，促進(jìn)骨形成作用[3-4]。本研究通過觀察葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激、炎癥因子和骨代謝的影響，探索其潛在的作用機制，為中西醫(yī)結(jié)合防治PMPO的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與材料

雌性Wistar大鼠52只，12周齡，未孕，體重230～260 g，由贛南醫(yī)學(xué)院提供，許可證號：SCXK(贛)2014-0001。葛根素注射液(規(guī)格：100 mg/支，國藥準(zhǔn)字：H20053739，安康北醫(yī)大制藥股份有限公司)，阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg/片，國藥準(zhǔn)字：J20040004，美國默沙東制藥有限公司)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、I型膠原羧基末端肽(ICIP)購于武漢華美生物工程有限公司，Lunari DXA型雙能X射線骨密度檢測儀購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動物模型：采用“雙側(cè)卵巢摘除術(shù)”構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠動物模型[5]。假手術(shù)組不切除卵巢，僅在卵巢周圍切除等量脂肪組織，其他操作步驟相同。所有大鼠均飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室，同等飼養(yǎng)條件：1～2只/籠，恒溫恒濕，人工明暗交替光照，自由飲食水，活動，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2.2分組及藥物處理：造模成功評價標(biāo)準(zhǔn)：造模8周后骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。SD大鼠造模成功45只，造模成功率約86%。實驗分為假手術(shù)組、去卵巢組、A藥組、B藥組、AB藥組。確認(rèn)造模成功后第2天給予藥物干預(yù)，對照組和去勢組：(0.9% Nacl 5 mL/kg/，ih，1次/d)，藥物A組(葛根素 35 mg/kg，ih，1次/d)，藥物B組(福善美 0.5 mg/kg，po，1次/d)，藥物AB組(葛根素 35 mg/kg，ih，1次/d+福善美 0.5 mg/kg，po，1次/d)，連續(xù)給藥6周。

1.2.3標(biāo)本取材：藥物干預(yù)6周結(jié)束后，水合氯醛腹腔注射麻醉，股動脈取血，4 ℃，3 000 r/min，離心5 min，分離血清，-20 ℃保存。解剖雙下肢股骨，0.9% Nacl沖洗，4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d，骨形態(tài)學(xué)改變觀察。

1.2.4檢測血清氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎性因子和骨代謝指標(biāo)：取出上清液，采用ELISA法檢測各組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)：MDA、CAT、SOD、GSH，炎性因子指標(biāo)：TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1，骨代謝指標(biāo)：ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP。所有操作嚴(yán)格參照各試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5檢測骨組織骨密度：取大鼠L5椎體和右側(cè)股骨，在LunariDXA型雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，軟件分析計算BMD值。

1.2.6HE染色法觀察骨組織形態(tài)學(xué)：參照HE染色法操作步驟，制作石蠟切片，脫蠟去水，蘇木素染色，1%鹽酸分化，脫水透明，封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

去卵巢組大鼠血清SOD和GSH-Px水平較假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著升高(P<0.05)，以AB藥組最高。去卵巢組大鼠血清H2O2和MDA水平較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著降低(P<0.05)，以AB藥組最低。見表1。

表1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum oxidative stress indicators of rats between each group

2.2 各組大鼠血清細(xì)胞因子指標(biāo)比較

去卵巢組大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著下降(P<0.05)，以AB藥組最低。見表2。

表2 各組大鼠血清細(xì)胞因子指標(biāo)比較Table 2 Comparison of serum cytokine indexes of rats among various groups

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)

去卵巢組大鼠血清ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP水平較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組血清水平較去卵巢組均顯著下降(P<0.05)，以AB藥組降低。見表3。

表3 各組大鼠血清骨形成生化指標(biāo)比較Table 3 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation between each group of rats

2.4 各組大鼠骨組織骨密度比較

去卵巢組大鼠腰椎和股骨BMD較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組、AB藥組骨組織BMD較去卵巢組均顯著升高(P<0.05)，以AB藥組最高。見表4。

