蝦類主要過敏原及其檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

左樹娜，苑寧，徐慧，盧鑫，張偉，，3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北 滄州 061100；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

食物過敏是一個引起世界范圍廣泛關(guān)注的健康問題[1]。世界衛(wèi)生組織指出，全球約有30%～40%的人患過敏性疾病，且患病率呈逐年增長趨勢，已成為全球六大慢性疾病之一[2-3]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織公布的引起過敏反應(yīng)的食物中，90%是由牛奶、雞蛋、魚、甲殼類動物、花生、大豆、堅果和小麥引起的[4]。

蝦、蟹等甲殼類動物是一種富含蛋白質(zhì)的重要食物資源[5]，因其肉質(zhì)鮮美而備受歡迎。但蝦作為主要過敏原，其可能會引發(fā)消化系統(tǒng)紊亂（腹痛、腹瀉）和皮膚刺激（皮炎、蕁麻疹）或更嚴(yán)重的過敏癥狀（血管性水腫、休克、死亡）[6-8]。蝦中主要致敏蛋白有原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和血藍(lán)蛋白（hemocyanin）等[9-10]。盡管烹飪可使蝦中大部分致敏蛋白變性，但一些耐熱蛋白依然存在致敏性[11]。此外生產(chǎn)、儲存過程中發(fā)生的交叉污染也可能導(dǎo)致食物中存在蝦過敏原[12-13]。因此為保障食用安全，除必要的標(biāo)簽標(biāo)示之外[14]，對食品中蝦過敏原成分的精準(zhǔn)特異檢測至關(guān)重要[15]。本文主要介紹蝦過敏機(jī)制、5種主要致敏蛋白以及近幾年蝦過敏原的檢測方法。

1 致敏機(jī)制

《日本兒科2016年食物過敏指南》（JPGFA 2016）對過敏反應(yīng)進(jìn)行了定義，“過敏反應(yīng)是指接觸特定食物后，通過抗原特異性免疫機(jī)制引起的不良反應(yīng)[16]?！边@些反應(yīng)包括免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的過程[17]。

蝦類過敏是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，其是由肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞上抗原的特異性IgE交聯(lián)導(dǎo)致的即時反應(yīng)，一般在攝入食物20min～120min后出現(xiàn)過敏癥狀[18]。I型超敏反應(yīng)具體反應(yīng)機(jī)制為，當(dāng)抗原（蝦類致敏蛋白）進(jìn)入過敏機(jī)體時，該抗原與其特異性IgE結(jié)合，在體內(nèi)循環(huán)并與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合，使機(jī)體對抗原產(chǎn)生敏化。當(dāng)同一抗原再次進(jìn)入致敏體時，抗原與致敏細(xì)胞表面的特異IgE結(jié)合，使這些細(xì)胞釋放一系列致敏介質(zhì)，引起過敏反應(yīng)[19]。

2 主要致敏蛋白

2.1 原肌球蛋白

TM是蝦的主要過敏原，其是一種由100%α-螺旋纖維蛋白構(gòu)成的螺旋狀二聚體，分子量為34 ku～38 ku，起調(diào)節(jié)肌肉收縮的作用，廣泛分布于真核細(xì)胞中[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)TM具有較強(qiáng)的耐消化特性，這是由于其存在3個不被破壞的抗原表位和4個抗消化能力很強(qiáng)的抗原表位造成的[22]。Reese等[23]表征重組蝦的致敏蛋白Pen a 1時，TM已經(jīng)被定義為蝦的主要過敏原且Pen a 1已被分離，對其研究最早可以追溯到1989年。在中國北方沿海地區(qū)，蝦類過敏人群中對Pen a 1過敏者高達(dá)71.4%[24]。聶澤坤和GáMEI等[25-26]從TM中分離出Mete1、Pen s 1、Lit v 1、Pen i 1、Hom a 1 等亞型[25-26]。甲殼類動物與螨蟲和蟑螂之間的TM的氨基酸具有較高同源性，分別為78%～98%和80%～97%。

