復(fù)方黃柏液涂劑對(duì)中波紫外線致HaCaT細(xì)胞急性光損傷的修復(fù)作用*

黃艷麗，錢麗潔，陳鳳娟，王 雄

上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院東院皮膚科，上海 201306

到達(dá)地球表面的紫外線包括UVA(320～400 nm)和UVB(290～320 nm)。雖然UVB只占0.5%，但在同等劑量下對(duì)皮膚的損傷量是UVA的1萬(wàn)倍。紫外線輻射后急性皮膚光損傷包括日曬紅斑和黝黑反應(yīng)，可有紅斑、水皰等表現(xiàn)。目前UVB所致急性皮膚光損傷具體機(jī)制不明確，研究認(rèn)為氧化損傷起重要作用。防曬劑和抗氧化劑的協(xié)同使用是機(jī)體光防護(hù)的主要方法，天然抗氧化劑是近些年研究的熱點(diǎn)[1]。中藥提取物是天然抗氧化劑的重要來(lái)源，目前已有研究證實(shí)五味子、肉豆蔻、黃柏、黃芪、麥冬、金銀花、紅景天等具有抗皮膚光老化作用。復(fù)方黃柏液涂劑主要組分為黃柏、連翹、金銀花等中藥，有清熱燥濕、瀉火祛腐功用，臨床上適用于瘡潰瘍后、傷口感染等癥狀[2]。李慎新等[3]比較了幾種中草藥的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)黃柏和連翹抗氧化活性優(yōu)于其他幾種中草藥。本研究旨在通過(guò)UVB照射建立永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)急性光損傷模型，初步探討復(fù)方黃柏液涂劑是否有光防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 復(fù)方黃柏液涂劑(山東漢方制藥有限公司，國(guó)藥批號(hào)Z10950097)； HaCaT細(xì)胞(武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)； CCK8(日本同仁公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過(guò)氧化物酶(CAT)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒及基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物科技；UVB光療儀(Sigma公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) 將含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液加入HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在100%濕度、5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取3～8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后傳代接種于96孔板上，密度約為105個(gè)/mL。

1.2.2復(fù)方黃柏液處理濃度 將復(fù)方黃柏液涂劑分別按1∶10、1∶30、1∶50、1∶100、1∶200稀釋加入HaCaT培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)450～490 nm，參比波長(zhǎng)600～650 nm。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及HaCaT細(xì)胞急性光損傷模型建立 將培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為正常培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，不作任何處理。模型組HaCaT細(xì)胞接受不同劑量UVB照射，其中光療儀燈管距離培養(yǎng)板15 cm，UVB照射劑量分別為10、20、30 mJ/cm2，PBS覆蓋細(xì)胞上層，UVB照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)[4]。實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞采用1∶100稀釋復(fù)方黃柏液培養(yǎng)6 h，96孔板中HaCaT細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，然后接受10、20、30 mJ/cm2劑量UVB照射。

1.2.4觀察指標(biāo) (1)HaCaT細(xì)胞增殖率：各組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。(2)LDH、SOD及CAT水平：采用比色法測(cè)定，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集上清液，依據(jù)LDH、SOD、CAT及MMP-1試劑盒說(shuō)明書，計(jì)算各組LDH、SOD、CAT及MMP-1水平。

2 結(jié) 果

2.1UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞急性光損傷模型 正常培養(yǎng)條件顯微鏡下HaCaT細(xì)胞表現(xiàn)為貼壁生長(zhǎng)的不規(guī)則細(xì)胞，數(shù)量較多(圖1)，隨著UVB劑量增加，細(xì)胞開(kāi)始變形，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞數(shù)量逐漸較少(圖2)。

圖1 正常培養(yǎng)條件下HaCaT細(xì)胞(×100)

圖2 30 mJ/cm2UVB照射下HaCaT細(xì)胞(×100)

2.2復(fù)方黃柏液處理濃度 CCK8法檢測(cè)結(jié)果表明，空白組細(xì)胞增殖率為(87.433±3.761)%，復(fù)方黃柏液稀釋組中1∶10組、1∶30組、1∶50組、1∶100組、1∶200組HaCaT細(xì)胞增殖率分別為(70.932±4.131)%、(74.597±4.822)%、(78.325±3.063)%、(85.875±3.314)%、(86.075±3.225)%。其中1∶10組、1∶30組、1∶50組HaCaT細(xì)胞增殖率顯著低于空白組(P<0.05)，復(fù)方黃柏液抑制HaCaT細(xì)胞增殖。1∶100組和1∶200組HaCaT細(xì)胞增殖率與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮復(fù)方黃柏液的有效濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取的濃度為復(fù)方黃柏液按1∶100稀釋。

2.3各組上清液LDH、SOD、CAT水平及細(xì)胞增殖率 對(duì)照組中HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH水平顯著低于模型組和實(shí)驗(yàn)組，SOD、CAT水平及細(xì)胞增殖率顯著高于模型組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組和模型組中隨著UVB劑量逐漸增加，HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH水平顯著提高，SOD、CAT水平及細(xì)胞增殖率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同一UVB劑量下，模型組LDH水平顯著高于實(shí)驗(yàn)組，SOD、CAT水平及細(xì)胞增殖率顯著低于實(shí)驗(yàn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同UVAB劑量下各組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH、SOD、CAT水平及細(xì)胞增殖率的比較