2.5 各組大鼠股骨骨形態(tài)學(xué)改變

假手術(shù)組骨皮質(zhì)正常，骨板層結(jié)構(gòu)整齊，骨小梁數(shù)較多，排列有序；去卵巢組呈骨質(zhì)疏松樣改變，骨皮質(zhì)明顯變薄，骨板層結(jié)構(gòu)不整齊，骨小梁明顯稀疏，排列紊亂，髓腔明顯擴大；A藥組和B藥組骨皮質(zhì)松質(zhì)骨改變，骨小梁較前增多，小梁稍細(xì)但排列尚規(guī)則，間距稍寬，髓腔較前變小。AB藥組骨皮質(zhì)松質(zhì)骨輕微改變，骨小梁明顯增多，排列規(guī)則，間距變窄，連續(xù)性、完整性較好，髓腔明顯變小。見圖1。

表4 各組大鼠骨組織BMD比較

圖1 各組大鼠股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×40)A：假手術(shù)組；B去卵巢組；C：A藥組；D：B藥組；E：AB藥組Fig.1 Morphological changes of the femur in each group (× 40)A: Sham operation group; B Ovariectomy group; C: Drug group A; D: Drug group B; E: AB drug group

3 討論

雌激素水平下降被認(rèn)為導(dǎo)致PMOP的主要機制，然而補充雌激素骨質(zhì)疏松癥并未得到明顯改善，單一將雌激素缺乏作為骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制不夠完善[6]。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展，雌激素對骨質(zhì)疏松的防治作用可能與其全身抗氧化、抗炎作用有關(guān)[7]。雌激素的分泌減少、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加、炎性因子分泌增加是PMOP的重要原因[8]。葛根素作為天然植物葛根中提取分離出的一種單體異黃酮類化合物，對骨產(chǎn)生類雌激素樣作用，可改善骨代謝；而且還能增加骨密度和骨礦含量，改善骨生物力學(xué)性能[9]。阿侖膦酸鈉作為第3代二膦酸鹽(BPs)類藥物，可抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換、預(yù)防骨量丟失和減少骨折發(fā)生[10]。

絕經(jīng)后雌激素缺乏機體內(nèi)積累過多的ROS通過調(diào)控多種細(xì)胞因子、酶活性和受體配體的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡和破骨細(xì)胞的增殖及分化，使骨形成小于骨吸收，骨重建失衡[11]。本研究結(jié)果顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠血清SOD和GSH-Px顯著降低，H2O2和MDA水平均顯著升高，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與PMOP的發(fā)生發(fā)展過程，而葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉能夠顯著減少脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物H2O2和MDA的表達(dá)，增加抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，最終減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。初步表明葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮對骨質(zhì)疏松的改善作用。葛根素具有清除成骨細(xì)胞氧自由基、活性氧，發(fā)揮抗氧化作用，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能[12]。葛根素能提高機體SOD和GSH-Px活性，降低H2O2和MDA含量，保護機體免受氧化應(yīng)激損傷[13]。

絕經(jīng)后雌激素水平降低可通過介導(dǎo)一系列細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α、TGF)等的分泌增多，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖和增強活性，參與骨重建，打破骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡，導(dǎo)致PMOP[14]。本研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1被大量釋放，說明炎性反應(yīng)在PMOP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉能夠降低血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平，有效抑制炎性反應(yīng)；初步表明葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉對骨質(zhì)疏松癥的改善作用，伴隨炎性反應(yīng)改變。羅琳等[15]研究發(fā)現(xiàn)葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清骨代謝指標(biāo)(BALP、BGP、TRAP-5b)和免疫因子(IL-10、IL-6、TNF-α)水平。

骨代謝主要由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成構(gòu)成，骨代謝可及時反映機體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，骨代謝、骨重建的變化[16]。本研究顯示葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)血清骨代謝ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP等指標(biāo)，從而提高腰椎和股骨BMD，改善骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。有研究發(fā)現(xiàn)葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉通過減輕老年骨質(zhì)疏松患者炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善骨質(zhì)代謝，增加骨密度，臨床治療效果顯著[17]。

綜上所述，本研究初步表明葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉具有協(xié)同抑制減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激和炎性因子分泌，調(diào)節(jié)骨代謝，改善骨組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。但氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)參與骨質(zhì)疏松的機制尚未完全明確，葛根素和阿侖膦酸鈉聯(lián)合可在達(dá)到最佳治療效果的同時減少激素用量，從而減少雌激素引起的副作用。因此，探討中西結(jié)合防治PMOP是未來研究的重點，同時也為中草藥的應(yīng)用開辟了新的途徑。