蔥白提取物對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌細胞凋亡的作用及機制研究

楊劍鋒，柯于鶴，雷 杰，田立群*

（1. 神農(nóng)架林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，湖北 神農(nóng)架 442421；2. 武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院，湖北 武漢 430022）

急性心梗發(fā)生后，臨床上通過溶栓或冠脈介入等方法能夠極大地恢復心肌灌注能力，減少心肌梗死面積，改善心功能，但同時因為血流恢復可能造成心肌缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，I/R）。它主要表現(xiàn)為心肌持續(xù)缺血一段時間后再次恢復供血，而心肌的結構損傷和功能障礙加重。目前認為該過程的發(fā)生與氧自由基增加［1］、Ca2+超載［2］、代謝紊亂［3］等密切相關。最近研究人員進一步發(fā)現(xiàn)I/R 與心肌細胞凋亡密切相關［4-5］，當心肌細胞受損時，促凋亡物質(zhì)如凋亡誘導因子、細胞色素C 等釋放，會加速心肌細胞凋亡，故防止或減輕心肌細胞凋亡是防治I/R 的重要手段。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蔥白提取物（fistular onion bulb，F(xiàn)OB）在心肌缺血再灌注過程中，能明顯縮小大鼠I/R 心肌梗死面積，改善心功能，降低心肌細胞的凋亡率［6-7］。為進一步研究FOB在I/R 的保護機制，本課題擬構建I/R 大鼠模型，探討FOB 對I/R 大鼠心肌組織的影響，并從p38 MAPK 信號通路研究對細胞凋亡的影響，為臨床心肌缺血再灌注損傷的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SD 雄性大鼠，SPF 級，36 只，體質(zhì)量200 ～220g，購于湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號：SYXK（鄂）2017-0067。

1.1.2 藥物 蔥白提取物（武漢市第一醫(yī)院提供，批號：20170326）。

1.1.3 試劑 大鼠p38、p-p38（磷酸化）、p53，β 微管蛋白（β-tubulin）抗體（武漢ABclonal 生物科技有限公司，批號分別為：A5521、AP0056、A0225），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體（武漢ABclonal 生物科技有限公司，批號為：AS003），其余試劑均為市售分析純。

1.1.4 儀器 117122004 型超凈臺（美國Thermo 公司），超低溫冰箱（SANYO，日本），EG1150 組織包埋機（徠卡公司，德國），CM1520 組織切片機（Leica 公司，德國），DMi8 倒置顯微鏡（德國Leica 公司），5418R 型高速冷凍離心機（艾本德公司，德國），Mini-PROTEANTetra 型電泳槽，Mini-PROTEA 型轉印槽，GelDoc XR 型凝膠成像系統(tǒng)（伯樂公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機數(shù)字表法分為sham 組、I/R 組、FOB 組，每組12 只。

1.2.2 給藥 sham 組與I/R 組按10 mL/kg 灌胃蒸餾水，F(xiàn)OB 組按600 mg/kg 灌胃給藥，給藥體積為2 mL/kg，每天1 次，連續(xù)14 d。

1.2.3 大鼠I/R 模型建立 參考文獻［8］建立模型。大鼠用10%戊巴比妥鈉，40 mg/kg 麻醉后，仰臥固定。氣管切開人工呼吸機進行機械通氣，呼吸頻率為60 ～65 次/min。充分暴露心臟后，在冠狀動脈左前降支以下約2 mm 處穿線，穩(wěn)定10 min 后閉合胸腔，以心電圖QRS 波加大，ST 抬高作為缺血成功的標準。結扎45 min 后松開結扎部位，實現(xiàn)再灌注過程。sham 組只穿線不結扎，其余操作同模型組。

1.2.4 心功能檢測 造模后通過PowerLab 多導生理記錄儀進行數(shù)據(jù)采集和分析左心室功能變化。主要指標如下：心率（HR）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室壓力最大上升和下降速率（+dP/dtmax，-dP/dtmax）。

1.2.5 TUNEL 染色檢測 給藥結束后24 h，每組取6 只大鼠，以10%戊巴比妥鈉，40 mg/kg 麻醉，采集結扎線以下心肌組織，生理鹽水沖洗，10%甲醛固定，包埋，切片，抗原修復，脫蠟，漂洗。配制TUNEL 反應液，按照說明書操作；每只大鼠取3 張切片，每片鏡下（40 × 10）取缺血區(qū)5 個視野，采用Image Pro Plus 6.0 記錄，并計算細胞凋亡率。

1.2.6 Western Blot 檢測p38 等蛋白表達 給藥結束后24 h 采取心肌組織，使用心肌組織勻漿，隨后4 ℃離心5 min（12 000g）取上清。取60 μg 樣品進行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，p38 抗體、p-p38（磷酸化）抗體、p53 抗體（稀釋倍數(shù)1∶500）4 ℃孵育過夜，次日洗去一抗，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加二抗（稀釋倍數(shù)1∶1 000）室溫孵育2 h，以β-tubulin 為內(nèi)參對照，顯影，拍片，Image J 軟件分析。

1.2.7 RT-PCR 檢測目的基因 使用給藥結束后24 h 采取的心肌組織，Trizol 提取心肌總RNA，逆轉錄為cDNA，GAPDH 作為內(nèi)參，分別擴增目的基因。反應體系20 μL，反應條件：95 ℃預變性90 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán)；擴增反應結束由65 ℃升至95 ℃，采用2-△△CT相對定量法計算基因表達并統(tǒng)計分析。引物由谷歌生物科技有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 各引物序列號Tab.1 Primer serial number