2.2 精氨酸激酶

AK是甲殼類動物的一種重要過敏原，分子量為40 ku，其致敏率高達(dá)70%，致敏性僅次于TM。但甲殼類動物與軟體動物具有高度同源性，存在非常嚴(yán)重的交叉反應(yīng)[27]。Yu等[28]確定Pen m 2為AK的一個新亞型，并在其中發(fā)現(xiàn)了特定的肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，推測Pen m 2可能具有調(diào)節(jié)或運(yùn)輸特性。在具有蝦過敏病史或?qū)ξr提取物的ImmunoCAP呈陽性患者外周血單核細(xì)胞進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)TH2細(xì)胞可識別Pen m 2，且其發(fā)揮著重要的致病作用[29]?；诖?，2019年Gao等[30]提出了一種T細(xì)胞肽的免疫療法（T cell peptide immunotherapy，PIT）以減輕蝦過敏原AK誘導(dǎo)的食物過敏，這是一種無需IgE交聯(lián)即可調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)的治療策略，其最早被Wang等[31]提出治療TM導(dǎo)致的過敏反應(yīng)。

2.3 肌球蛋白輕鏈

MLC在2008年被認(rèn)定是一種蝦類過敏原，命名為Lit v 3.0101[32]，但目前對其過敏表位的研究較少。Yang等[33]對克氏原螯蝦的肌球蛋白輕鏈亞型1（MLC1）進(jìn)行了研究，得到了3個構(gòu)象表位區(qū)域，為進(jìn)一步的診斷或抗原研究提供了重要依據(jù)。

2.4 肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白

SCP是存在于無脊椎動物肌肉和神經(jīng)組織中的EF-手型鈣離子結(jié)合蛋白，主要參與肌肉的收縮，其亞型種類有 Pen m 4、Cra c 4、Lit v 4[34]。其中 Lit v 4.0101有194個氨基酸，分子量為22 ku，等電點(diǎn)為4.7。Ayuso等[35]研究表明，甲殼類動物、節(jié)肢動物和軟體動物間均存在致敏成分TM，但SCP的致敏性似乎僅存在于甲殼類動物中。

2.5 丙酮酸激酶

PK是甲殼類動物中催化轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移反應(yīng)重要的酶。2018年Lee等[36]分析了蝦、蟹過敏患者的血清，發(fā)現(xiàn)了一個63 ku的致敏蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、 免 疫 印 跡（western blotting，WB） 和質(zhì)譜法（mass spectrometry，MS）對其進(jìn)行研究，并首次確定為一種新型的蝦過敏原。

2.6 血藍(lán)蛋白

血藍(lán)蛋白是由6個高度螺旋異源亞基構(gòu)成的六聚體，其分子量為72 ku或75 ku，具有良好熱穩(wěn)定性和耐胰液消化特性，不僅具有輸氧、抗病毒、溶血等功能，而且在滲透壓維持、免疫因子表達(dá)和能量轉(zhuǎn)換等生理過程中具有一定的調(diào)控作用[37-40]。在西班牙和意大利，血藍(lán)蛋白被認(rèn)為是蝦類致敏原之一，但在美國，其被認(rèn)為是節(jié)肢動物和蝦之間的交叉反應(yīng)性致敏原[41]。

除以上6種主要的蝦類過敏原以外，蝦中還有肌鈣蛋白（troponin C，TnC）[42-43]、磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TIM）[44]等次要過敏原。

3 蝦類過敏原的檢測方法

3.1 免疫學(xué)方法

3.1.1 酶聯(lián)免疫吸附測定

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為最典型的免疫學(xué)方法被廣泛用于蝦類過敏原的檢測分析。

