定量核磁共振磷譜在食品分析檢測(cè)中的研究進(jìn)展

韓 智 龔 蕾 王會(huì)霞 - 江 豐

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

定量核磁共振波譜(Qualitative Nuclear Magnetic Resonance, qNMR)是20世紀(jì)新興的食品分析檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)過近60年的發(fā)展，已成為食品科學(xué)、食品分析、食品認(rèn)證、食品質(zhì)量控制的重要工具。與常用的現(xiàn)代分析技術(shù)如色譜法(氣相色譜、液相色譜、薄層色譜)、波譜法(質(zhì)譜、紫外可見光譜、傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜)、電泳法(聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)、免疫分析法、微生物學(xué)和遺傳學(xué)分析法相比，qNMR在化合物定量方面具有許多優(yōu)點(diǎn)，其允許對(duì)樣品進(jìn)行無(wú)損定量分析，所需樣品量少，還具有高精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性、耐用性等優(yōu)點(diǎn)，具有與色譜技術(shù)相媲美的適用性[1-3]。此外，qNMR還具有分析時(shí)間短、重現(xiàn)性高的特點(diǎn)，也不需要標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行定量[4-5]。

磷是人體必需元素，但過量攝入會(huì)引起高磷血癥，磷的缺乏又會(huì)引起軟骨病[6]。31P原子核天然豐度為100%，靈敏度為1H的1/15，在核磁共振掃描(NMR)中具有較大范圍的化學(xué)位移(約7.00×10-4)，不同的含磷化合物能得到有效分離，因此定量核磁共振磷譜(31P-qNMR)技術(shù)是一種可靠的定量分析工具[7]。近年來(lái)，31P-qNMR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于橄欖油等級(jí)鑒定、畜禽肉新鮮度鑒別、牛奶中甘油磷酰膽堿定量測(cè)定、酪蛋白中磷脂酰絲氨酸定量測(cè)定、淀粉來(lái)源辨別、聚磷酸鹽螯合劑的檢測(cè)、果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥定量測(cè)定等[8]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)31P-qNMR的綜述包括人體磷脂研究[9]、橄欖油等級(jí)鑒定[10]、食品科學(xué)應(yīng)用[11]、土壤分析應(yīng)用[12]、食品脂質(zhì)研究[13]、qNMR的高級(jí)應(yīng)用[14]。但在食品分析檢測(cè)中的研究尚未見報(bào)道。文章擬對(duì)31P-qNMR技術(shù)在磷脂、磷酸鹽、功能成分、純度分析、有機(jī)磷農(nóng)藥降解規(guī)律等方面的研究進(jìn)行系統(tǒng)綜述，旨在為31P-qNMR在食品分析檢測(cè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 31P-qNMR定量原理

定量核磁的基本原理為圖譜中信號(hào)的響應(yīng)值(即峰面積)與所檢測(cè)的核(如31P)的數(shù)目呈正比，與核的化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)，一般只需對(duì)該化合物中某一基團(tuán)上質(zhì)子引起的峰面積進(jìn)行比較，即可求出其絕對(duì)含量[15]。

qNMR定量方法主要有兩種：① 相對(duì)定量法(外標(biāo)法)，稱取一定已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相同試驗(yàn)條件下，以特征峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定未知樣品溶液的NMR譜圖，計(jì)算其相應(yīng)的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算未知樣品濃度。② 絕對(duì)定量法(內(nèi)標(biāo)法)，選擇已知準(zhǔn)確含量的標(biāo)準(zhǔn)物作為內(nèi)標(biāo)物，在未知樣品溶液中加入已知量的內(nèi)標(biāo)，由內(nèi)標(biāo)化合物特征峰面積與樣品中某一特征峰面積的比值即可計(jì)算樣品濃度，內(nèi)標(biāo)法是qNMR最常見的定量方法，其計(jì)算公式為[16]:

(1)

