沉默Ttf1 對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞及雌性大鼠弓狀核內(nèi)Kiss1 和GnRH基因表達(dá)的影響

臧少蓮，尹小琴，呂擁芬，許麗雅，郭 盛，李 嬪

上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，上海市兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海200333

青春期是生長和發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，該階段的正常發(fā)育依賴于正常的神經(jīng)內(nèi)分泌功能。下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸調(diào)控人類的青春期發(fā)育和生殖功能，并且由興奮性和抑制性因子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)嚴(yán)格調(diào)控，在胚胎期和嬰幼兒早期階段激活，在兒童期受到抑制，青春期開始時(shí)被重新激活并達(dá)到高潮[1]。促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神經(jīng)元的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，迄今為止關(guān)于青春期起始GnRH 神經(jīng)元被激活的具體機(jī)制尚不清楚。親吻素（KISS1）是Kiss1 基因編碼產(chǎn)生的一種肽類激素，已有研究證實(shí)，KISS1 蛋白與G 蛋白偶聯(lián)受體54（G-protein-coupled receptor 54，GPR54）是調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元活性和青春期發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2]，主要分布在下丘腦的前腹側(cè)室旁核（anteroventral periventricular，AVPV）和弓狀核（arcuate nucleus，ARC）[3]。雌激素是調(diào)節(jié)雌鼠下丘腦Kiss1 表達(dá)的關(guān)鍵因子，在AVPV 中它通過激活表達(dá)KISS1 神經(jīng)元上的雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα），正反饋促進(jìn)GnRH 神經(jīng)元分泌黃體生成素（luteinizing hormone，LH），刺激排卵；而在ARC中，雌激素則通過負(fù)反饋抑制KISS1 的釋放。ARC 和AVPV 共同作用產(chǎn)生LH 的脈沖式釋放，形成穩(wěn)定的生殖 周期[4-5]。

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1），又稱為NK2 相關(guān)的同源轉(zhuǎn)錄因子1（NK2-related homeobox transcription factor 1，Nkx2-1）或甲狀腺特異性增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（thyroid-specific enhancer-binding protein，T/ebp），主要在前腦、垂體、肺和甲狀腺等器官中表達(dá)[6]。Sandberg 等[7]研究發(fā)現(xiàn)TTF1 可以通過直接結(jié)合靶基因附近的調(diào)控元件而充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子的角色。近年的研究[8]表明，TTF1 可能是Kiss1 上游的調(diào)控因子，通過直接調(diào)節(jié)Kiss1 的表達(dá)參與青春期性發(fā)育的調(diào)控。

敲除或敲低相關(guān)宿主基因?qū)τ谘芯考?xì)胞內(nèi)關(guān)鍵分子的作用機(jī)制至關(guān)重要。慢病毒載體可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并穩(wěn)定整合到宿主基因組中并長期表達(dá)，是長期基因傳遞的良好載體，因此慢病毒載體介導(dǎo)的RNA 干擾（RNA interference，RNAi）仍然被廣泛使用[9]。為進(jìn)一步證明TTF1 與青春期發(fā)育之間的關(guān)系，本研究設(shè)計(jì)并合成針對(duì)大鼠Ttf1 基因的干擾序列，構(gòu)建有效慢病毒載體。在體外細(xì)胞水平測定慢病毒干擾效率后，進(jìn)一步在體內(nèi)利用腦立體定位技術(shù)將LV-TTF1-shRNA 原位注射至雌性大鼠下丘腦ARC 中，靶向敲低ARC 內(nèi)Ttf1 的表達(dá)，觀察青春期性發(fā)育過程的變化以及對(duì)Kiss1 和GnRH 基因表達(dá)的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 3 周齡的健康清潔級(jí)雌性Sprague-Dawley 大鼠（50 ～60 g）由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005]，隨機(jī)分為ARC 慢病毒注射組和ARC 病毒對(duì)照組，每組30 只。利用腦立體定位儀在大鼠ARC 內(nèi)進(jìn)行雙側(cè)顯微注射。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物科學(xué)部[動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2016-0020]，飼養(yǎng)條件為自然光照，平均溫度（21±2） ℃，相對(duì)濕度（55±10） %，12 h 明暗周期，大鼠自由攝食 飲水。

