還有“永生”的DNA 鏈？（4）

朱欽士 （美國南加州大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

（上接2021 年第6 期第7 頁）

2015 年，Sherley 的實驗室用類似的方法（BrdU 和免疫熒光染色），比較小鼠毛囊干細胞分裂時2 個“子”細胞中組蛋白H2A 的1 個變種，H2A.Z 的存在情形，發(fā)現(xiàn)在保有永生DNA 鏈的“子”細胞中，H2A.Z 很容易被探測到，但在要分化的細胞中卻探測不到。細胞用鹽酸處理后，在2個細胞中都能探測到H2A.Z，說明在含永生DNA鏈的染色體上，H2A.Z 蛋白是暴露的，而在要分化的細胞中是被屏蔽的。這些結(jié)果表明，在干細胞不對稱分裂形成的2 個“子”細胞中，組蛋白H2A.Z的存在狀況是不一樣的。

Sherley 的實驗室還研究小鼠毛囊干細胞分裂時組蛋白H3 的甲基化狀態(tài)在“子”細胞中的分布情形。2014 年發(fā)表的一篇文章中，他們發(fā)現(xiàn)組蛋白H3 第4 位和第27 位的賴氨酸被3 個甲基修飾（分別為H3K4me3 和H3K27me3）的程度在保留干細胞特性的“子”細胞中要高得多，可作為這些干細胞的標志。

2012 年，美國約翰·霍普金斯大學(xué)（Johns Hopkins University）Xin Chen 的實驗室用不同顏色的熒光蛋白分別標記果蠅雄性生殖干細胞中“輩分”較高的和新合成的組蛋白H3，再觀察干細胞不對稱分裂后H3 在“子”細胞中的分布情形，發(fā)現(xiàn)保留干細胞特性的“子”細胞繼承原組蛋白H3，而新合成的H3 組蛋白則進入要進行分化的“子”細胞。不僅如此，原有的組蛋白H3 第3 位的纈氨酸是被磷酸化的（H3T3ph），而新合成的H3 第3 位的纈氨酸沒有被磷酸化。

這些結(jié)果表明，干細胞在進行不對稱分裂時，不僅保留“輩分”大的DNA 鏈，還繼承與其相連的表觀遺傳修飾。這些修飾不僅能使繼承它們的“子”細胞保持干細胞的身份，也為干細胞分裂時染色體的不對稱分配提供依據(jù)。

8 表觀遺傳修飾可能是細胞識別DNA年齡的標志

要細胞識別DNA 的年齡，并且以此決定不同年齡的DNA 在“子”細胞中的分配方式，初看起似乎是不可能的事情。以“永生”DNA 鏈為模板合成的DNA 鏈攜帶的信息極為相似，核苷酸序列99.9%以上互補，而且DNA 復(fù)制時在新合成鏈上產(chǎn)生的錯誤是隨機的，細胞不可能提前“知道”，也就無法發(fā)展出根據(jù)這少量序列的差別選擇性地分配DNA 的機制。要更好地理解這個問題，就需要知道細胞分裂時DNA 是如何分配至2 個“子”細胞中的。

在真核生物的細胞分裂時，細胞中的2 個彼此分開的中心粒（centrosome）向?qū)Ψ桨l(fā)出由微管（microtube）組成的細絲，它們的走向類似地球儀上的經(jīng)線，組成的結(jié)構(gòu)又像一個紡錘，所以又稱為“紡錘體”（spindle）。DNA 復(fù)制后，生成的2 份相同的DNA 通過它們的“著絲點”（centromere）彼此連接在一起。著絲點本身也是DNA 的一部分，上面結(jié)合許多蛋白質(zhì)分子。著絲點將DNA 分為“短臂”和“長臂”，通過著絲點連接的2 個染色體就像字母X 的形狀，也就是人們熟悉的染色體的樣子。

在細胞分配染色體時，所有的染色體都運動至紡錘體中部的一個面上。這個面類似于地球的赤道面，所以，被稱為赤道面（equatorial plane）。在赤道面上，通過著絲點連在一起的2 份DNA 各自用其著絲點分別與紡錘體2 端的中心粒發(fā)出的微管相連。微管收縮，將2 份DNA“拉”向不同的中心粒，這2 份DNA 就彼此分開，在細胞分裂時進入不同細胞的細胞核，此過程稱為“有絲分裂”（mitosis）。

