廣東絲瓜醇提物抗氧化和抑制亞硝化活性

魏愛紅 ，田程，莊遠杯 ，劉小敏 ，李榕娣 ，張聲源 *

1. 嘉應學院醫(yī)學院（梅州 514031）；2. 嘉應學院醫(yī)學院客家藥用生物資源研究所（梅州 514031）

癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化等重大疾病都與體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生有密切關聯(lián)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年約有500萬人被癌癥奪取生命[2]。亞硝胺是公認的最強的化學致癌物之一，能導致食管癌、胃癌等消化道病變[3]。研究顯示，果蔬植物中富含的多酚類、黃酮類等物質(zhì)具有抗氧化和抑制亞硝化活性[4]。從天然果蔬中尋求安全、低毒的抗氧化劑和抑制亞硝化劑越來越受廣大學者的關注。

廣東絲瓜（Luffa acutangula（L.）Roxb.）為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（LuffaMill.）一年生的攀緣性草本植物[5]，其果實可作疏菜食用，為南方特色藥食兩用植物。廣東絲瓜味甘，性平，歸肺、肝、胃經(jīng)，具有通經(jīng)活絡、解毒消腫等功效，民間常以絲瓜絡、藤葉、種子及根部位入藥[6]。臨床常用于乳汁不通、胸脅疼痛、肺熱咳嗽、癰腫瘡毒、乳癰[7]。目前，對廣東絲瓜的研究聚焦在品種篩選[8]、栽培技術[9]等方面，在藥食兩用方面的現(xiàn)代基礎研究相對薄弱，其在抗氧化和抑制亞硝化方面的研究尚未見報道。為進一步全面比較廣東絲瓜不同部位的活性作用，試驗對莖、葉、種子、絲瓜絡和果實5個部位乙醇提取物進行體外抗氧化及亞硝化抑制作用評價，進而為擴大廣東絲瓜各個部位的藥食兩用及資源綜合利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣東絲瓜采自于廣東省梅州市，經(jīng)嘉應學院醫(yī)學院張聲源副教授鑒定。樣品果實、莖、葉、種子和絲瓜絡5個部位晾干、粉碎，于4 ℃冰箱冷藏備用。

維生素C（VC，隴西科學股份有限公司，批號1612131）；沒食子酸標準品（上海金穗生物科技有限公司，批號20160410）；2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，阿拉丁，批號F1719012）；蘆丁標準品（成都昂賽斯生物科技有限公司，批號20160815）；福林酚試劑（上海金穗生物科技有限公司，批號2016108）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海伊卡生物技術有限公司，批號STBB0829V）；氫氧化鈉；硝酸鋁；無水碳酸鈉；對氨基苯磺酸；鐵氰化鉀；亞硝酸鈉；三氯化鐵；無水檸檬酸；二甲胺；鹽酸萘乙二胺；過硫酸鉀、三氯乙酸等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

WJX-A1000型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；UX420H型千分之一分析天平（日本島津公司）；WA20005型電子微量天平（上海方瑞儀器有限公司）；N-1100V型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；GL-25M型離心機（上海趙迪生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 廣東絲瓜乙醇提取物的制備

廣東絲瓜不同部位（果實500.0 g 、葉250.0 g、絲瓜絡250.0 g、種子150.0 g、莖250.0 g），經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，按料液比1∶2（g/mL）加入95%乙醇超聲提取3次，合并提取液，減壓濃縮得廣東絲瓜不同部位乙醇提取物（果實7.1 g、葉9.5 g、絲瓜絡6.7 g、種子5.2 g、莖6.3 g）。

1.3.2 總酚、總黃酮含量的測定

1.3.2.1 Folin-Ciocaileu比色法測總酚含量

參考李娟等[10]的方法。取1 mL沒食子酸標準溶液或樣品、6.0 mL蒸餾水和0.5 mL福林試劑于10 mL棕色具塞比色管中，充分搖勻避光靜置2 min，加入2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，充分混勻后在40 ℃水浴中避光放置60 min，冷卻，在760 nm波長處測定其吸光度（A），以沒食子酸吸光度為縱坐標Y，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標X，繪制標準曲線：Y=7.762 5X+0.091 1，R2=0.999 1。根據(jù)標準曲線回歸方程計算各樣品的總酚含量，用沒食子酸（Gallic acid，GA）當量表示（即每克樣品中酚類化合物相當于多少毫克沒食子酸mg GA/g）。