式中：

mx——待測(cè)物含量，mg/L；

mstd——內(nèi)標(biāo)含量，mg/L；

Mx——待測(cè)物分子量；

Mstd——內(nèi)標(biāo)分子量；

Ax——待測(cè)物定量峰信號(hào)面積；

Astd——內(nèi)標(biāo)物定量峰信號(hào)面積；

nx——待測(cè)樣品定量峰包含的磷原子數(shù)；

nstd——內(nèi)標(biāo)物包含的磷原子數(shù)。

2 31P-qNMR定量分析的影響因素

采樣參數(shù)(觀測(cè)核、中心頻率、譜寬、采樣點(diǎn)數(shù)、增益)、脈沖序列參數(shù)(脈沖寬度、射頻場(chǎng)強(qiáng)、延遲時(shí)間、掃描次數(shù))、數(shù)據(jù)處理參數(shù)(窗函數(shù)、變換點(diǎn)數(shù)、線性因子)等均會(huì)影響31P-qNMR的定量結(jié)果[17]。在實(shí)際分析檢測(cè)中，標(biāo)準(zhǔn)品的選擇、延遲時(shí)間、掃描次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較大。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

qNMR試驗(yàn)所選的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、純度較高、易溶于氘代試劑、不與樣品中任何成分發(fā)生反應(yīng)、與樣品定量峰分離度好、信號(hào)明顯易識(shí)別等特點(diǎn)[15]。常用的31P-qNMR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有2-氨基乙基膦酸[18]、甲胺磷[19]、膽固醇[20]、磷酸[21]、六甲基磷酰三胺[22]、亞甲基二膦酸[23]、甲基膦酸[6]、磷酸鈉[4]等。

2.2 延遲時(shí)間

延遲時(shí)間(D1)直接影響激發(fā)核能否恢復(fù)至平衡基態(tài)，而能否恢復(fù)基態(tài)影響核磁的響應(yīng)信號(hào)，因此合適的D1對(duì)qNMR定量結(jié)果影響較大，一般認(rèn)為qNMR的D1≥5T1(5倍弛豫時(shí)間)。過長(zhǎng)的D1增加了單次掃描所需的時(shí)間，通過加入順磁物質(zhì)可以縮短延遲時(shí)間，還可以引入校正因子f校正D1時(shí)間不足導(dǎo)致的定量偏差[24-25]。

2.3 掃描次數(shù)

相同操作條件下，靈敏度與掃描次數(shù)呈正比[17]，掃描次數(shù)太少，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，對(duì)于痕量物質(zhì)的分析可以增加掃描次數(shù)，以此提高儀器的靈敏度，降低物質(zhì)的檢出限。但掃描次數(shù)過多會(huì)造成試驗(yàn)效率低，因此qNMR定量需優(yōu)化掃描次數(shù)，使掃描時(shí)間和靈敏度達(dá)到最佳平衡。

3 31P-qNMR在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 食品活性磷脂分析檢測(cè)

磷脂幾乎存在于所有機(jī)體細(xì)胞中，動(dòng)物磷脂主要來(lái)源于蛋黃、牛奶、動(dòng)物體腦組織、肝臟、腎臟及肌肉組織，植物磷脂主要存在于油料種子中；磷脂具有生物學(xué)功能，受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注[18]。傳統(tǒng)的磷脂檢測(cè)方法有索氏提取法、酸水解法和氯仿—甲醇提取法等，但存在耗時(shí)長(zhǎng)，有機(jī)溶劑消耗量大的缺點(diǎn)，且具有毒害作用[13]。