人胚腎細(xì)胞293T 為貼壁依賴型上皮樣細(xì)胞，神經(jīng)母細(xì)胞ND7-23 為貼壁神經(jīng)元細(xì)胞，2 株細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；常規(guī)培養(yǎng)使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)液（含4.0 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶（1 U/μL）、DNA 標(biāo)志物GeneRuler DNA Ladder、RNA 酶抑制劑（Fermentas，加拿大），TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶、dNTPs、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒（Axygen，美國），包裝質(zhì)粒、空病毒載體PDS019_pL_shRNA_F（上海諾百生物科技有限公司），DMEM、Opti-MEM、0.25%胰蛋白酶、FBS（Gibco，美國），氯仿、異丙醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DEPC 水、3-磷酸甘油 醛 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（上海翊圣生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）試劑盒（TaKaRa，日本），蛋白裂解液、ECL 發(fā)光試劑盒（ThermoFisher，美國），TTF1 抗體、KISS1 抗體（Abcam，英國），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（Jackson，美國），Western blotting 抗體快速剝離緩沖液（上海雅酶生物科技有限公司），戊巴比妥鈉（Sigma，美國）。

10 μL 微量注射器（上海高鴿工貿(mào)有限公司），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國），熒光顯微鏡（Leica，德國），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士），紫外分光光度計(jì)（ThermoFisher，美國），ChemiScope 3500 化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。DNA 測序和引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 LV-TTF1-shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 對(duì)Ttf1 基因序列（NM_013093.1）進(jìn)行分析，檢查基因內(nèi)部有無特別復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列。然后采用Invitrogen 公司提供的在線設(shè)計(jì)工具（www.invitrogen.com/rnai）針對(duì)大鼠的Ttf1 基因設(shè)計(jì)3 對(duì)shRNA 引物序列（表1）。在序列的5'端添加限制性酶切位點(diǎn)及Kozak 序列GCCACC，在序列的3'端添加限制性酶切位點(diǎn)。將shRNA 引物混合溶液于95 ℃加熱5 min，72 ℃退火5 min 后利用DNA 連接酶連接入空載體PDS019_pL_shRNA_F 中。

1.2.2 慢病毒質(zhì)粒的包裝 取對(duì)數(shù)生長期且細(xì)胞狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打形成單細(xì)胞懸液，按照6×106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種到10 cm 的培養(yǎng)皿中，次日將細(xì)胞完全培養(yǎng)液換成5 mL Opti-MEM 培養(yǎng)液。將9 μg 包裝質(zhì)粒和3 μg 慢病毒質(zhì)粒加入1.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)液中充分混勻；同時(shí)取36 μL Lipofectamine 2000 加入另外的1.5 mL Opti-MEM 培養(yǎng)液中，混勻后室溫放置20 min。將這2 種液體混合后加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h 后，換成完全培養(yǎng)液（含10%FBS），繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000×g離心10 min，并用孔徑0.45 μm 的濾器進(jìn)行過濾。將過濾后的病毒原液50 000×g 超速離心2 h，移去上清液，加入1 mL DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，并利用熒光法測定病毒滴度，然后按需分裝至小管，置于-80 ℃冰箱中保存 備用。

1.2.3 LV-TTF1-shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞 將ND7-23 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中。梯度稀釋病毒原液后轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察不同病毒稀釋度轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞后的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表達(dá)比例，從而確定慢病毒最佳轉(zhuǎn)染濃度。將細(xì)胞分成空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（NC 組）、LV-TTF1-shRNA1 組、LV-TTF1-shRNA2 組、LV-TTF1-shRNA3 組進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄病毒液，加入完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞沉淀用于qPCR 和Western blotting 檢測慢病毒的干擾效率。