1.3.2.2 硝酸鋁法測總黃酮含量

參考廉美娜等[11]的方法。精密吸取1 mL不同稀釋度蘆丁標準溶液或樣品于25 mL棕色具塞比色管中，各加蒸餾水至7.0 mL，再加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，充分搖勻靜置4 min，加入1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，充分搖勻后靜置4 min，加入10.0 mL 4%氫氧化鈉試液，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，靜置15 min，以試液空白為參比，在500 nm處測吸光度，平行測定3次。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y，繪制標準曲線：Y=13.638X-0.032 7，R2=0.999 6。根據(jù)標準曲線的回歸方程計算各樣品的總黃酮含量，用蘆?。≧utin，RT）當量表示（即每克樣品中總黃酮類化合物相當于多少毫克蘆丁mg RT/g）。

1.3.3 抗氧化活性評價

1.3.3.1 DPPH自由基的清除能力

參考景臨林等[12]的方法。取1.0 mL樣品或陽性對照VC溶液，和1.0 mL DPPH溶液混合，暗處靜置反應20 min，以溶劑做空白對照，測定其在波長517 nm處的吸光度（Ai）；測定1.0 mL DPPH溶液與1.0 mL溶劑混合后在波長517 nm處的吸光度（A0）；測定1.0 mL溶劑與1.0 mL樣品在波長517 nm處的吸光度（Aj）。按式（1）計算出樣品和VC溶液對DPPH自由基的清除率。通過擬合曲線計算DPPH自由基的半數(shù)清除質(zhì)量濃度IC50（IC50值越小，抗氧化活性越大）。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力

參考潘喬丹等[13]的方法。取100 μL樣品或VC溶液于試管中，再加入3.9 mL ABTS工作液，振蕩，于暗處室溫反應10 min，測定其在波長734 nm處的吸光度（Ai）。同法測定3.9 mL ABTS工作液與100 μL溶劑混合后在波長734 nm處的吸光度（A0），3.9 mL磷酸緩沖溶液與100 μL樣品在波長734 nm處的吸光度（Aj）。按式（1）計算出樣品和VC溶液對ABTS自由基的清除率。通過擬合曲線計算ABTS自由基的半數(shù)清除質(zhì)量濃度IC50（IC50值越小，抗氧化活性越大）。

1.3.3.3 鐵還原能力的測定

參考李培源等[14]的方法。取2.5 mL樣品、2.5 mL pH 6.6的PBS緩沖液和2.5 mL K3[Fe(CN)6]溶液于10 mL試管中，搖勻后在50 ℃下恒溫水浴反應20 min，急速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分搖勻后轉移到10 mL離心管中，在6 000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液于試管中，依次加入2.0 mL蒸餾水與0.5 mL FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min后于700 nm測定吸光度。以VC溶液為陽性對照重復上述操作。

1.3.4 抑制亞硝化作用評價

參考林棟等[4]的方法。取1.0 mL樣品、2.0 mL pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和2.0 mL亞硝酸鈉溶液于比色管中，混勻。在37 ℃下水浴1 h，取出，加入2.0 mL 0.4%對氨基苯磺酸，混勻，靜置5 min后，加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min后在538 nm下測定吸光度，同時用VC進行對照試驗。按式（2）計算出樣品和VC溶液對亞硝酸鹽的清除率。

式中：A0為空白反應體系的吸光度；Ai為樣品反應體系的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示，采用Origin 2017對數(shù)據(jù)進行繪圖，利用IBM SPSS Statistics 25對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、Duncan檢驗差異顯著性分析以及Pearson檢驗相關性分析，p＜0.05表示有統(tǒng)計學顯著性差異，p＜0.01表示有統(tǒng)計學極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 廣東絲瓜不同部位總酚、總黃酮的含量對比

由表1可知，廣東絲瓜不同部位的總酚和總黃酮含量差異顯著（p＜0.05）?？偡雍看笮∫来螢楣麑崳厩o＞葉＞種子＞絲瓜絡?？傸S酮含量大小依次為莖＞種子＞葉＞絲瓜絡＞果實。

表1 廣東絲瓜不同部位總酚、總黃酮含量

2.2 抗氧化活性評價

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，廣東絲瓜不同部位乙醇提取物對DPPH自由基的清除率呈量效關系，大小為莖＞葉＞絲瓜絡＞果實＞種子。對DPPH自由基清除率的IC50分別為莖（0.84±0.13 mg·mL-1）、葉（1.09±0.12 mg·mL-1）、絲瓜絡（1.31±0.56 mg·mL-1）、果實（1.58±0.42 mg·mL-1）、種子（1.64±0.36 mg·mL-1），均高于VC的0.003 2±0.000 2 mg·mL-1。說明廣東絲瓜5個部位乙醇提取物均具有清除DPPH自由基能力，但均弱于VC。

