真菌性角膜炎基因表達(dá)的臨床研究

王 旭，王巧玲，張玉光*，張晨明，黨 惠，位 寧，丁 剛，高 芯

（濟(jì)南市第二人民醫(yī)院眼科，山東 濟(jì)南 250012）

真菌性角膜炎（Fungal Keratitis，F(xiàn)K）是我國(guó)角膜病致盲的重要病因， 而且發(fā)病率逐年上升[1]。在世界范圍內(nèi)也是致盲率很高的感染性眼病，發(fā)病率也在逐漸增加，因此，對(duì)該病的早期診斷，早期治療至關(guān)重要，減少誤診，避免造成嚴(yán)重后果，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 樣本和方法

樣本分析：

（1）人角膜組織樣本

20份人角膜組織樣本均來(lái)自濟(jì)南市第二人民醫(yī)院眼六科，10例為正常角膜組織、10Loi為真菌性角膜炎角膜組織，所選取樣本流程、操作均與我國(guó)醫(yī)學(xué)倫理會(huì)委員制度要求相符，其中真菌性角膜炎角膜組織取材于真菌性角膜炎角膜移植切除術(shù)后組織，10例患者術(shù)前裂隙燈檢查顯示角膜潰瘍面積均大于5×5 mm，有不同程度的前房積膿，需要行穿透性角膜移植手術(shù)治療，術(shù)前均進(jìn)行菌絲涂片檢查，顯示7眼為鐮刀菌感染，3眼為曲霉菌感染[2]。正常角膜組織取材于10例供體角膜術(shù)后剩余組織。

（2）角膜組織樣本的取材

手術(shù)中切下病變組織后，切取其3/4部分在十分鐘內(nèi)放入-80℃深低溫保存待檢，剩余1/4部分送病理檢查，由2位病理科醫(yī)生分別進(jìn)行病理診斷以確定臨床診斷及標(biāo)本的可用性。選取十個(gè)新鮮人角膜，用環(huán)鉆鉆取中央透明角膜用于臨床移植（直徑＜7 mm），然后延角膜緣灰線剪下透明角膜組織，迅速放入-80℃深低溫保存待檢。

2 信息分析流程

2.1 進(jìn)行常規(guī)流程的信息分析

對(duì)項(xiàng)目信息數(shù)據(jù)的計(jì)算，使用線性模型校驗(yàn)P-value是否存在顯著差異，另外對(duì)所得檢驗(yàn)值再使用Benjamini-Hochberg法加以校正（FDR）?；蚍巷@著性差異判定的依據(jù)是：|Fold Change|＞3同時(shí)FDR＜0.05。另外，對(duì)兩樣本組中，處于所有探針組信號(hào)強(qiáng)度排序的最低20%范圍內(nèi)的探針組，視為背景噪音，篩選并濾除[3]。之后，使用變異系數(shù)法，對(duì)相同探針組于同一樣本組中的變異系數(shù)（Eq 1-2）進(jìn)行計(jì)算，對(duì)所得值＞25%的探針組濾除。經(jīng)上述預(yù)處理之后，剩余探針數(shù)量具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表1所示。

2.2 微陣列數(shù)據(jù)采集和預(yù)處理

基因表達(dá)譜：在E-GEOD-58291的微陣列數(shù)據(jù)中，有10個(gè)角膜炎樣本和10個(gè)正常樣本。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理，我們最終獲得了含有1714個(gè)基因的基因表達(dá)矩陣，709個(gè)上調(diào)基因，1005個(gè)下調(diào)基因。基于KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因表達(dá)矩陣的途徑富集分析[4]。我們將基因表達(dá)數(shù)據(jù)與KEGG調(diào)控途徑合并，并選擇了基因重疊大于10的26條差異顯著途徑。

表1 數(shù)據(jù)過(guò)濾前后探針（組）統(tǒng)計(jì)

2.3 Hub基因鑒定

Hub基因被稱作樞紐基因或中樞基因，與某些臨床特征高度相關(guān)的基因，分析差異途徑中的基因以發(fā)現(xiàn)通路基因集合，并對(duì)它們?cè)诓町愅緩街械念l率進(jìn)行計(jì)數(shù)。 隨后，將通路基因組轉(zhuǎn)換成MC，然后進(jìn)行吉布斯取樣。最后選擇皮爾遜相關(guān)性絕對(duì)值（cor.genemodembership）＞0.8和臨床特質(zhì)關(guān)系（Pearson's correlation，cor.genetraitsignificant）＞0.2的差異途徑基因作為樞紐基因。

3 結(jié) 果

為了獲得與真菌性角膜炎相關(guān)的潛在Hub基因，吉布斯采樣被重新利用以計(jì)算途徑基因組的概率。基于adj_αPI＞0.8鑒定了10個(gè)基因座基因，包括KRT16（角蛋白16），MMP9，DEFB4A，MMP1，IL36G，GEM，TAC1，ANGPT1，EDN3C7。它們?cè)谡：驼婢越悄ぱ谞顟B(tài)下的基因表達(dá)譜顯示，與正常組相比，KRT16，MMP9，DEFB4A，MMP1，IL36G在真菌性角膜炎組中顯著增強(qiáng)（P＜0.05），GEM，TAC1，ANGPT1，EDN3，C7在真菌性角膜炎組中顯著減弱。

4 討 論

采取通路分析這一途徑，能更為直接、全面且系統(tǒng)性的了解到細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程、疾病發(fā)生機(jī)理和藥物作用發(fā)揮機(jī)制等內(nèi)容。大多數(shù)I型細(xì)胞角蛋白由酸性蛋白組成，它們排列成成對(duì)的異型角蛋白鏈，聚集在17q12-q21染色體的區(qū)域。DEFB4A（defensin beta 4A，防御素β-4A）表達(dá)上調(diào)：防御素是由嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的殺微生物和細(xì)胞毒性肽家族[5]。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了與真菌性角膜炎相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵途徑，因此，監(jiān)測(cè)這些信號(hào)通路可能有助于預(yù)測(cè)或治療真菌性角膜炎的發(fā)生和發(fā)展。真菌性角膜炎中的Hub基因，即KRT16，MMP9，DEFB4A，MMP1，IL36G，GEM，TAC1，ANGPT1，EDN3及C7基因是基于使用吉布斯采樣的途徑基因集確定的。這個(gè)結(jié)果有可能是我們未來(lái)作為真菌性角膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，而且以此為依據(jù)，可以為以后真菌性角膜炎的藥物治療或者抗真菌藥物的研發(fā)提供有意義的指導(dǎo)。