1.2.4 下丘腦核團(tuán)內(nèi)雙側(cè)顯微注射 根據(jù)本課題組前期研究[10-11]，在大鼠21 日齡進(jìn)行手術(shù)可使LV-TTF1-shRNA在青春期開始前達(dá)到最大表達(dá)量。將21 日齡雌性大鼠用1%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）深度麻醉后，置于腦立體定位儀上，切開皮膚和骨膜以暴露前囟點(diǎn)。采用10 μL 微量注射器進(jìn)行顯微注射，并在其尖端再連接一段玻璃毛細(xì)管，以減小對(duì)大鼠腦部的損傷。將3 μL LV-TTF1-shRNA3慢病毒質(zhì)粒（1.2×109TU/mL，LV 組）或LV-EGFP（即空病毒載體PDS019_pL_shRNA_F，NC 組）顯微注射到大鼠ARC 中。注射后，將針頭保留在原處5 ～10 min，然后在1 min 內(nèi)緩慢取出，在對(duì)側(cè)核重復(fù)該操作。實(shí)驗(yàn)過程中，參考Paxinos 等[12]的腦圖譜和前期研究結(jié)果[13-14]，確定ARC 的立體坐標(biāo)（外側(cè)0.4 mm，前囟后1.6 mm，硬腦膜下9.6 mm）。術(shù)后于每日上午9:00—9:30 觀察大鼠陰門開啟情況。然后分別在大鼠幼年期（25 日齡）、青春發(fā)育早期（35 日齡）、成年期（42 日齡）腹腔注射過量的戊巴比妥鈉實(shí)施安樂死，斷頭取腦，迅速分離ARC 核團(tuán)，并保存于液氮中，用于測定RNA 和蛋白的表達(dá)。

1.2.5 qPCR 檢測 使用TRIzol 試劑提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA 的濃度和純度。每個(gè)樣本取1 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min）。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃，3 min 變性；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)。以β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因作為內(nèi)參基因。各基因引物序列見表2。

1.2.6 Western blotting 檢測 利用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液提取細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)，BCA 法測定各組蛋白質(zhì)濃度，加熱變性處理后進(jìn)行Western blotting檢測。10%（用于TTF1）或12%（用于KISS1）SDSPAGE 進(jìn)行半干電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA、70 min。5%脫脂牛奶封閉1 h 后加入抗TTF1 抗體（1:500）、抗KISS1 抗體（1:400）或抗GAPDH 抗體（1:10 000），4 ℃振蕩過夜；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:10 000），室溫孵育1 h。用ECL 發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，經(jīng)顯影處理后，膠片用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒侵染ND7-23 細(xì)胞后TTF1 的表達(dá)

慢病毒轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞72 h 后，在熒光顯微鏡下可見EGFP 表達(dá)（圖1），證明轉(zhuǎn)染成功。qPCR 結(jié)果（圖2A）顯示，NC 組與空白對(duì)照組相比，Ttf1 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NC 組相比，LV-TTF1-shRNA2 組和LV-TTF1-shRNA3 組Ttf1 mRNA 表達(dá)量顯著下降（均P=0.000），TTF1-shRNA2 和TTF1-shRNA3 的干擾效率分別為54.54%和64.24%。Western blotting 結(jié)果（圖2B）顯示：NC 組與空白對(duì)照組相比，TTF1 蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NC 組相比，LV-TTF1-shRNA2 組和LV-TTF1-shRNA3 組TTF1 蛋白表達(dá)顯著降低（均P＜0.05），與PCR結(jié)果一致。根據(jù)對(duì)Ttf1 mRNA 和蛋白表達(dá)的抑制率，選擇干擾效率最佳的TTF1-shRNA3 構(gòu)建慢病毒載體并包裝病毒，用于后續(xù)的動(dòng)物體內(nèi)下丘腦ARC 核團(tuán)的注射。