Kamemura等[19]使用ELISA和IgE交聯(lián)誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)測定試驗(yàn)（IgE crosslinking-induced luciferase expression assay，EXiLE）方法證實(shí)了甲殼類和食用昆蟲間存在著交叉過敏現(xiàn)象，以原肌球蛋白為發(fā)生交叉反應(yīng)的主要過敏原。此研究表明對IgE抗體介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)進(jìn)行評估時，可能會因交叉反應(yīng)而變得復(fù)雜。Yu等[45]開發(fā)了一種夾心ELISA檢測加工食品中蝦、蟹過敏原TM的方法，其檢出限（limit of detection，LOD）為 6.8 ng/mL，定量限（limit of quantitation，LOQ）為13.67 ng/mL。李曉燕等[46]利用雙抗體夾心ELISA法測定食物中蝦過敏原成分，最低檢出限為40 ng/mL，并且在40 ng/mL～1 000 ng/mL之間具有良好的線性關(guān)系。Zhang等[47]成功獲得了特異性強(qiáng)、敏感性高的單克隆抗體CE7B2，利用夾心ELISA方法檢測并定量了包括蝦在內(nèi)的16種無脊椎動物的TM，其中斑節(jié)蝦（Marsupenaeus japonicus）的TM的檢出限為0.09 ng/mL。

ELISA方法對于食品安全檢測具有一定意義，但在檢測深加工食品時，其致敏蛋白的一級結(jié)構(gòu)被破壞易造成假陰性結(jié)果。

3.1.2 側(cè)流免疫層析分析法

側(cè)流免疫層析分析法（lateral flow immunoassay，LFIA）是近些年較常用的免疫學(xué)分析檢測技術(shù)。其原理是基于競爭結(jié)合的方式，以硝酸纖維素膜為載體，通過在濾膜的檢測線和控制線上固定不同成分，以捕獲抗原與熒光物質(zhì)-單克隆抗體的復(fù)合物，捕獲后進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，通過肉眼觀察膜上的顯色現(xiàn)象判定結(jié)果。

Wang等[48]建立了基于量子點(diǎn)的熒光側(cè)流免疫層析分析法檢測甲殼類動物中的TM，30 min內(nèi)即可判定結(jié)果，肉眼可視化檢出限為0.5 μg/mL，儀器監(jiān)測熒光檢出限為 0.05 μg/mL。

LFIA具有良好的特異性和重復(fù)性，但操作時要求加樣精準(zhǔn)，操作不當(dāng)將產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果，在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。

3.2 超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

質(zhì)譜法（mass spectrometry，MS）是一種分子裂解后形成的離子按照其質(zhì)量和電荷的比值（質(zhì)荷比）大小依次排列成譜，從而記錄數(shù)據(jù)的方法。近年來，在質(zhì)譜儀器、分析軟件和各種化學(xué)工具發(fā)展的推動下，MS得以快速發(fā)展[49]。MS已成為一種研究蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)，其基于肽段進(jìn)行定性或定量分析，可避免因加工處理樣品時破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)而影響檢測結(jié)果，因此，MS檢測過敏原時比其他基于蛋白質(zhì)的方法更具優(yōu)勢，且提高了檢測效率[50]。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是20世紀(jì)70年代在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的一項高效靈敏的分離分析技術(shù)，可大大提高分離效率。近年來，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）或高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法被廣泛應(yīng)用于過敏原分析中，其為過敏原的檢測提供了更為有力的分析策略[51]。

李紫薇等[52]使用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）對酶解后的南極磷蝦（Euphausia superba）肽段進(jìn)行了分離檢測，并結(jié)合美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI） 蛋白數(shù)據(jù)庫、Skyline生物信息學(xué)軟件和三重四極桿質(zhì)譜對酶解肽段進(jìn)行驗(yàn)證，鑒定出南極磷蝦中兩種主要過敏原為TM和AK。Khanaruksombat等[53]使用LC-MS/MS結(jié)合SDSPAGE和WB對21例香蕉蝦（Fenneropenaeus merguiensis）不同位置過敏的患者血清進(jìn)行過敏原的測定，結(jié)果表明其肌肉和外殼中主要過敏原是AK，而卵巢中的主要過敏原是卵黃蛋白。

3.3 分子生物學(xué)方法

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其衍生技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）作為最原始的分子檢測技術(shù)，其應(yīng)用范圍甚廣。隨著人們生活水平的提高，對檢測技術(shù)的要求越來越嚴(yán)苛，普通PCR已經(jīng)無法滿足人們的需求，以PCR為基礎(chǔ)的一系列衍生技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中實(shí)時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）為最常用的方法。

