宮頸癌組織bFGF 表達(dá)與臨床病理特征及HR-HPV病毒載量的關(guān)系

馬金平，王雅莉，婁歡，李紅娟

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450000）

細(xì)胞因子或者癌基因水平的改變,能夠影響到柱狀上皮的早期異常分裂過程,最終促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[1]。生長(zhǎng)因子調(diào)控蛋白的波動(dòng)能影響癌基因的激活,加劇癌基因?qū)δ[瘤增殖的影響[2]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）是生長(zhǎng)因子家族成員，其對(duì)于下游癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的上調(diào)作用,能夠促進(jìn)腫瘤信號(hào)通路蛋白的交錯(cuò)激活,促進(jìn)了癌細(xì)胞對(duì)于局部癌旁組織的侵襲[3]。有部分研究者探討了b FGF 在宮頸癌患者中的表達(dá)情況,認(rèn)為在宮頸癌患者中，bFGF 蛋白的表達(dá)濃度明顯上升[4]，但關(guān)于其與宮頸癌患者體內(nèi)高危型人乳頭瘤狀病毒 （HRHPV）載量關(guān)系的研究甚少。本研究探討了宮頸癌組織bFGF 表達(dá)情況及其與宮頸癌病理學(xué)特征、高危型人乳頭瘤狀病毒（HR-HPV）病毒載量的關(guān)系，旨在為宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象的資料情況 選取 2018 年 1 月-2019 年1 月病理科收集的90 例宮頸癌組織作為宮頸癌組,癌旁組織標(biāo)本為對(duì)照組。年齡44～65 歲，平均54.3±7.4 歲,依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)盟分期(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)：其中Ⅰ期宮頸癌22 例，Ⅱ期宮頸癌42 例，Ⅲ期宮頸癌20 例，Ⅳ期宮頸癌6 例；宮頸癌組織病理學(xué)分化情況：高、中、低分化患者分別為31 例、35例、24 例；其中檢測(cè)出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者39 例；肌層浸潤(rùn)深度≥1/2 的宮頸癌患者有35 例；腫瘤病灶：≥3.0 cm 47 例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合中華婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)制定的《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》中的宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；⑵經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí),病理診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)女性生殖系統(tǒng)疾病學(xué)組及中國(guó)優(yōu)生科學(xué)協(xié)會(huì)陰道鏡與宮頸病理學(xué)會(huì)病理學(xué)組發(fā)布的 《宮頸癌及癌前病變病理診斷規(guī)范》中規(guī)定的取材、操作及診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑶均為首次診斷的患者，既往無放化療史；⑷本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴有其他部位的惡性腫瘤；⑵手術(shù)后復(fù)發(fā)的宮頸癌患者；⑶甲狀腺功能障礙患者；⑷合并宮頸、生殖系統(tǒng)其他重大疾病的宮頸癌患者。

1.3 免疫組化檢測(cè) 采用石蠟切片，脫水操作后采用3%H2O2室溫條件下孵育20min， 磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次5min，磷酸鹽緩沖液稀釋后的山羊血清封閉抗體5min，倒去血清后不清洗，加入一抗（購(gòu)自賽默飛世爾中國(guó) 濃度：1：1000）5ml，37℃孵育2h，或者放置4℃冰箱過夜孵育，磷酸鹽緩沖液清洗3 次,每次5min,加入生物素?zé)晒鈽?biāo)記的二抗（購(gòu)自賽默飛世爾中國(guó) 濃度：1：2000）3ml，37℃孵 育20～30min，磷酸鹽緩沖液清洗 3 次，每次 5min，加入Streptavidin/HRP 辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育20～30min,磷酸鹽緩沖液清洗3 次,每次5min,增強(qiáng)型HRP-DAB 底物顯色試劑盒 (PA110)顯色，自來水沖洗，復(fù)染，封片。

bFGF 蛋白主要表達(dá)在宮頸癌組織細(xì)胞的細(xì)胞漿，顯微鏡下觀察呈黃色、棕黃色、褐色則表現(xiàn)為陽(yáng)性表達(dá)[9]，⑴依據(jù)bFGF 蛋白陽(yáng)性染色強(qiáng)度：無色(0 分)、淡黃色(1 分)、棕黃色(2 分)、褐色(3 分)；⑵bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占視野下所有細(xì)胞的比例：占比≤10%為 1 分、占比范圍 11%～50%(2 分)、占比范圍 51%～75%(3 分)、占比范圍＞75%(4 分)，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性染色細(xì)胞占比范圍積分的乘積為總分，總分＜3 分為陰性、≧3 分為陽(yáng)性。

