黃連素對脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素分泌的影響及分子機(jī)制

夏文燕 藍(lán)金花 許 榮 呂維名

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州 341300）

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子，其分泌量與肥胖和胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)[1]。高糖環(huán)境可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERs）[2]，損傷脂肪細(xì)胞的分泌功能。目前研究證實(shí)，黃連素是一種異喹啉類生物堿，可以改善脂聯(lián)素的分泌，調(diào)節(jié)糖脂代謝[3]。但國內(nèi)外尚未有關(guān)于黃連素對高糖介導(dǎo)的3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂聯(lián)素分泌的影響及具體機(jī)制的報(bào)道。本研究探討黃連素對高糖介導(dǎo)的3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂聯(lián)素蛋白分泌的影響，并進(jìn)一步探討是否通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白PERK/eIF2a水平改善脂聯(lián)素的可能分子機(jī)制，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

3T3-L1前 脂 肪 細(xì) 胞 株（American Type culture collection，ATCC）；高糖（DMEM）培養(yǎng)基（ DMEM 美國 GIBCO 公司）；高糖無酚紅（DMEM）培養(yǎng)基（美國 Sigmag公司）；胎牛血清（美國 GIBCO 公司）；地塞米松（DEX，D4902）（美國 SIGMA 公司）；胰島素（若和靈 R）（丹麥諾和諾德公司）；黃連素購于上?？稻呕び邢薰?；葡萄糖購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；兔抗人eIF2a 單克隆 抗體（美國BPB公司）；蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK），（1∶200稀釋，美國Santa Cruz），p-PERK（1∶1 000稀釋，美國Santa Cruz）及脂聯(lián)素抗體（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用10%的胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液，在 37 ℃、7% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合率達(dá)到 80%～90% 時(shí)，用胰蛋白酶（0.25%）消化并傳代于6孔培養(yǎng)板上。待細(xì)胞融合后，加含1μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤及10μg/mL 胰島素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h；以含10μg/mL 胰島素的DMEM培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h，以DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 d，10 d左右的誘導(dǎo)分化90%3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，細(xì)胞內(nèi)見脂滴。

1.2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞分組 將3T3-L1脂肪細(xì)胞分三組，每組用無血清培養(yǎng)液預(yù)處理 6 h同步化后，設(shè)對照組，高糖組，高糖+黃連素組（黃連素組）。對照組不加任何處理，溫育24 h；高糖組加入葡萄糖至終濃度25.5 mmol/L，溫育24 h；在黃連素組加入黃連素（20 umol/L）和高糖（25.5 mmol/L），溫育24 h。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白的表達(dá) 總蛋白樣品用SDSPAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉，加入p-PERK、PERK、eIF2a、脂聯(lián)素、actin多克隆抗體孵育至少12 h，洗滌，加入標(biāo)記辣根過氧化酶（HRP）的II抗室溫孵育1 h，再洗滌。用ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進(jìn)行定量掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連素組抑制高糖誘發(fā)的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，高糖組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白p-PERK、eIF2a分別與對照組、黃連素組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1-3。

2.2 黃連素和高糖對脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的影響

用 Western blot 檢測脂聯(lián)素蛋白水平，高糖組與對照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），黃連素組與高糖組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4-5。

3 討論

脂聯(lián)素為脂肪細(xì)胞分泌因子中的代表性成員，為脂肪細(xì)胞特異性分泌。脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)糖脂代謝的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，有研究證實(shí)，在脂聯(lián)素敲除大黃魚中出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗、肥胖[4]。脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因的小鼠即使采用高脂喂養(yǎng)，卻可明顯抑制脂肪細(xì)胞的肥大、脂肪組織炎癥等，在肝臟中脂聯(lián)素可以抑制糖異生，改善非酒精性脂肪肝的形成[5]。脂聯(lián)素的減少對代謝綜合癥的發(fā)生發(fā)展有重要意義。故研究藥物能否抑制脂聯(lián)素的下降及作用靶點(diǎn)具有重要意義。

此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖脂代謝紊亂的重要地位已被證實(shí)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上堆積增多，并啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白至少包括三個(gè)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上出現(xiàn)在胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔域的直接信號成員，包括PERK，（ATF）6，IRE1[7]。PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的絲蘇氨酸蛋白激酶，可以激活下游的真核生物翻譯啟動(dòng)因子2 a亞組（eIF2a），eIF2a活化后隨后抑制蛋白的合成并防止新生蛋白進(jìn)一步流入飽和的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，保護(hù)細(xì)胞，但隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的延長，使得通路激活其它信號分子，參與疾病的病理變化，促進(jìn)細(xì)胞受損及凋亡。持續(xù)高糖環(huán)境可誘發(fā)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分泌功能紊亂。研究證實(shí)高糖可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件PERK磷酸化并通過eIF2a途徑引誘各種抗氧化物的生成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高糖處理后，p-PERK和eIF2a蛋白水平增高，顯著高于對照組。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，高糖（25 mmol/L）可以抑制脂聯(lián)素的分泌，提示高糖有可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK和eIF2a來抑制脂聯(lián)素的分泌。

黃連素是一種天然植物提取物，毒副作用小，價(jià)格便宜，對改善糖脂代謝有明顯療效，是潛在的治療糖尿病的藥物。已有研究證實(shí)[8]，黃連素可以抑制大鼠骨骼肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，改善胰島素抵抗。在本研究中，結(jié)果提示黃連素處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件PERK、eIF2a蛋白水平減少，脂聯(lián)素分泌上調(diào)，其蛋白水平與高糖組有顯著差異（P＜0.05），這提示黃連素可能參與了抑制高糖激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK/eIF2a來上調(diào)脂聯(lián)素的分泌，發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用。

綜上所述，高糖可抑制脂聯(lián)素的分泌，黃連素可以改善高糖誘發(fā)的脂肪細(xì)胞的這種分泌異常，并可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a通路來抑制高糖所誘發(fā)的脂聯(lián)素下降。了解作用靶點(diǎn)和機(jī)制可為臨床用藥提供相關(guān)依據(jù)，但是否還有其它機(jī)制共同調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。