實(shí)時熒光PCR定量檢測技術(shù)是在PCR的基礎(chǔ)上結(jié)合探針或熒光染料，通過熒光信號強(qiáng)度的變化判定結(jié)果，是一種有效的定量工具。Fernandes等[54]建立了一種針對多品種蝦類的實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測蝦類過敏原，并針對16S rRNA線粒體基因設(shè)計了特異性引物和探針。此方法可精準(zhǔn)定量檢測食品基質(zhì)中的微量蝦類過敏原，且有較高的靈敏度和較低的檢出限。蝦DNA的LOD為0.1 pg，蝦與醬的二元混合物的LOQ可達(dá)0.000 1%。M?DE等[55]選擇線粒體16S rRNA基因作為檢測食品中甲殼類動物的特異性基因，并設(shè)計了7對特異性引物和2組TaqMan探針，建立了實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)，其LOD95%為約每個反應(yīng)2.96個拷貝數(shù)。該研究著重強(qiáng)調(diào)了MgCl2和退火溫度均可能影響實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的靈敏度。

除qPCR以外，近些年液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[56]、多重 PCR（multiplex PCR，MPCR）[57]也被廣泛用于過敏原的檢測。Suh等[58]利用多重PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳法對包括凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）在內(nèi)的8種海鮮（共5對特異性引物）的過敏原進(jìn)行測定，凡納濱對蝦的LOD為0.016 ng。此方法可實(shí)現(xiàn)海鮮產(chǎn)品中多個致敏性軟體動物同時且高效的檢測，在加工食品中貝類過敏原的預(yù)防、標(biāo)記和監(jiān)測方面起到重要作用。

PCR及其衍生技術(shù)所需儀器均較昂貴且變溫循環(huán)耗時長，限制了其廣泛推廣。

3.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種常用的DNA擴(kuò)增技術(shù)，需4條～6條引物和Bst DNA聚合酶在60℃～65℃進(jìn)行體外等溫擴(kuò)增。

Sheu等[59]利用LAMP方法實(shí)現(xiàn)了食品中蝦類過敏原快速、靈敏的檢測，此方法的LOD為0.01%，靈敏度為10-3ng，其靈敏度比PCR高100倍。

LAMP反應(yīng)不需要昂貴的變溫設(shè)備，但引物的設(shè)計和反應(yīng)體系復(fù)雜，且引物間易相互作用，產(chǎn)生非特異性結(jié)果。

3.4 傳感器

傳感器作為一種新興的技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可以與其他技術(shù)和特殊材料結(jié)合的特點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。

3.4.1 表面等離子體共振

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是基于一種光學(xué)現(xiàn)象而建立的方法，即發(fā)生全反射產(chǎn)生的消逝波與介質(zhì)中的等離子波共振，使反射光能量減弱，折射指數(shù)改變，從而對蛋白質(zhì)定量。

Zhou等[60]利用表面等離子體共振傳感器與金生物芯片定量檢測了TM，其可以消除復(fù)雜貝類樣品的基質(zhì)干擾。該方法的LOD為1.0μg/mL，LOQ為2.5μg/mL。食品樣品中TM的回收率為92.0%～108.0%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

SPR方法對生物分子無任何損傷，且不需任何標(biāo)記物，響應(yīng)速度較快。

3.4.2 適配體生物傳感器

適體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）經(jīng)體外篩選獲得的一小段寡核苷酸序列或短的多肽，在傳感器中可與相應(yīng)的配體特異性結(jié)合，其親和力高、特異性強(qiáng)[61]。