Spyros等[7]使用2-氯-4,4,5,5-四甲基二氧磷雜環(huán)烷與單甘油脂和雙甘油三酯的游離羥基進(jìn)行磷酸化，在NMR譜圖中將磷的響應(yīng)峰進(jìn)行歸一化積分，得到初榨橄欖油中單甘油脂和雙甘油脂的準(zhǔn)確含量。Yao等[26]利用31P-qNMR比較了水提和酶輔助水提兩種不同處理方法對(duì)全脂大豆粉、豆粕、擠壓膨化豆粕及奶油中磷脂含量的影響，發(fā)現(xiàn)使用酶輔助水提的得率更高，該方法使用氯仿—甲醇—乙二胺四乙酸銫混合提取液提取磷脂類化合物，通過NMR直接上機(jī)定量測(cè)定，各種磷脂在譜圖中得到了較好的分離，奶油中總磷脂含量為0.09%～0.75%，游離油脂含量為6%～78%。Brinkmann-Trettenes等[27]以磷酸三甲酯為內(nèi)標(biāo)，通過改變提取溶液的pH值，定量檢測(cè)二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、雙磷脂酰甘油4種磷脂，此4種磷脂化合物在譜圖中分離度好，定量限為1.30 mmol/L，相比于傳統(tǒng)的酶法測(cè)定，qNMR法抗干擾能力強(qiáng)，適合深色樣品的測(cè)定，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%～8.7%，重復(fù)性RSD<3%。Garcia等[28]以MDPA為外標(biāo)，氘代氯仿—甲醇—5 mmol/L環(huán)己二胺四乙酸銫(V氘代氯仿∶V甲醇∶V環(huán)己二胺四乙酸銫=100∶40∶20)為提取試劑，分別鑒定出人奶、馬奶、駱駝奶、牛奶中含有12，11，9，7種磷脂，人奶和駱駝奶中的鞘磷脂和縮醛磷脂含量更高，分別為78.3，117.5 μg/mL，縮醛磷脂含量分別為27.3，24.0 μg/mL，這兩種物質(zhì)對(duì)嬰幼兒的發(fā)育具有重要作用；磷脂總含量從高到低依次為駱駝奶、人奶、牛奶、馬奶，含量分別為0.503，0.324，0.265，0.101 mmol/L，該檢測(cè)方法具有靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單、損失較少的優(yōu)點(diǎn)，適合嬰兒母乳替代品、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和保健食品中磷脂含量的檢測(cè)。Lucas-Torres等[29]利用31P-qNMR研究了常規(guī)加熱和微波加熱對(duì)橄欖油質(zhì)量的變化情況，結(jié)果顯示常規(guī)加熱會(huì)導(dǎo)致二酰甘油和游離脂肪酸含量顯著增加，進(jìn)而損害橄欖油質(zhì)量，微波加熱可使橄欖油中二酰甘油之間存在異構(gòu)化反應(yīng)，可延長(zhǎng)橄欖油的保質(zhì)期。Dais等[30]利用高分辨率多核(1H，13C，31P)及多維NMR光譜，使用復(fù)雜的二維NMR試驗(yàn)，對(duì)魚油中的各種成分進(jìn)行了系統(tǒng)的二維分析，結(jié)果表明n-1?；満头词街舅岬暮糠秶謩e為1.9%～2.9%，3.7%～5.2%。

崔常樂等[31]利用31P-qNMR測(cè)定了大豆磷脂中的磷脂酰膽堿，發(fā)現(xiàn)定量結(jié)果普遍比高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)的偏大，可能是因?yàn)楹舜诺膐verhauser效應(yīng)(NOE)帶來(lái)了積分誤差，通過重復(fù)測(cè)定，使用校正系數(shù)f將31P-qNMR的結(jié)果進(jìn)行校正，結(jié)果準(zhǔn)確。Malmos等[32]利用qNMR技術(shù)對(duì)黑巧克力中卵磷脂及銨磷脂類乳化劑類型及含量進(jìn)行了精確定性定量分析，方法定量限為1.1～1.9 g/kg，準(zhǔn)確度為4%～12%，精密度為11%～19%。Mayar等[33]比較了膽酸緩沖鹽、CHCl3-MeOH-H2O混合提取液及甲醇對(duì)磷脂和溶血磷脂的提取效率，結(jié)果顯示用甲醇重復(fù)提取3次的回收率和穩(wěn)定性好，在400，700 MHz核磁波譜儀上的定量限分別為0.15，0.10 mg/g，加標(biāo)回收率為96%～108%。Van等[34]利用400 MHz核磁定量測(cè)定了植物油原油和精煉油中磷脂和含磷降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)不同pH對(duì)不同磷脂的分離及峰型有顯著影響，選擇pH為9.0的提取試劑提取8種磷脂，并測(cè)定了不同目標(biāo)物的弛豫時(shí)間T1為0.9～10.6 s，選擇15 s作為定量，并用校正因子f=1.11校正延遲時(shí)間最長(zhǎng)的化合物，得8種化合物的回收率為94%～100%，定量限為100 μmol/100 g。

3.2 磷酸鹽分析檢測(cè)

磷酸鹽是食品工業(yè)常用的食品添加劑，可用作水分保持劑、膨松劑、酸度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、凝固劑、抗結(jié)劑。常用的磷酸無(wú)機(jī)鹽檢測(cè)方法為離子色譜法，但該方法存在陰性離子干擾多、前處理復(fù)雜的缺點(diǎn)。

