三種子宮內(nèi)膜增生大鼠模型的建立和評價(jià)*

張 燕，呂 饒，鐘海濤，高婷麗，袁麗君，涂 星,3△

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院病理科，湖北恩施 445000；3.武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心，湖北恩施 445000

子宮內(nèi)膜增生癥(EH)是一種臨床上婦科常見疾病，其發(fā)病是由于受到多種因素刺激，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)雌激素增加，而無相應(yīng)的孕激素拮抗作用，從而促使子宮內(nèi)膜腺體增生、腺體間質(zhì)比例失調(diào)、腺體的數(shù)量增多和腺體擴(kuò)大，產(chǎn)生子宮內(nèi)膜增厚等一系列病理改變[1-2]，常分為不典型增生和無不典型增生兩類[3]，該疾病對患者的身心健康和日常生活帶來了極大的危害[4]。目前認(rèn)為EH與體內(nèi)雌激素變化關(guān)系密切，抑制雌激素分泌的藥物都可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生甚至癌變[5]。

EH動(dòng)物模型主要是通過去勢法、雌激素負(fù)荷法或者兩者聯(lián)合的方法來建立，但缺乏較為客觀的評價(jià)體系[6]。本研究擬以上述3種方法建立EH的大鼠模型，并從子宮病理組織形態(tài)和血清中相關(guān)激素[雌激素(E2)、泌乳素(prol)、孕激素(P)、黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)]水平進(jìn)行評價(jià)和分析，為子宮內(nèi)膜增生動(dòng)物模型的建立和評價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級SD雌性大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量(180±18)g，均購于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(鄂)2017-0012，飼養(yǎng)環(huán)境20～26 ℃，濕度50%～60%，自然通風(fēng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2藥物與試劑 高壓滅菌大豆油(供注射用，浙江田雨山藥用油有限公司)；苯甲酸雌二醇注射液(劑量：2 mL∶4 mg，10支/盒，杭州動(dòng)物藥品廠，批號：190422)；左炔諾孕酮(劑量：0.75 mg×2片/盒，華潤紫山竹藥業(yè)有限公司，批號：43190405)；大鼠E2、prol、P、LH的ELISA試劑盒均購于上海哈靈生物科技有限公司；大鼠FSH ELISA試劑盒購于上海信凡生物科技有限公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 5810R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；酶標(biāo)定量測定儀(德國Thermo公司)；Milli-Q超純水機(jī)(貝萊美生物科技有限公司)；智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(型號：TC-120，泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(型號：TB-718E，泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號：R139，泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；攤片機(jī)(型號：TK-218Ⅱ，泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；顯微鏡(日本Nikon)；海爾立式超低溫冰箱。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、去勢組(B組)、雌激素負(fù)荷組(C組)和去勢聯(lián)合雌激素負(fù)荷組(D組)，每組15只。所有大鼠在造模前3 d行腹部備皮，進(jìn)行手術(shù)前禁食不禁水12 h。B組和D組大鼠采用10%水合氯醛以0.3 mL/kg的劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定，腹部行側(cè)橫切口，找到卵巢組織，用手術(shù)線結(jié)扎后摘除雙側(cè)卵巢，分層縫合切口；A組同法在腹部行切口后切除卵巢周圍組織與雙側(cè)卵巢質(zhì)量相近的脂肪組織；術(shù)后大鼠給予腹腔注射青霉素鈉注射液8萬單位，連續(xù)注射3 d。C組、B組與D組大鼠以0.15 mL/100 g的劑量肌肉注射1 mg/mL高壓滅菌麻油稀釋的苯甲酸雌二醇注射液混合液，共14次；A組術(shù)后同法等劑量注射高壓滅菌麻油，共14次。

1.4.2模型的評價(jià)與篩選 在給藥后第10天開始，隔1天1次，連續(xù)20 d取B組和D組大鼠陰道分泌物進(jìn)行陰道涂片后用吉姆薩溶液染色，并于鏡下觀察大鼠陰道上皮角化情況，剔除角化者。最終，篩選A組大鼠15只、B組大鼠14只，C組大鼠15只，D組大鼠14只。

1.4.3指標(biāo)檢測

1.4.3.1各組大鼠子宮指數(shù)測定 末次給藥后第2天，每組隨機(jī)選取大鼠6只，稱重并記錄體質(zhì)量，麻醉后取腹主動(dòng)脈血，離心分離血清，置于冰箱保存?zhèn)溆?。迅速取下各組大鼠完整子宮，并精密稱子宮濕重(g)，根據(jù)公式(子宮指數(shù)=子宮濕重/大鼠體質(zhì)量)計(jì)算子宮指數(shù)。

1.4.3.2HE染色觀察各組大鼠子宮病理情況 將取出的子宮以4%多聚甲醛固定液固定48 h，截取Y型子宮交叉處橫截面子宮組織，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片后進(jìn)行HE染色，并固定封片。每組選取染色效果佳、組織較完整的切片2張，在40倍和100倍鏡下分別在子宮內(nèi)膜四邊視野采集圖片各3張。采用Image J 1.51軟件進(jìn)行圖像分析，觀察子宮內(nèi)膜形態(tài)。

1.4.3.3ELISA檢測其血清中性激素水平 取上述1.4.3.1中的待測血清，根據(jù)試劑盒上的說明書進(jìn)行操作，檢測血清中E2、prol、P、LH和FSH的水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠子宮形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定 各組大鼠子宮形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果見表1。與A組比較：B組大鼠子宮指數(shù)、內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜面積均明顯下降(P<0.05)；C組和D組子宮指數(shù)、內(nèi)膜厚度均明顯增加(P<0.05)，內(nèi)膜面積明顯下降(P<0.05)，且C組各指標(biāo)改變更為明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠子宮形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