1.2.8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差（±s）表示，SPSS 18.0 軟件分析，單因素方差分析比較多組間的差異，并進行方差齊性檢驗，方差不齊以Tamhane′s T2檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FOB 預處理對各組心功能的影響

與sham 組比較，I/R 組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 均明顯降低，LVEDP 值升高（P＜0.05，P＜0.01），提示心功能受損；與I/R 組比較，F(xiàn)OB 組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 值均升高，同時LVEDP 降低（P＜0.05），見表2。

表2 FOB 預處理對各組心功能的影響（xˉ± s），（n=12）Tab.2 Effect of FOB pretreatment on cardiac function of eachgroup（xˉ± s），（n=12）

2.2 FOB 對I/R 心肌細胞凋亡的影響

sham 組未見明顯TUNEL 陽性表達。與sham 組相比，I/R 組心肌缺血區(qū)凋亡細胞指數(shù)增加（P＜0.01）；與I/R 組比較，F(xiàn)OB 組心肌細胞凋亡率明顯下降（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組TUNEL 染色比較Fig.1 Comparison of TUNEL staining in eachgroup

2.3 FOB 對I/R 心肌組織p38 等蛋白表達的影響

與sham 組比較，I/R 組梗死區(qū)域（AAR）p-p38、p53 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)OB處理后AAR 區(qū)p-p38、p-53 蛋白的表達有不同程度下降（P＜0.01）。梗死邊緣區(qū)（BZ）及非梗死區(qū)（RA）區(qū)域未見明顯差異，見圖2。

圖2 各組p38 MAPK 及磷酸化蛋白的表達比較Fig.2 Comparison of the expression of p38 MAPK and phosphorylated protein in eachgroup

2.4 FOB 對I/R 心肌組織p38、p53 mRNA 表達的影響

與sham 組比較，I/R 組p53 mRNA 相對表達水平顯著升高（P＜0.05）；與I/R 組比較，經(jīng)過FOB 處理后，p53 mRNA 相對表達水平顯著下降（P＜0.05），p38 組間比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 各組p38、p53 mRNA 的表達水平比較Fig.3 Comparison of the expression levels of p38 and p53 mRNA in eachgroup

3 討論

缺血性心臟病近年來在我國發(fā)病率逐漸增高，當心肌缺血時，能量供應和氧的運輸都會減少，進而導致組織細胞發(fā)生損傷和死亡，盡早地進行再灌注治療是降低心肌損傷的有效方法。但同時又面臨的問題是心肌缺血缺氧會導致心肌損傷，心肌缺血缺氧恢復后又會進一步加重心肌損傷，嚴重者出現(xiàn)心律失常，梗死面積擴大等，即心肌I/R 損傷。因此，尋找治療心肌I/R 損傷的藥物是目前亟待解決的問題。中醫(yī)藥對于心血管疾病的治療具有較長的歷史，早在《金匱要略》中記載：“夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛?！敝赋鲂翜赝柗ㄊ侵委熜乇圆〉脑瓌t。蔥白作為一種常見中藥，具有鼓舞心脈，溫通心陽的作用，現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)FOB 具有調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化、擴管、保護血管內(nèi)皮細胞、減少細胞凋亡，發(fā)揮改善心肌缺血、減輕心肌缺血再灌注損傷的作用［9-10］。

心肌缺血再灌注損傷涉及多種因子的參與，其中p38 MAPK 信號通路發(fā)揮重要作用［11-12］。p38 MAPK 是一種脂多糖刺激白細胞分泌的磷酸化蛋白激酶［13］。它是胞內(nèi)信號傳遞的樞紐，它的激活可以加速細胞凋亡的發(fā)生。心肌缺血再灌注發(fā)生后會產(chǎn)生大量氧自由基和細胞因子，它們的大量釋放會激活p38 MAPK，并隨之通過加重炎癥及促進細胞凋亡；同時p38 MAPK 途徑的激活促使轉錄因子和胞質(zhì)蛋白質(zhì)磷酸化，中性粒細胞和血小板活化增加，進一步加重了心肌缺血再灌注損傷［14-15］。而p53 蛋白是異常激活的p38 MAPK 通路下游重要的凋亡調(diào)控分子，當p38 MAPK 激活后可以直接誘導p53 的磷酸化，活化的p53 會迅速向線粒體轉位，進而加速了細胞凋亡的進程［16-17］。這些研究提示，降低p38 MAPK 信號通路相關蛋白活性是緩解缺血再灌注損傷，改善心功能的重要方法。

本實驗首先證實了I/R 模型制備后大鼠出現(xiàn)了明顯心功能受損，提示心肌缺血導致的缺血再灌注損傷，通過FOB 預處理后心功能得以明顯改善，同時本實驗通過檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)了FOB 預處理使心肌細胞凋亡率明顯降低。為了進一步探討其發(fā)生機制，本實驗從分子水平研究了p38 磷酸化蛋白及p53 的表達，結果提示了p-p38、p53 在I/R 組明顯升高，而通過FOB 預處理后p-p38、p53 蛋白表達顯著下降，證實了p38 MAPK 參與了I/R 心肌細胞的凋亡過程。但p38 mRNA 表達未見顯著性差異，可能是因為調(diào)控p38 蛋白表達存在多途徑多靶點，具體的機制將是下一步研究的重點。

綜上所述，F(xiàn)OB 對I/R 模型大鼠的心功能具有保護作用，其機制可能通過降低p38 MAPK 信號通路蛋白磷酸化水平、降低細胞凋亡率，從而達到保護心肌缺血再灌注損傷的作用。