1.3 HC2-HPV-DNA 檢測(cè)及評(píng)價(jià) 常規(guī)窺器暴露宮頸后,將HPV 采樣刷放置于宮頸口按逆時(shí)針轉(zhuǎn)3圈,并停留10s。將需要部分采樣刷留在標(biāo)本儲(chǔ)藏瓶中，密閉后做好標(biāo)記并送檢。采用雜交捕獲法并應(yīng)用基因雜交信號(hào)放大系統(tǒng)（DML2000TM,美國(guó)Digene 公司提供） 進(jìn)行 HC2-HPV-DNA 檢測(cè)，HPV試劑盒為上海萊特公司提供,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。以光量讀數(shù)與陰性測(cè)定值的比值（RLU/CO）對(duì)HPV 病毒載量進(jìn)行劃分, 由于RLU/CO 離散度較大，因此對(duì)其進(jìn)行常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（即lg RLU/CO）將 HPV 病毒載量分為＜1,1～＜2，2～＜3，≥3 四個(gè)等級(jí)。HR-HPV 載量分析：同一級(jí)別宮頸病變，HPV載量越高,患病的危險(xiǎn)度越高；不同級(jí)別宮頸病變，HPV 載量越高，患高級(jí)別病變的危險(xiǎn)度越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究收集的所有數(shù)據(jù)均在SPSS21.0 中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，年齡采用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，數(shù)據(jù)比較分析應(yīng)用t 檢驗(yàn)；χ2檢驗(yàn)分析bFGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率；bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與HRHPV 病毒載量的關(guān)系采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 宮頸癌組bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

2.2 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同F(xiàn)IGO 分期、 是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織中bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同組織學(xué)分化程度、分型、不同病灶大小、不同肌層浸潤(rùn)深度的宮頸癌組織中bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表1 二組bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

表2 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與患者病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與HR-HPV 病毒載量的關(guān)系 宮頸癌組織中bFGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)者HR-HPV 病毒載量的總體分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見表3。

3 討論

表3 宮頸癌組織中的bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與HR-HPV 病毒載量的關(guān)系

高危型HPV 病毒特別是HPV16、HPV18 病毒感染，能顯著促進(jìn)宮頸柱狀上皮細(xì)胞異常分裂，在E6/E7 蛋白高度整合宿主細(xì)胞的過程中, 高危型HPV 感染導(dǎo)致的宮頸癌發(fā)病率持續(xù)上升[6]。臨床上宮頸癌患者的中晚期階段病情進(jìn)展速度較快，遠(yuǎn)期帶瘤生存時(shí)間較短,宮頸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高[7,8]?，F(xiàn)階段缺乏對(duì)宮頸癌綜合性病情評(píng)估的可靠指標(biāo)，雖然鱗狀上皮細(xì)胞抗原能發(fā)揮一定作用，但評(píng)估宮頸癌臨床病理特征的滿意度仍然較低[9,10]。本次研究通過對(duì)宮頸癌患者病灶組織中bFGF 蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析研究,不僅能深入揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制,而且還能為宮頸癌臨床病理特征或者綜合性病情評(píng)估提供依據(jù)。

bFGF 蛋白主要表達(dá)于間質(zhì)組織、胚胎組織及未分化成熟組織中，在炎癥、損傷修復(fù)或者惡性腫瘤患者中，由于機(jī)體反饋性調(diào)節(jié)系統(tǒng)的激活，bFGF蛋白的表達(dá)濃度均可顯著上升。bFGF 蛋白對(duì)上皮細(xì)胞增殖狀態(tài)的誘導(dǎo)作用能提高上皮細(xì)胞的擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)，抑制早期癌細(xì)胞的凋亡。部分學(xué)者的研究認(rèn)為bFGF 蛋白的高表達(dá)能夠促進(jìn)卵巢癌或者子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[11]，但關(guān)于其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系研究較少，同時(shí)未能深入揭示bFGF 蛋白與HR-HPV 的關(guān)系。

本研究免疫組化結(jié)果提示,宮頸癌組織中bFG F 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織。bFGF 蛋白的高表達(dá)主要在腫瘤生物學(xué)特征惡化、腫瘤信號(hào)通路激活或者癌基因損傷修復(fù)方面發(fā)揮作用,進(jìn)而持續(xù)維持癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)錄過程。有研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌組織中,bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率可超過65%，而在有明顯的宮旁組織或盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率可進(jìn)一步升高[12,13]，提示bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)能顯著加劇宮頸癌進(jìn)展。分析原因可能與bFGF 蛋白高表達(dá)能提高腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)范圍，促進(jìn)其對(duì)陰道壁或?qū)m旁組織的侵襲，最終促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展有關(guān)；而bFGF 蛋白對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響, 主要在于其能提高淋巴結(jié)內(nèi)皮黏附分子snail 的激活程度，而最終促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而本研究結(jié)果顯示，bFGF 蛋白表達(dá)并不會(huì)影響癌細(xì)胞的分化過程。

宮頸癌組織bFGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者中，HR-HPV 病毒載量較高,表明宮頸癌患者HR-HPV病毒載量可能影響bFGF 蛋白的表達(dá)。而以往研究認(rèn)為，HPV E6 蛋白是HR-HPV 的主要轉(zhuǎn)化蛋白，主要通過使P53 泛素化分解而使其失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)作用,最終引起細(xì)胞過度增生并向惡性轉(zhuǎn)化[14-16]。HR-HPV 可能就是通過P53 調(diào)節(jié)通路上調(diào)bFGF 蛋白表達(dá)，而顯著加劇病毒顆?；?qū)τ趯m頸細(xì)胞的整合程度,進(jìn)而導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞的癌變過程, 這也可能是HR-HPV 導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一[17], 但仍有待進(jìn)一步的研究予以證實(shí)。

綜上所述，bFGF 蛋白在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，HRHPV 可能通過上調(diào)bFGF 蛋白表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。