大鼠機體中杠柳毒苷藥代動力學與三七總皂苷的關系

鄭清山

作者單位： 362000 福建省泉州市中醫(yī)院

杠柳毒苷屬于香加皮中具有毒性的組成成分之一，患者一旦服用含有該成分的藥物，通過代謝就會轉化成杠柳次苷和杠柳苷元[1]。有研究表明，杠柳毒苷能夠有效抑制腫瘤細胞增殖，其毒性作用強，在使用過程中超出標準用量，或者是未正確按照標準進行使用，就會誘發(fā)一系列不良反應如心室顫動、心房顫動、惡心等，主要應用在風濕、慢性充血性心力衰竭治療中[2-3]。三七總皂苷能夠維持患者血液正常循環(huán)，保護患者心腦血管，同時還可以起到顯著的抗炎作用。研究表明，三七總皂苷聯(lián)合杠柳毒苷配合后，能夠有效降低杠柳毒苷在患者體內(nèi)的毒性作用[4]。本研究通過采用液相色譜—質譜聯(lián)用法對大鼠血漿中杠柳毒苷的含量進行測定，分析大鼠機體中杠柳毒苷藥代動力學與三七總皂苷之間的關系，報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器：采用由Agilent 1200型的高效液相色譜儀、Agilent 6430型三重四級桿串聯(lián)質譜儀、Agilent MassHunter分析軟件進行操作，由瑞士Mettler Toledo公司所提供的AX 205型十萬分之一天平，Milli-Q超純水制備儀來自于Millipore公司，3K15型高速離心機來自于美國Sigma 公司，XW-80A型旋渦混合器來自于上海滬西分析儀器廠。

1.1.2 試劑：采用杠柳毒苷和三七總皂苷、補骨脂素；補骨脂素均是由我食品藥品檢定研究院所提供。該產(chǎn)品的純度為達到95%以上；三七總皂苷的總量均在65%以上；美國Thermo Fisher Scientific Inc公司所提供的色譜純甲醇、色譜純乙腈；美國ROE scientific Inc公司所提供的甲酸；天津康科德科技有限公司所提供的分析純乙酸乙酯。超純水自行操作。

1.1.3 動物實驗及模型構建：選自健康雄性SD大鼠，SD大鼠的重量約為225 g。18只大鼠分為3組，分別為A組(給予杠柳毒苷) 、B組(杠柳毒苷聯(lián)合低劑量的三七總皂苷)、C組(杠柳毒苷聯(lián)合高劑量的三七總皂苷)，杠柳毒苷每天10 mg，三七總皂苷每天分別為0.74 g、2.22 g，灌胃治療1周。

1.2 方法

1.2.1 色譜參數(shù)：色譜柱：Waters CORTECSTM C18柱,規(guī)格為2.1 mm×50 mm,2.7 μm)；流動相：B為乙腈，A為濃度為0.1%甲酸水；采用梯度洗脫方式，洗脫具體程序為：0～7 min，19%～50% B；7～9 min，50%～50% B；洗脫時間為9 min；流速需要每分鐘設置為0.3 ml；柱溫控制在30 ℃；進樣量為5 μl。

1.2.2 質譜參數(shù)：采用電噴霧離子源，在檢查過程中具體的監(jiān)測方法大都是采用多反應離子，對正離子進行檢測；Delta EMV(+)：500 V；干燥溫度設置為：300 ℃；干燥氣流速每分鐘為11 L； 霧化壓力為15 psi。通過采用定量分析法分析杠柳毒苷、補骨脂素，具體數(shù)值為719.4→719.4，其碎裂電壓分別為135 V和115 V，碰撞能量分別為3 V和25 V。

1.2.3 溶液配制：杠柳毒苷標準溶液：采用專用的精密儀器稱取杠柳毒苷10.03 mg，放置在10 ml的容量瓶中進行稀釋，稀釋過程中需要采用甲醇進行溶解，配制為1.003 mg/ml的儲備液進行儲存，儲存在4 ℃的冰箱內(nèi)。精密所量取的杠柳毒苷儲備液，采用甲醇進行稀釋，稀釋成一系列的標準溶液進行備用，分別為5、10、25、50、125、500、2 000、 2 500 ng/ml。

內(nèi)標溶液：量取劑量為10.01 mg的補骨脂素作為對照品，將其溶液放置在10 ml的容量瓶中進行稀釋，稀釋方法采用甲醇進行，成為1.001 mg/ml的儲備液，之后儲存在溫度為4 ℃的冰箱內(nèi)待用。之后再采用甲醇對補骨脂素儲備液進行稀釋，稀釋成內(nèi)標溶液，劑量為1 μg/ml，作為備用溶液。