Chinnappan等[62]開發(fā)了一種與氧化石墨烯（graphene oxide，GO）聯(lián)用的適配體生物傳感器，30 min內(nèi)可靈敏且特異地檢測原肌球蛋白（TM）。該傳感器使用熒光素染料標(biāo)記單鏈適體，構(gòu)建GO-適體復(fù)合物，通過GO的π堆積相互作用淬滅適體的熒光；而當(dāng)TM存在時，適體會首先與TM結(jié)合，適體從GO表面脫離，熒光恢復(fù)。通過記錄熒光強(qiáng)度的變化，檢測食品中是否含有TM。此傳感器使用較短的適體序列，提高了靈敏度，最低檢測限為2 nmol/L，且具有較高回收率。

3.4.3 金納米粒子生物傳感器

金納米粒子（gold nanoparticle，AuNP）是一種直徑為1 nm～100 nm的納米材料，其粒徑不同則呈現(xiàn)不同的顏色。因其電子密度很高，常被用作電鏡測試的標(biāo)記物。

Wang等[63]開發(fā)了一種基于金納米粒子的生物傳感器，主要用于貝類過敏原原肌球蛋白（tromyosin，TROP）的定性和定量檢測。通過檢測TROP單克隆抗體、AuNPs和TROP的復(fù)合物的三向色性（circular dichroism，CD）信號變化判斷結(jié)果。樣品中游離抗原作為抑制劑，其越多則形成的復(fù)合物越少，CD信號越小，根據(jù)信號強(qiáng)度可直接判定檢測結(jié)果。該生物傳感器可在0.1 ng/mL～15 ng/mL選擇性測定TROP，LOD為21 pg/mL，LOQ為70 pg/mL。此生物傳感器具有較強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性，且樣品制備簡單，在檢測貝類相關(guān)產(chǎn)品及其他的食物過敏原時具有良好適用性。

3.4.4 納米磁珠生物傳感器

近些年，納米磁珠被廣泛用于傳感器技術(shù)的開發(fā)。傳感器與納米磁珠結(jié)合，其靈敏度大大提高，檢出限有所降低，操作也變得簡單易懂，具有潛在的應(yīng)用價值。

Zhang等[64]采用基于磁納米顆粒的熒光分析法對食品基質(zhì)中過敏原TM進(jìn)行檢測。此傳感器將功能化磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）作為分離載體，以O(shè)liGreen染料作為信號探針，可以與單鏈DNA特異結(jié)合，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號。當(dāng)TM存在時，TM與適體結(jié)合，導(dǎo)致適體-MNPs復(fù)合物構(gòu)象發(fā)生變化，適體被釋放到上清液中。加入OliGreen染料后，其與上清液中的適體結(jié)合，熒光信號增強(qiáng)超過1 000倍。該方法檢測食品中TM的LOD為77 ng/mL。

3.4.5 熒光磁珠細(xì)胞傳感器

Jiang等[65]開發(fā)了基于熒光磁珠的新型電化學(xué)細(xì)胞傳感器，通過產(chǎn)生的特定電化學(xué)信號準(zhǔn)確檢測和評估食品基質(zhì)中各種過敏原，其中蝦過敏原Pen a 1的檢出限為0.03 μg/mL。與2013年該團(tuán)隊開發(fā)的細(xì)胞傳感器相比[66]，該傳感器檢測更靈敏，其檢出限降低了一個數(shù)量級。

電化學(xué)傳感器可與免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和細(xì)胞檢測相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)食品中過敏物質(zhì)的高效、靈敏檢測。這些技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用可在一定程度上提高食品安全監(jiān)控的力度[67]。

4 展望

蝦類物質(zhì)引起的食物過敏隨著人們對蝦需求量的不斷增加而呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，對蝦致敏蛋白和檢測技術(shù)的深入研究至關(guān)重要。今后應(yīng)持續(xù)發(fā)掘蝦類新的過敏原以及加深對過敏原的研究，拓寬對現(xiàn)有過敏原的認(rèn)知度。另一方面，應(yīng)綜合現(xiàn)有檢測方法的優(yōu)勢，開發(fā)更加低廉、便捷、高效、強(qiáng)特異性、高靈敏度的先進(jìn)檢測技術(shù)和微型化、智能化的檢測設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)高通量現(xiàn)場檢測，降低食物過敏的風(fēng)險，最大程度保障過敏患者的安全健康。