Sojka等[35]鑒別出市售三聚磷酸鈉中含有焦磷酸鈉、三偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉3種雜質(zhì)，并定量測(cè)出其含量，同時(shí)指出使用去耦脈沖序列可能會(huì)產(chǎn)生NOE效應(yīng)，使核磁共振信號(hào)增強(qiáng)，造成定量結(jié)果偏大。Stanislawski等[24]在含有多種磷酸鹽的混合溶液中添加順磁試劑4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶酰氧基，縮短了各化合物的弛豫時(shí)間，猝滅了NOE效應(yīng)，使用NMR采集時(shí)間2 h，定量測(cè)定了三偏磷酸鈉、四偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉、焦磷酸鈉，其檢出限為200 mg/kg。Belloque等[36]使用31P-qNMR測(cè)定了牛奶中的無(wú)機(jī)磷和磷酸絲氨酸，使用外標(biāo)法定量，單個(gè)樣品采集時(shí)間1.7 h，無(wú)機(jī)磷的線性范圍為162～1 993 mg/kg，磷酸絲氨酸的線性范圍為38～402 mg/kg，利用此方法測(cè)得牛奶中含有焦磷酸鹽含量為58～576 mg/kg。Hrynczyszyn等[23]利用亞甲基二膦酸作為外標(biāo)，利用硼酸—EDTA堿式緩沖液提取了肉制品中的4種磷酸鹽KH2PO4, Na2H2P2O7, K4P2O7和Na5P3O10，其回收率為95%～99%，回收率變異系數(shù)≤5%；該方法具有良好的精密度，變異系數(shù)為0.39%～3.40%，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用水直接提取肉制品中磷酸鹽的提取率較低(<90%)，使用緩沖鹽提取的回收率較高。Szyk等[22]利用六甲基磷酰三胺作為內(nèi)標(biāo)試劑，使用硼酸-EDTA堿式緩沖液測(cè)定了肉制品中的4種磷酸鹽Na2H2P2O7、K4P2O7、Na5P3O10、Na3P3O9，使用校正因子f校正HMPA和磷酸鹽的磷原子響應(yīng)當(dāng)量，掃描參數(shù)為延遲時(shí)間5 s，掃描次數(shù)196，使用此方法的回收率為96.5%～98.0%，檢出限為32 mg/kg，定量限為82 mg/kg。K?llo等[6]以甲基膦酸作為內(nèi)標(biāo)物，對(duì)10種市售飲料中的磷酸鹽進(jìn)行了分析，飲料經(jīng)NaOH固定pH值使其化學(xué)位移不發(fā)生變化，經(jīng)直接上機(jī)測(cè)試，樣本中的磷酸鹽濃度為3.5～6.1 mmol/L。盧愛民等[37]建立了核磁共振磷譜(31P-NMR)快速測(cè)定可樂飲料中的磷酸根含量的定量分析方法，以磷酸二氫鉀(KH2PO4)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在0.25～4.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。將該方法用于可樂中磷酸根含量的測(cè)定，測(cè)得可口可樂和百事可樂中的磷酸根含量分別為0.846 2，0.908 4 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.44%，0.46%，加標(biāo)回收率分別為96.4%，109.7%。

3.3 功能成分的分析檢測(cè)

植物中有效成分的確定一般包含提取、純化及鑒定，鑒定常采用X晶體衍射、紫外及紅外輔助定性，NMR技術(shù)則能確定化合物的構(gòu)型及立體結(jié)構(gòu)。Christophoridou等[38]使用亞磷酸化環(huán)己醇作為內(nèi)標(biāo)物，利用31P核磁共振波譜檢測(cè)和定量酚類化合物，該方法利用衍生試劑2-氯-4,4,5,5-四甲基二氧磷雜環(huán)烷與酚類化合物的羧基進(jìn)行衍生結(jié)合，根據(jù)31P化學(xué)位移識(shí)別亞磷酸化化合物，通過整合31P核磁共振波譜中的適當(dāng)信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)初榨橄欖油中大量酚類化合物的定量，該研究定量了20種酚酸，如鄰香豆酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等；研究了不同溫度下化學(xué)位移的改變，當(dāng)溫度為20～30 ℃時(shí)，化學(xué)位移偏移了2.0×10-8～6.0×10-8；利用順磁物質(zhì)乙酰丙酮鉻的順磁性降低了磷原子核的弛豫時(shí)間，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間。Crestini等[20]采用定量31P核磁共振和二維異核核磁共振波譜相結(jié)合的新分析方法，測(cè)定了兒茶、五味子和金合歡中原花青素的化學(xué)成分，以乙酰丙酮鉻作為松弛劑，吡啶和氘代氯仿(V吡啶∶V氘代氯仿=1.6∶1.0)作為提取液，膽固醇作為內(nèi)標(biāo)，加入2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷烷作為衍生試劑，將樣品在20 ℃下溫浴60 min，上機(jī)測(cè)試，通過分析原花青素中黃烷-3-醇的A-、B-、C-環(huán)基團(tuán)，鑒定出黃烷-3-醇單元的氧化模式，同時(shí)獲取了原花青素樣品的指紋圖譜，并通過異核單量子關(guān)系(HSQC)技術(shù)測(cè)定了其純度。Melone等[39]報(bào)道了一種前所未有的qNMR分析方法，該方法可以同時(shí)對(duì)單寧中的所有官能團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和定量表征，使用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷雜環(huán)烷引物原位標(biāo)記所有不穩(wěn)定的H基(脂肪族、酚羥基和羧酸)，使用31P-NMR定量測(cè)定其含磷官能團(tuán)，為復(fù)雜的生物活性多酚化合物的結(jié)構(gòu)鑒定和定量提供了可能。