圖1 LV-TTF1-shRNA 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞（×100）Fig 1 Transfection of ND7-23 cells with LV-TTF1-shRNA plasmid (×100)

圖2 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞72 h 后Ttf1 mRNA 和蛋白的表達(dá)量 Fig 2 Expressions of Ttf1 mRNA and protein 72 h after transfection of lentiviral plasmids in ND7-23 cells

2.2 LV-TTF1-shRNA3 慢病毒質(zhì)粒侵染ND7-23 細(xì)胞后Kiss1 和GnRH 的表達(dá)

LV-TTF1-shRNA3 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ND7-23 細(xì)胞72 h后，qPCR 結(jié)果（圖3）顯示：NC 組與空白對(duì)照組比較，Kiss1 和GnRH mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NC 組相比，LV-TTF1-shRNA3 組的Kiss1 和GnRH mRNA 表達(dá)顯著降低（均P＜0.05）。

2.3 慢病毒質(zhì)粒在大鼠ARC 核團(tuán)的原位注射

參考Paxinos 等[12]的腦圖譜，利用腦立體定位注射儀，先通過注射藍(lán)墨水確定ARC 核團(tuán)位置（圖4A、B），然后在雙側(cè)ARC 內(nèi)顯微注射LV-EGFP。雌鼠25 日齡時(shí)通過熒光顯微鏡在ARC 內(nèi)觀察到高密度表達(dá)EGFP 的細(xì)胞（圖4C、D），在注射通道中也觀察到一些少量的EGFP 表達(dá)。

圖3 LV-TTF1-shRNA3 轉(zhuǎn) 染ND7-23 細(xì) 胞72 h 后Kiss1 和GnRH mRNA 的 表達(dá)Fig 3 mRNA expressions of Kiss1 and GnRH in ND7-23 cells 72 h after LV-TTF1-shRNA3 transfection

圖4 LV-EGFP 在大鼠下丘腦ARC 內(nèi)的定位及表達(dá)Fig 4 Location and expression of LV-EGFP in the ARC in hypothalamus after LV-EGFP injection in the rats

2.4 大 鼠ARC 內(nèi) 注 射LV-TTF1-shRNA3 后 對(duì)Kiss1 和GnRH 基因表達(dá)的影響

對(duì)21 日齡的雌性大鼠ARC 核團(tuán)原位注射LV-TTF1-shRNA3 或LV-EGFP 后，分別于25 日齡、35 日齡、42 日 齡處死大鼠，分離ARC 核團(tuán)。通過qPCR 檢測大鼠ARC中Ttf1、Kiss1、GnRH mRNA 的 表 達(dá)。Ttf1 mRNA 在ARC 中顯著降低（均P=0.000，圖5A），Kiss1 和GnRH mRNA 也 顯 著 降 低（均P＜0.05，圖5B、C）。Western blotting 結(jié)果與qPCR 結(jié)果一致，在3 個(gè)不同發(fā)育階段，LV 組的TTF1 蛋白表達(dá)顯著降低，與NC 組相比，35 日齡和42 日齡時(shí)，LV 組KISS1 蛋白表達(dá)顯著下降（均P＜0.05，圖5D～F）。

2.5 大鼠ARC 內(nèi)注射LV-TTF1-shRNA3 后對(duì)性發(fā)育的影響

21 日齡雌性大鼠ARC 內(nèi)注射LV-TTF1-shRNA3 后，陰門開啟時(shí)間較NC 組明顯延遲（P=0.000，圖6）。

圖5 ARC 內(nèi)注射LV-TTF1-shRNA3 后對(duì)Kiss1 和GnRH 表達(dá)的影響Fig 5 Effect of intra-ARC LV-TTF1-shRNA3 administration on the expressions of Kiss1 and GnRH