如果在有絲分裂過程中分開的只是DNA，細胞是無法分辨2 份DNA 的年齡的，因為它們之間的核苷酸序列幾乎完全相同。但DNA 并不是裸露的，而是與組蛋白組成染色質(zhì)，在細胞分裂時形成染色體。如果與不同年齡DNA 結(jié)合的組蛋白修飾狀況不同，細胞就可根據(jù)這些差別判斷DNA 的年齡，不對稱分配就變得可能。

模板DNA 和新合成的DNA 就像雙胞胎兄弟，穿同樣的衣服，彼此之間的差別就極小，幾乎無法辨別。但如果在雙胞胎兄弟穿的衣服上作出改變，例如，配戴上不同的徽章，就容易區(qū)分彼此。組蛋白的修飾，例如，前文談到的組蛋白的乙酰化、甲基化、和磷酸化，就相當(dāng)于在衣服上佩戴各種徽章，細胞即可識別它們。

要選擇性地分配DNA（染色體），只有染色體之間的差別還不夠，紡錘體中的2 個中心粒也需要有區(qū)別，這樣“輩分”高的DNA 才“知道”與哪個中心粒相連，從而進入特定的“子”細胞。實際的情形也的確如此：細胞分裂時，每個“子”細胞只接收1 個中心粒，在下一次細胞分裂前，這個中心粒進行復(fù)制，形成2 個中心粒，所以，2 個中心粒的“輩分”不同，類似于模板DNA 鏈和新合成DNA 鏈的“輩分”。這2 個“輩分”不同的中心粒所結(jié)合蛋白質(zhì)（例如，Ninein 和Cenexin）的情形也不同，這樣不同的中心粒就可與不同輩分的染色體相互識別，進而通過微管相連，不同年齡的DNA就可有選擇性地進入命運不同的“子”細胞。

9 細胞進行對稱分裂和不對稱分裂的控制機制

在動物體內(nèi)，細胞的不對稱分裂和DNA 的選擇性分配只是干細胞特有的功能，一旦成為體細胞的前體細胞，再繁殖分化成為體細胞，這個功能就消失了，細胞改而進行對稱分裂。其中一定有控制機制，決定細胞的分裂是否對稱。

在胚胎發(fā)育過程中，一個受精卵細胞要形成由數(shù)量極其龐大的細胞組成的生物體，在開始階段也是進行對稱分裂，以增加干細胞的數(shù)量。例如，從受精卵（可看成是全能干細胞）形成囊胚期的內(nèi)細胞團中，每一個細胞都是胚胎干細胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下都可發(fā)育成為一個完整的生物體，這些內(nèi)細胞團的細胞也是通過對稱分裂形成的。只有身體逐漸發(fā)育成熟，在每種組織中形成成體干細胞后，才開始不對稱分裂，以補充不斷消耗的體細胞。從發(fā)育期干細胞的對稱分裂轉(zhuǎn)變?yōu)椴粚ΨQ分裂，其中也一定有一個轉(zhuǎn)換機制。

而且即使是成體干細胞也不總是進行不對稱分裂。不對稱分裂只是在需要干細胞補充體細胞時才發(fā)生。干細胞除不對稱分裂，也進行對稱分裂，分裂形成的2 個“子”細胞都是干細胞，以彌補由各種原因引起的干細胞數(shù)量的下降。這也一定有一個控制機制。

然而，要研究這個機制很難，細胞進行有絲分裂的過程極為復(fù)雜，控制因素非常多。要從中找出啟動非對稱分裂的因素，目前還是一個難以實現(xiàn)的目標，但是近年的科學(xué)研究已提供一些有趣的線索，表明細胞的不對稱分裂與以下因素有關(guān)。

9.1 DNA 的甲基化 在上一節(jié)中，筆者談到“永生”DNA 鏈含有較多的羥甲基化的胞嘧啶。2013年，美國加州大學(xué)伯克利分校（UC Berkeley）Michael Conboy 的實驗室表明，小鼠胚胎干細胞的不對稱分裂需要DNA 的甲基化。如果敲除甲基化酶Dnmt3（DNA methyltransferase-3），這些細胞就不再進行不對稱分裂。

DNA 的甲基化狀況與組蛋白的修飾密切相關(guān)，因此，這個結(jié)果無法區(qū)分細胞在不對稱分裂的過程中，依靠的是DNA 的甲基化狀況，還是組蛋白的修飾狀況。

9.2 蛋白p53 成體干細胞在體外培養(yǎng)時非常難以擴張，因為其總是進行不對稱分裂。每個干細胞分裂時只產(chǎn)生一個干細胞，另一個是要進行分化的體細胞的前體細胞。前體細胞繁殖分化，形成大量的體細胞。這樣，干細胞的數(shù)量并不會隨著細胞分裂而不斷增加，其濃度反而會隨著培養(yǎng)時間延長體細胞的大量形成而不斷被稀釋，最后喪失干細胞系。