3.4 有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)

31P-NMR技術(shù)在有機(jī)磷化合物中應(yīng)用廣泛，包括有機(jī)磷農(nóng)藥抑制乙酰膽堿酯酶的機(jī)理、有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系、人體中有機(jī)磷農(nóng)藥代謝研究、有機(jī)磷農(nóng)藥的復(fù)合解毒劑研究、環(huán)境和食品中農(nóng)藥殘留研究、有機(jī)磷在環(huán)境中的降解、有機(jī)磷在解毒劑中降解機(jī)理研究等[40]。Gurley等[41]利用31P-qNMR技術(shù)研究了有機(jī)磷農(nóng)藥，通過使用弛豫試劑減少掃描時(shí)間，25 min內(nèi)的方法檢出限為25 μg/mL。Mortimer等[42]使用31P-qNMR測(cè)定了10個(gè)西藍(lán)花和卷心菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥(二硫醚，二嗪酮，樂果、對(duì)硫磷、甲基疊氮磷)，以三苯基膦作為內(nèi)標(biāo)，延遲時(shí)間為1.0 s，掃描次數(shù)4 800次，其檢出限達(dá)0.5 mg/kg。Krolski等[43]研究了二硫代磷酸酯類農(nóng)藥在土壤中的代謝，發(fā)現(xiàn)硫丙磷主要有硫丙磷亞砜和硫丙磷砜?jī)煞N代謝產(chǎn)物，90 d后硫丙磷降解完全，轉(zhuǎn)化為硫丙磷亞砜和硫丙磷砜，其含量分別為64%，36%。Talebpour等[44]利用六甲基磷酰三胺作為內(nèi)標(biāo)，用甲醇提取番茄中的敵百蟲，并直接進(jìn)行NMR定量分析，方法的檢出限為55 mg/kg，重復(fù)性≤9.0%，平均回收率為99%～112%，31P-qNMR 技術(shù)解決了因敵百蟲不穩(wěn)定而造成氣相色譜和液相色譜都不易測(cè)定的難題。Molaabasi等[45]以苯線磷和乙酰甲胺磷作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，使用NMR研究了環(huán)糊精對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥苯丙胺進(jìn)行手性對(duì)映體的識(shí)別，兩種手性對(duì)映體的化學(xué)位移分別為5.54×10-6，5.66×10-6，檢出限分別為0.006 8，0.006 0 mg/mL，并以香蕉汁為對(duì)象進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收率為94%～107%。Ansari等[19]建立了31P-qNMR同時(shí)檢測(cè)水介質(zhì)中4種有機(jī)磷農(nóng)藥(丙硫磷、溴苯磷、異柳磷、甲胺磷)的新方法，該方法的延遲時(shí)間為24 s，掃描次數(shù)為128～256次，內(nèi)標(biāo)為甲胺磷，其定量限為0.10～2.60 mg/L，加標(biāo)回收率為82%～94%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<4%，該方法簡(jiǎn)單、無(wú)基質(zhì)干擾、選擇性強(qiáng)、快速，可應(yīng)用于其他樣品基體。周霞云[16]利用磷酸三苯酯作為內(nèi)標(biāo)，使用qNMR定量測(cè)定毒死蜱和甲基對(duì)硫磷，兩種化合物的加標(biāo)回收率分別為87.25%～92.70%，79.8%～93.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.90%～2.46%，0.85%～1.56%。Belmonte-Sánchez等[46]利用31P-qNMR 定量測(cè)定了蔬菜中洗滌劑羥基亞乙基二膦酸(HEDP)，使用Na2HPO4作為內(nèi)標(biāo)校正，HEDP的線性范圍為0.01%～0.05%，延遲時(shí)間為0.01 s，掃描時(shí)間為1 min 時(shí)方法的檢出限為0.017%，掃描時(shí)間為60 min時(shí)的檢出限為0.003%，方法的加標(biāo)回收率為95.0%～105.4%，10種蔬菜洗滌液中HEDP含量為0.003%～0.050%。