圖1 廣東絲瓜不同部位對DPPH自由基清除能力

2.2.2 ABTS自由基的清除能力

由圖2可知，廣東絲瓜不同部位乙醇提取物對ABTS自由基的清除率呈量效關系，大小為莖＞果實＞絲瓜絡＞葉＞種子。對ABTS自由基清除率的IC50分別為莖（2.55±0.09 mg·mL-1）、果實（3.22±0.17 mg·mL-1）、絲瓜絡（4.38±0.78 mg·mL-1）、葉（5.98±0.32 mg·mL-1）、種子（7.55±0.96 mg·mL-1），均高于VC的0.027±0.000 3 mg·mL-1。說明廣東絲瓜5個部位乙醇提取物均具有清除ABTS自由基能力，但均弱于VC。

圖2 廣東絲瓜不同部位對ABTS自由基清除能力

2.2.3 鐵還原能力的測定

由圖3可知，當質(zhì)量濃度為0.5～8 mg·mL-1時，隨質(zhì)量濃度增加，吸光度逐漸增大，說明鐵還原能力逐漸增大，鐵還原能力大小依次為果實＞莖＞種子＞絲瓜絡＞葉，但弱于VC。

圖3 廣東絲瓜不同部位對鐵還原能力的影響

2.3 抑制亞硝化作用評價

由圖4可知，廣東絲瓜不同部位乙醇提取物對亞硝酸鹽清除率呈量效關系，大小為果實＞種子＞葉＞絲瓜絡＞莖。對亞硝酸鹽清除率的IC50分別為果實（11.38±1.56 mg·mL-1）、種子（11.82±1.78 mg·mL-1）、葉（13.10±0.49 mg·mL-1）、絲瓜絡（16.22±2.58 mg·mL-1）、莖（57.24±2.12 mg·mL-1），均高于VC的2.909±0.242 mg·mL-1。說明廣東絲瓜5個部位乙醇提取物均具有清除亞硝酸鹽能力，但均顯著弱于VC。

圖4 廣東絲瓜不同部位對亞硝酸鹽清除能力的影響

2.4 總酚、總黃酮含量與抗氧化和抑制亞硝化能力的相關性分析

由表2可知，廣東絲瓜乙醇提取物中總酚、總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、鐵還原能力、亞硝酸鹽清除能力呈極顯著正相關?？偡雍颗cDPPH自由基清除、鐵還原能力、亞硝酸鹽清除的相關性高于總黃酮，總黃酮含量與ABTS自由基清除能力相關性高于總酚。

表2 相關性分析結果

3 討論與結論

廣東絲瓜在民間具有食用基礎和藥用習慣，但鮮有關于其抗氧化和抑制亞硝化作用的藥理、藥效方面的研究。此試驗通過測定廣東絲瓜不同部位乙醇提取物中總酚和總黃酮的含量，評價其抗氧化和抑制亞硝化活性。廣東絲瓜不同部位總黃酮和總酚含量不同，其原因可能是植物不同部位基因的特異表達轉錄和植物在生長發(fā)育過程中各器官起到不同作用，產(chǎn)生不同的生理代謝，從而使不同部位的代謝物含量存在明顯的差異[15-16]。廣東絲瓜莖提取物清除DPPH自由基能力和ABTS自由基能力最強，果實提取物對鐵還原能力清除亞硝酸鹽能力最強。表明莖和果實可作為一種潛在抗氧化和抑制亞硝化作用的功能性食品原料進行開發(fā)利用。此外，廣東絲瓜5個部位乙醇提取物的抗氧化活性和抑制亞硝化活性與其總酚和總黃酮含量均呈極顯著正相關（p＜0.01），提示尋找廣東絲瓜的抗氧化和抑制亞硝化活性成分應從酚類或黃酮類成分著手。目前，關于植物源抗氧化和抑制亞硝化活性成分篩選的研究較多，而對其構效關系、作用機制、成分間的協(xié)同或拮抗作用等研究仍缺乏系統(tǒng)性，尚未形成規(guī)律性的科學依據(jù)和結論[17]。為此，后續(xù)研究中應加大對廣東絲瓜中酚類和黃酮類成分種類、結構、抗氧化、抑制亞硝化活性作用機制及構效關系等方面的系統(tǒng)研究。