圖6 ARC 內(nèi)注射LV-TTF1-shRNA3 后對(duì)雌性大鼠青春期發(fā)育的影響（n=7）Fig 6 Effect of intra-ARC LV-TTF1-shRNA3 administration on female rat puberty (n=7)

3 討論

2001 年，Lee 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中樞性性早熟會(huì)使得下丘腦病變部位附近的神經(jīng)元TTF1 表達(dá)量增加。先前，Kimura 等[6]就發(fā)現(xiàn)，攜帶Ttf1 基因失活突變的小鼠下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和背側(cè)核發(fā)育停滯，第三腦室腹側(cè)發(fā)生融合，缺乏弓狀核。在哺乳動(dòng)物青春期啟動(dòng)之前，下丘腦中Ttf1 mRNA 的表達(dá)會(huì)隨著發(fā)育逐漸增加[15]。Kim 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在26 ～27 日齡，即青春期啟動(dòng)之前，TTF1的表達(dá)會(huì)達(dá)到一個(gè)明顯的峰值。這些研究結(jié)果表明TTF1不僅參與哺乳動(dòng)物的青春期發(fā)育，還與下丘腦神經(jīng)核團(tuán)的發(fā)育密不可分，更加支持了TTF1 是由中樞控制青春期啟動(dòng)的重要成分。

本研究使用的ND7-23 細(xì)胞能夠表達(dá)內(nèi)源性TTF1，是研究TTF1 調(diào)控Kiss1 的良好體外模型。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在ND7-23 細(xì)胞內(nèi)下調(diào)Ttf1 可以降低細(xì)胞內(nèi)Kiss1 和GnRH 基因的表達(dá)。進(jìn)而通過腦立體定位儀將LV-TTF1-shRNA 慢病毒質(zhì)粒原位注射到21 日齡雌性大鼠下丘腦ARC 內(nèi)，在青春期啟動(dòng)之前特異性干擾核團(tuán)內(nèi)Ttf1 的表達(dá)，觀察其對(duì)雌鼠青春期發(fā)育的影響。手術(shù)完成4 d 后，通過冰凍切片，可以明顯觀察到ARC 內(nèi)有EGFP 表達(dá)。腦立體定位注射將慢病毒質(zhì)粒傳遞到細(xì)胞或哺乳動(dòng)物體內(nèi)，可使得目的片段在特定位置穩(wěn)定并持續(xù)地表達(dá)；并且TTF1-shRNA 可以在雌鼠青春期內(nèi)持續(xù)發(fā)揮干擾作用，且抑制Ttf1 表達(dá)后，不僅使得Kiss1 和GnRH 基因表達(dá)顯著下調(diào)，而且也導(dǎo)致雌鼠陰門開放時(shí)間明顯延遲。雖然前期有研究者使用Cre/Loxp 技術(shù)構(gòu)建小鼠分化神經(jīng)元內(nèi)的Ttf1基因敲除動(dòng)物模型[17]，小鼠也出現(xiàn)了青春發(fā)育延遲，但是Cre/Loxp 技術(shù)時(shí)間和價(jià)格成本較高，且胚胎期小鼠不易存活。因此我們通過腦立體定位注射慢病毒來研究Ttf1 對(duì)雌鼠青春期發(fā)育的影響及其分子機(jī)制，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這也表明利用慢病毒載體持續(xù)沉默靶基因是一種研究影響青春期發(fā)育因素的有效方法。

綜上所述，抑制下丘腦ARC 中Ttf1 的表達(dá)可以引起啟動(dòng)HPG 軸Kiss1 的表達(dá)減少和GnRH mRNA 的降低，從而延遲雌鼠陰門開放時(shí)間。TTF1 在青春期發(fā)育過程中起著重要的作用，本研究可能為兒童性早熟的治療提供新的理論依據(jù)。

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