美國波士頓生物醫(yī)學(xué)研究所的James Sherley發(fā)現(xiàn)，如果在干細胞中讓蛋白p53 恢復(fù)表達，干細胞就會進行對稱分裂，形成的后代細胞也都是干細胞，這就解決了在體外增殖成體干細胞的問題。

p53 是一種抗腫瘤蛋白，在DNA 被損傷至一定程度時會阻止細胞進行分裂，防止這些細胞繁殖為癌細胞。p53 的一個信號傳遞鏈就是抑制磷酸次黃嘌呤脫氫酶（IMPDH）的活性，阻止它將黃嘌呤核苷（xanthosine）代謝掉。因此，在干細胞培養(yǎng)液中直接加入黃嘌呤核苷也能讓干細胞從不對稱分裂變?yōu)閷ΨQ分裂，達到干細胞增殖的目的。

9.3 蛋白激酶Pim-1 Pim-1 是一個蛋白激酶，能在其他蛋白質(zhì)分子的絲氨酸和蘇氨酸殘基的側(cè)鏈上加上磷酸根。在細胞進行有絲分裂時，Pim-1 位于紡錘體的兩極，磷酸化與微管結(jié)合的蛋白NuMA，還與若干與有絲分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用，包括與著絲點結(jié)合的蛋白HP-1（hetero‐chromatin protein 1）、給有絲分裂提供動力的動力蛋白dynein、動力蛋白激活蛋白dynactin 等，因此，是與DNA 的分配過程有密切關(guān)系的酶。2012 年，美國圣迭哥州立大學(xué)（San Diego State University）Mark Sussman 的實驗室用BrdU 標記DNA 鏈的方法檢測心肌干細胞進行不對稱分裂的狀況，發(fā)現(xiàn)增加Pim-1 的量能使不對稱分裂的幾率加倍，表明Pim-1 在干細胞保留“永生”DNA 鏈的過程中起重要作用。

9.4 組蛋白H3 上纈氨酸的磷酸化 2015 年，前面提到過的美國約翰·霍普金斯大學(xué)Xin Chen 的實驗室還表明，在雄性果蠅的生殖干細胞的分裂中，組蛋白H3 上纈氨酸的磷酸化狀態(tài)與細胞是否進行不對稱分裂有直接關(guān)系。在H3 第3 位的纈氨酸被磷酸化時（H3T3ph），干細胞進行不對稱分裂，帶有H3T3ph 修飾的組蛋白H3 與“輩分”高的DNA 在一起。如果將第3 位的纈氨酸變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼幔℉3T3A），細胞就從不對稱分裂變?yōu)閷ΨQ分裂。該結(jié)果被發(fā)表于《細胞》（Cell）雜志上，是組蛋白的修飾狀況與干細胞分裂方式直接相關(guān)的證明。

9.5 Wnt 信號鏈 2011 年，加拿大多倫多大學(xué)（University of Toronto）Cindi Morshead 的實驗室報道，在進行不對稱分裂的小鼠神經(jīng)干細胞中，Wnt信號傳遞鏈的活性被抑制，而在進行對稱分裂的神經(jīng)干細胞中，Wnt 信號傳遞鏈活躍。Wnt 是果蠅的翅膀缺失基因wg（wingless）和小鼠致癌基因intl（integration 1）2 個名稱的混合，因為在不同動物中發(fā)現(xiàn)的這2 個基因?qū)嶋H上是同一個基因，從線蟲、果蠅、小鼠到人中都高度保守，在動物胚胎發(fā)育和器官形成上起重要作用。在成體動物中，Wnt 信號看來是和保持干細胞增殖的特性（即通過對稱分裂增加干細胞的數(shù)量）有關(guān)，而在干細胞進行不對稱分裂時，Wnt 信號鏈必須被關(guān)掉。

9.6 左-右不對稱蛋白Lrd 最有趣的是干細胞的不對稱分裂居然與決定小鼠內(nèi)臟左-右不對稱的蛋白Lrd（left-right dynein）有關(guān)。敲除小鼠的lrd基因，小鼠內(nèi)臟位置左右不對稱（類似人的心臟在左邊，肝臟在右邊）的情形就被打亂，變成隨機的。前面談到的美國國立癌癥研究所的Amar Klar 發(fā)現(xiàn)，降低小鼠胚胎干細胞中l(wèi)rd信使RNA（mRNA）的濃度，干細胞就不再進行不對稱分裂，也不再保留永生的DNA。