1.2.4 樣本處理：精密量取100 μl血漿樣品與20 μl內(nèi)標溶液、20 μl甲醇進行渦旋混合，內(nèi)標溶液中包含1 μg的補骨脂素，之后再加入劑量為2 ml的乙酸乙酯，采用渦流的方式進行振蕩，振蕩時間5 min，14 000 r/min，離心10 min后，留取2 ml的上清液，并用氮氣將其吹干，再采用100 μl濃度為50%的甲醇進行復溶，采用渦流的方式進行振蕩，振蕩時間5 min，14 000 r/min同樣離心10 min，留取5 μl的上清液，采用液相色譜—質譜法進行分析。

2 結 果

2.1 專屬性 精密量取100 μl空白血漿，之后將40 μl的甲醇加入其中，按照1.2.4項下處理，并將上清液選取一部分留下，按照正確操作流程對上清液樣本進行分析，分析后將杠柳毒苷對照品溶液、內(nèi)標溶液全部加入到空白血漿中，同樣采用上述方式進行處理；取大鼠灌胃之后的血漿樣品，依同法進行處理。杠柳毒苷保留時間控制在3.35 min，內(nèi)標補骨脂素的保留時間控制在4 min左右。血漿樣品中所包含的內(nèi)源性成分之間不存在任何的聯(lián)系。

2.2 精密度與準確度 將2、25、400 ng/ml不同濃度的杠柳毒苷對照品溶液分別加入到精密量取100 μl空白血漿中，每個濃度溶液各取6份，按照1.2.4項下進行處理，并對已經(jīng)完成合理配制的溶液濃度進行測定，連續(xù)測量3 d，同時還需要與標準曲線在同一時間進行操作，操作完成后記錄峰面積，并對日內(nèi)精密度和日間精密度進行計算，通過計算可以直接得知：日內(nèi)精密度明顯高于日間精密度，具體RSD值分別為13.58%、8.87%，準確定度范圍在91%～101%。

2.3 回收率與基質效應 在選擇空白血漿時，為了確保研究結果的準確性和真實性，需要嚴格按照選擇對象的方式選擇，并根據(jù)樣本處理的方式對空白血漿進行處理，制備2、25、400 ng/ml 3種不同濃度的血漿樣品，分別設為低、中、高，不同濃度的血漿樣品各留取6份，進樣量為5 μl，準確記錄峰面積，設為A1；在40 μl的甲醇中另外再選取100 μl的空白血漿，同樣按照1.2.4項下的方法進行處理，處理后用3種不同的濃度的杠柳毒苷對照品溶液進行復溶，進樣量同樣為5 μl，對峰面進行準確記錄，將其設為A2，其公示為R=A1/A2×100%；在同樣的條件下，選取同樣條件下選取3種不同的濃度的杠柳毒苷對照品溶液，記錄峰面積，設為A0則基質效應為M=A2/A0。內(nèi)標補骨脂素的提取回收率、基質效應計算方法與上述方法一樣。結果表明，不同濃度的回收率和基質效應均符合生物樣品分析和探究的標準。見表1。

表1 杠柳毒苷和內(nèi)標補骨脂素在大鼠血漿中的提取回收率和基質效應

2.4 穩(wěn)定性 量取大鼠100 μl的空白血漿，配制成低、中、高3種濃度，分別為2、25、400ng/ml，不同濃度溶液各取3份，并且按照1.2.4項下進行處理，分別對其室溫情況進行考察，考試時間需要控制在6 h,考察完成后對相關數(shù)據(jù)進行處理，同時還需要對血漿樣品進行處理，處理后將其放置在自動進樣器中，放置時間控制在12 h，需要對樣本反復凍融，3次后，將其放置冰箱進行儲存，冰箱內(nèi)的溫度控制在零下70 ℃，冷凍時間需要控制在14 d。杠柳毒苷的準確度區(qū)間為93.45%～112.89%， RSD區(qū)間為1.82%～14.58%。經(jīng)結果顯示，杠柳毒苷在一定條件下其穩(wěn)定性良好。