3.5 化合物純度及不確定度評(píng)價(jià)

NMR被廣泛應(yīng)用于食品分析用標(biāo)準(zhǔn)品純度及不確定度評(píng)價(jià)、農(nóng)藥純度鑒定等領(lǐng)域。Greenhalgh等[47]使用磷酸三苯酯作為內(nèi)標(biāo)，使用乙酰丙酮鉻作為順磁試劑測(cè)定了11種工業(yè)級(jí)有機(jī)磷殺毒劑的純度和主要雜質(zhì)含量。Al-Deen等[4]以磷酸鈉作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)測(cè)定草甘膦和丙溴磷純度，使用1H-NMR 測(cè)得草甘膦純度為97.07%，σ= 0.68，使用31P-qNMR測(cè)其純度為96.53%，σ= 0.90；使用1H-NMR測(cè)得丙溴磷純度為94.63%，σ= 0.14，使用31P-NMR 測(cè)其純度為94.62%，σ= 0.59。Al-Deen等[48]使用31P-qNMR法測(cè)定了草甘膦純度的不確定度，單次測(cè)定純度的擴(kuò)展不確定度為0.82%(95%置信區(qū)間，k=2)。Shamsipur等[21]使用磷酸作為內(nèi)標(biāo)，用31P-qNMR檢測(cè)敵百蟲、毒死蜱、殺螟松、二嗪農(nóng)、草甘膦5種有機(jī)磷農(nóng)藥純度，其線性范圍為25～300 mg/L，前4種農(nóng)藥檢出限為3 mg/L，草甘膦檢出限為16.3 mg/L，分析結(jié)果與氣相色譜儀檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，使用該方法不需要任何前處理，方便簡(jiǎn)潔，可快速測(cè)定農(nóng)藥中的有效純度。盧愛民等[49]以重水為溶劑、磷酸二氫鉀為內(nèi)標(biāo)，以化學(xué)位移δ0.017，δ41.86作為定量峰，根據(jù)公式計(jì)算出草銨膦原藥的有效成分含量，測(cè)得同一批次原藥中有效成分含量平均值為98.73%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，此方法簡(jiǎn)單、快捷，不需要待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)品，可用作一些特殊樣品的定性定量分析。Weber等[50]使用同時(shí)含有H和P原子的磷酸三苯酯，以有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CRM)磷酸三苯酯為內(nèi)標(biāo)，用31P-qNMR法測(cè)得磷酸三(2-氯乙基)磷酸酯純度為(98.43±0.66)%，以膦乙酸作為內(nèi)標(biāo)測(cè)其純度為 (98.45±0.44)%。分別使用磷酸三苯酯和膦乙酸作為內(nèi)標(biāo)，以1H-qNMR作為定量，其純度分別為(98.41±0.53)%，(98.88±0.52)%。使用31P-NMR的圖譜簡(jiǎn)單、定量分析快速，是一種很有前途的純度測(cè)定方法。

4 結(jié)論及展望

定量核磁共振磷譜技術(shù)不需要待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品即可完成對(duì)未知物的定量分析，原理易懂、前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，被廣泛應(yīng)用于食品活性磷脂檢測(cè)、磷酸鹽檢測(cè)、有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)、生物活性物質(zhì)檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)品純度鑒定等方面，是一種強(qiáng)大的分析工具。但是定量核磁共振磷譜也存在一定的缺陷，比如靈敏度不高，對(duì)微量成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量仍存在難度，需進(jìn)一步開發(fā)適合31P檢測(cè)的高靈敏度的探頭；并且核磁共振設(shè)備的普及率遠(yuǎn)不及其他色譜儀器，從而限制了這項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。但是隨著科技的發(fā)展量核磁共振技術(shù)必將會(huì)迎來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。