目前，得到的研究結(jié)果還是零星的，彼此之間也沒有關(guān)系。這就像一張復(fù)雜的拼圖，只有少數(shù)幾片，還彼此不相連，然而這些結(jié)果已顯示，干細胞的不對稱分裂和保留“永生”DNA 鏈的過程是非常復(fù)雜的，要了解它還需要大量的研究工作，但目前對機制還認識不足的狀況并不影響理解“永生”的DNA 鏈存在的事實。

“永生”的DNA 鏈，其實還和“永生”的生殖細胞一脈相承。

10 “永生”的DNA 鏈和永生的生殖細胞

在干細胞中“永生”的DNA 鏈出現(xiàn)之前，所有的生物就已發(fā)展出永生的生殖細胞。生物的物種要延續(xù)，必須要有將生命傳給后代的生殖細胞，而且由生殖細胞繁殖出的后代的壽命不會由于繁殖代數(shù)的增加而減少，否則物種就會凋亡?，F(xiàn)在身體上的每一個細胞，都是幾十億年前那個單細胞“祖宗”連續(xù)不斷分裂的后代。從此意義上講，生殖細胞真的是“永生”的。

與此相反，組成生物身體的細胞，即體細胞，都是有壽命的。無論體細胞有多少防御和修復(fù)機制，都終將死亡。由體細胞組成的生物體也都有壽命，而且許多體細胞的壽命比生物體總的壽命要短。

但生殖細胞和體細胞含有完全相同的DNA，生殖細胞所含有的基因，體細胞都具有，為什么體細胞必然死亡，而生殖細胞卻能永生？答案是：生殖細胞具有與體細胞不同的表觀遺傳修飾。要更詳細地了解這個問題，可參見筆者的另一篇文章《為什么生殖細胞能永生？》，發(fā)表于2014 年5 月10 日《科學(xué)網(wǎng)》的博客，或《生物學(xué)通報》2014 年第5 期中的文章。

干細胞是隨著多細胞生物的出現(xiàn)而發(fā)展的，它們在身體發(fā)育完成后，執(zhí)行替補體細胞的任務(wù)，完成這個任務(wù)的過程和由生殖細胞發(fā)展出體細胞相似，因此，可看作是生殖細胞在身體各個組織中的延伸或“派出部隊”。干細胞和生殖細胞都是分化程度很低的細胞，都有保持其“真身”的任務(wù)，而且都是通過表觀遺傳修飾完成的。

干細胞數(shù)量不多，要在替補體細胞的同時保留自己，就要進行不對稱分裂，其中的一個“子”細胞要繼承其干細胞的身份和任務(wù)。因此，在干細胞分裂時，作為干細胞后代的“子”細胞不僅要繼承干細胞的DNA，還必需繼承維持干細胞特性的表觀遺傳修飾，而這些表觀遺傳修飾是和干細胞中年齡較大的DNA 聯(lián)系在一起的，這就是干細胞分裂時要選擇性地保留“爺爺”輩DNA 的主要原因。干細胞在保留原有表觀遺傳修飾的同時，也就保留與這些表觀遺傳修飾相連的，DNA 鏈的“原件”，這樣既能保持干細胞的“真身”，又能大幅減少DNA 鏈通過復(fù)制過程導(dǎo)致的序列變化，降低癌細胞發(fā)生的可能性。由此，不得不佩服生物的“聰明”，生物演化的創(chuàng)造力也遠超出想象。

然而，將干細胞所保留的DNA 鏈說成是“永生”的，則只有相對的意義。干細胞畢竟不是生殖細胞，而是會隨著生物體的死亡而死亡的，里面的DNA 鏈也就不可能“永生”。干細胞除進行不對稱分裂，還會進行對稱分裂，對稱分裂時DNA 復(fù)制造成的錯誤也會保留在后代的干細胞中。如果含有“原始文件”的干細胞由于某種原因死亡，而繼承帶有復(fù)制錯誤的DNA 鏈的干細胞后代存活下，也可導(dǎo)致“原始文件”的毀滅。因此，在本文中，可給“永生”二字加上引號。但若考慮到Cairns 提出“永生DNA 鏈”的概念時，只限于干細胞，而沒有考慮到干細胞還進行對稱分裂的情況，就可理解他將干細胞保留的DNA 鏈稱為是“永生”的。因為在干細胞壽命的范圍內(nèi)，被干細胞保留的DNA 鏈還真的可以是“永生”的。