2.2各組大鼠子宮病理切片觀察 A組大鼠子宮肌纖維細(xì)長，內(nèi)環(huán)外縱，排列規(guī)則，內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞呈高柱形，腺體排列較密集，腺腔大小不等，細(xì)胞底部可見分泌空泡，肌層纖維形態(tài)規(guī)則，漿膜層較光滑(圖1A、圖2A)；B組大鼠子宮體積明顯縮小，子宮內(nèi)膜明顯萎縮，腺體細(xì)胞多為低柱狀，腺體明顯增多且擁擠，肌層變薄，肌纖維排列較紊亂，漿膜層萎縮，不光滑(圖1B、圖2B)；C組肉眼可見部分大鼠子宮出現(xiàn)明顯的積水、淤血和大小不一的膿腫，顯微鏡下可見內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞呈低柱狀，腺體呈單層或復(fù)層柱狀，較A組數(shù)量明顯增多且擁擠，偶見膿腫形成，大部分大鼠子宮內(nèi)膜有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，肌層纖維輕度肥大，排列稍紊亂，漿膜層萎縮，不光滑(圖1C、圖2C)；D組大鼠子宮體積明顯增大，偶見積水和淤血，未見膿腫，顯微鏡下可見內(nèi)膜細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞呈低柱狀，偶見假復(fù)層現(xiàn)象，腺體呈單層或復(fù)層柱狀，數(shù)量明顯增多，內(nèi)膜層有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，肌層排列較整齊(圖1D、圖2D)。

2.3各組大鼠血清性激素水平比較 與A組比較：B組大鼠prol、LH和FSH明顯升高(P<0.05)，而E2、P明顯降低(P<0.05)；C組大鼠E2、LH和FSH明顯升高(P<0.05)，而P明顯降低(P<0.05)；D組大鼠prol、LH和FSH明顯升高(P<0.05)，而E2、P明顯降低(P<0.05)。與B組比較：C組大鼠prol、LH明顯升高(P<0.05)，F(xiàn)SH明顯降低(P<0.05)；D組大鼠E2及LH明顯升高(P<0.05)，其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與C組比較：D組大鼠E2及prol明顯降低(P<0.05)，P明顯增加(P<0.05)，其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

注：A為A組；B為B組；C為C組；D為D組。

注：A為A組；B為B組；C為C組；D為D組。

表2 各組大鼠血清激素水平測定結(jié)果

3 討 論

子宮內(nèi)膜是哺乳類動(dòng)物體內(nèi)對雌激素最為敏感的組織，正常情況下，卵巢周期性地分泌雌激素，維持正常的月經(jīng)周期；病理情況下，在來源于體外或體內(nèi)的雌激素持續(xù)性地過度刺激下，且無孕酮對抗，子宮內(nèi)膜發(fā)生突破性或撤退性出血、兩種類型混合性出血，進(jìn)而引起子宮內(nèi)膜增生、間質(zhì)血管以及腺體擴(kuò)張、炎細(xì)胞浸潤、子宮臟器系數(shù)下降等一系列病理改變[7-8]。本研究結(jié)果表明，采用去勢法、雌激素負(fù)荷法和去勢聯(lián)合雌激素負(fù)荷法均可引起子宮內(nèi)膜增生病理改變，如水腫和少量上皮細(xì)胞變性和壞死，孕激素均處于較低水平，提示這3種方法均可建立子宮內(nèi)膜增生的大鼠模型。

雌激素孕激素維持在一定的水平對于女性建立正常月經(jīng)周期十分重要，也是女性性成熟和生殖的重要標(biāo)志。在性激素作用下，子宮內(nèi)膜發(fā)生周期性脫落、生成，因此檢測性激素的水平，是目前婦科疾病臨床與實(shí)驗(yàn)研究的重要手段，一方面可以了解性激素在體內(nèi)的周期性變化規(guī)律，另一方面對于尋找EH發(fā)生、發(fā)展的原因，尋求合適的治療方法具有重要意義[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜增生大鼠模型出現(xiàn)了腺體的數(shù)量明顯減少，上皮細(xì)胞和腺體增生，子宮內(nèi)膜厚度和內(nèi)徑明顯升高等病理改變[10]，與本研究結(jié)果相似。 張麗萍等[11]以高效孕激素治療EH，通過檢測患者子宮內(nèi)膜組織中TRIM22在治療前后的表達(dá)情況，表明孕激素可以升高TRIM22的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜腺體的增殖，從而可以治療EH。本研究發(fā)現(xiàn)，所建立的這3種模型prol、LH和FSH的分泌量均明顯增加，E2和P均明顯下降(C組有外源性雌激素的干擾)，提示本研究所建立的這3種模型也可應(yīng)用于子宮內(nèi)膜增生所致不孕癥的相關(guān)研究。

此外，從研究結(jié)果上看，雌激素負(fù)荷法和去勢聯(lián)合雌激素負(fù)荷法所建立的子宮內(nèi)膜增生大鼠模型的子宮指數(shù)明顯增大，其原因可能與子宮內(nèi)膜炎性浸潤引起的水腫有關(guān)，提示采用這兩種方法所建立的模型可能具有子宮內(nèi)膜炎的特征。