2.5 藥動力學結果 最后1次給藥需要在18只健康雄性SD大鼠禁食12 h后，在禁食的過程中可以飲水，需要在2個時間段經(jīng)大鼠目內(nèi)眥取血，最后1次給藥前、最后1次給藥后，取血任務完成后，需要將其按照放置順序放在肝素離心管中進行備用，6 000 r/min離心10 min，留取上清液，之后將其放置在冰箱內(nèi)進行儲存，冰箱內(nèi)的溫度需要控制在零下70 ℃，指導進行樣本分析。通過采用DAS 1.0軟件對A、B、C組的藥動學參數(shù)進行計算。采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對此次研究的數(shù)據(jù)進行處理，利用單因素方差的方式來分析不同組別的藥動學參數(shù)差異，3組Cmax、Tmax、T1/2、Ke、AUC0-t、AUC0-∞比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 不同組大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的主要藥動學參數(shù)

3 討 論

香加皮屬于臨床上常用的一種中藥材，其化學成分包括強心苷類、C21甾類、萜類等。如果不按照標準使用就會引發(fā)不良反應，嚴重影響患者病情恢復，而且在臨床上也已經(jīng)逐漸被淘汰。杠柳毒苷、杠柳次苷都是甲型強心苷類成分[5]?？诜芰拒蘸?，會在患者體內(nèi)發(fā)生代謝性轉化，以杠柳次苷的形式存在體內(nèi)。杠柳次苷能夠起到抑制腫瘤、強心的作用，但是與杠柳毒苷相比，細胞毒性更強。李麗等[6]研究中表明，三七總皂苷與香加皮提取物或者杠柳毒苷配伍，在臨床上具有顯著的應用效果，可以在提高患者臨床效果的同時，降低藥物所產(chǎn)生的不良反應，安全性高。通過本次研究對液相色譜—質譜法進行完善與優(yōu)化，可以發(fā)現(xiàn)該分析方法具有良好的專屬性，靈敏度高，線性范圍廣泛，具體區(qū)間為1～500 ng/ml， 并且線性關系良好，與傳統(tǒng)的方法相比，該方法操便捷，運行的時間短[7-8]。經(jīng)方法學驗證后，該方法在操作、原理等多個方面上都可以滿足生物樣品測定過程中的需求和標準，可以采取正確的方法對杠柳毒苷含量進行測定。有研究學者表明，基于靜脈注射和腹腔注射給藥方法通過采用液相色譜—質譜法對大鼠血漿中杠柳毒苷和組織中杠柳毒苷的含量進行測定[9-10]。本次結果數(shù)據(jù)分析，杠柳毒苷的藥代動力學具有行為規(guī)律性的特征，正因如此可直接對不同組織或同一組織的杠柳毒苷含量進行檢測，其檢測的準確性較高，但是在部分組織中，大部分杠柳毒苷會在1 h后被降解。在此次研究中，通過采用灌胃給藥的方式，采用液相色譜—質譜法對以下指標的含量進行測定，包括杠柳毒苷含量、代謝物杠柳次苷、杠柳苷元，經(jīng)測定相關數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，大鼠給藥后，杠柳毒苷可以短時間內(nèi)被檢測到，不利于藥時曲線的擬定。但是在本次研究中，采用灌胃給藥連續(xù)給藥7 d后，通過對大鼠血漿中的杠柳毒苷含量進行檢測，各個時間點的杠柳毒苷都可以直接被檢測到；杠柳毒苷的藥代動力學行為也會在某種特定的條件下發(fā)生一定程度上的變化，2種藥物聯(lián)合治療和單獨藥物治療，其Cmax、AUC0-t和AUC0-∞相對比，存在明顯的差異性；另外，3組Tmax相比也存在明顯的差異性。聯(lián)合用藥，其三七的劑量就會增大，杠柳毒苷的T1/2、AUC0-t和AUC0-∞值也會隨之發(fā)生變化，呈遞減趨勢。在本次討論研究中，灌胃給藥的方式具有顯著的臨床應用價值，通過連續(xù)給藥治療，三七總皂苷可以使杠柳毒苷發(fā)生變化，從而使其代謝物杠柳毒苷的藥動學行為發(fā)生明顯的變化。

但本研究樣本數(shù)較少，再加上實驗過程中人為因素的影響會對檢驗效果造成影響；而且在此次研究中僅選用一種檢測方法，無法保障其他檢測方法的臨床效果和作用，所以后期需要采集大量的研究樣本，并采用不同檢測方法開展臨床研究，旨在為臨床提供更加豐富有力的參考數(shù)據(jù)。

綜上所述，通過采用操作便捷、靈敏、高效的液相色譜—質譜法能夠測定大鼠體內(nèi)杠柳毒苷的含量，分析大鼠體內(nèi)的藥動學，證明三七總皂苷與杠柳毒苷聯(lián)合使用能夠影響杠柳毒苷代謝產(chǎn)物杠柳次苷的藥代動力學行為發(fā)生一定的改變。