2.4各組上清液MMP-1水平 在同一UVB劑量下，實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞MMP-1水平比模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。UVB照射的實(shí)驗(yàn)組和模型組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-1水平均高于對(duì)照組[(5.763±0.592)ng/mL]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-1水平

3 討 論

皮膚是人體最大的器官，具有屏障作用和免疫功能，是防御各種物理性、化學(xué)性損傷的第一道防線。皮膚光損傷不僅影響皮膚美觀，還與多形性日光疹、慢性光化性皮炎、日光性蕁麻疹、皮膚癌等疾病相關(guān)，容易對(duì)人們生活質(zhì)量造成負(fù)面影響，因此如何更好地預(yù)防光損傷一直是皮膚研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。UVB輻射引起的皮膚急性光損傷機(jī)制主要包括細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)蛋白作用、DNA損傷修復(fù)、線粒體損傷，其中氧化應(yīng)激起重要作用。UVB輻射導(dǎo)致大量活性氧簇(ROS)產(chǎn)生，激活氧化應(yīng)激通道，調(diào)控炎癥因子及抗氧化物酶等表達(dá)。清除ROS，維持ROS與抗氧化酶動(dòng)態(tài)平衡，減輕氧化應(yīng)激損傷[5]。此外，光損傷可造成皮膚膠原降解，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是調(diào)節(jié)膠原降解的重要因素。MMP-1為MMPs家族中降解膠原蛋白活性最高的酶，UVB照射可以誘導(dǎo)HaCaT分泌MMP-1增多[6]。角質(zhì)形成細(xì)胞為皮膚吸收UVB的主要細(xì)胞，HaCaT細(xì)胞是人皮膚良性角質(zhì)形成細(xì)胞的永生化細(xì)胞株，常用于替代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞做體外實(shí)驗(yàn)研究。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素、茶多酚、補(bǔ)骨脂素、枸杞多糖等中藥提取物能提高機(jī)體抗氧化能力，防御HaCaT細(xì)胞光老化[7-9]，對(duì)中藥抗皮膚氧化的研究可擴(kuò)展天然抗氧化劑的選擇范圍。

SOD及CAT作為重要的抗氧化物質(zhì)，可減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物及活性氧的產(chǎn)生。而紫外線可抑制抗氧化酶活性，過(guò)量的活性氧使細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)氧化，提高細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞內(nèi)LDH可通過(guò)細(xì)胞膜滲出到上清液中，血清LDH水平是反映HaCaT細(xì)胞膜氧化損傷程度的重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，在同一組別中，隨著UVB劑量增加，LDH水平顯著升高，SOD、CAT及細(xì)胞增殖率顯著降低，這與此前研究結(jié)果類似[5]，細(xì)胞氧化損傷程度與UVB劑量相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)在同一劑量UVB照射下，相比模型組，復(fù)方黃柏液顯著降低SOD、CAT水平及細(xì)胞增殖率，提高LDH水平，說(shuō)明復(fù)方黃柏液可顯著提高HaCaT細(xì)胞抗氧化能力，減輕細(xì)胞膜氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而提高細(xì)胞增殖率。本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UVB照射組與對(duì)照組比較，MMP-1表達(dá)顯著增多，在同一UVB劑量下實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞MMP-1水平比模型組明顯減少，說(shuō)明復(fù)方黃柏液可以抑制UVB誘導(dǎo)的MMP-1分泌，減少UVB對(duì)組織的損傷，但對(duì)其具體信號(hào)通道作用仍需進(jìn)一步研究。

復(fù)方黃柏液中黃柏和連翹為君藥，金銀花、蒲公英為臣藥，具有清熱瀉火、消腫祛腐功效。有研究發(fā)現(xiàn)黃柏中黃酮類化合物含量豐富，可清除自由基和超氧陰離子，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[10-11]。連翹提取物中的總黃酮、綠原酸、連翹酯苷、蘆丁等具有抗氧化抗衰老等作用[12]。金銀花、蒲公英中也有多種抗氧化活性分子，包括綠原酸、黃酮、揮發(fā)油等[13-14]，二者均可吸收紫外線，具有較強(qiáng)的防曬能力。所以復(fù)方黃柏液可能通過(guò)上述抗氧化分子對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行光防護(hù)作用。

本次研究初步發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃柏液可能對(duì)UVB照射HaCaT細(xì)胞造成的急性光損傷具有防護(hù)作用，但對(duì)具體細(xì)胞信號(hào)通路作用未明確，之后將對(duì)炎癥細(xì)胞因子及細(xì)胞衰老凋亡相關(guān)蛋白等進(jìn)行進(jìn)一步研究。復(fù)方黃柏液在皮膚應(yīng)用范圍較廣，對(duì)濕疹、接觸性皮炎、脂溢性皮炎、帶狀皰疹、中毒性表皮松解癥具有顯著效果[15-16]，對(duì)皮膚無(wú)明顯刺激作用，安全性高，可進(jìn)行更多的研究，使其更好地用于臨床工作中。