程序性壞死的誘導(dǎo)劑和抑制劑及其在疾病中作用的研究進(jìn)展

曹力元，牟 為

上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025

程序性壞死（necroptosis）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡方式。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，細(xì)胞死亡分為凋亡和壞死。其中細(xì)胞凋亡（apoptosis）是指有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動自身內(nèi)部信號通路，主要通過內(nèi)源性DNA 內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞自然死亡過程，是一種主動有序的細(xì)胞死亡方式。而壞死（necrosis）是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素的作用而產(chǎn)生的一種無序死亡過程，其發(fā)生是不可控的，且往往具有不可逆性。隨著相關(guān)研究的逐漸深入，研究人員發(fā)現(xiàn)了另外一種細(xì)胞死亡方式，具有與壞死類似的形態(tài)學(xué)特征，但卻受細(xì)胞內(nèi)特定的信號通路調(diào)控，并且在凋亡被抑制的條件下，作為一種替代方式來介導(dǎo)細(xì)胞死亡。2005 年，Degterev 等[1]首次提出了程序性壞死的概念，即指細(xì)胞的一種程序性死亡（programmed cell death）方式（程序性死亡還包括凋亡和焦亡）。他們發(fā)現(xiàn)，一種小分子化合物necrostatin-1（Nec-1）可以抑制程序性壞死的發(fā)生，進(jìn)一步證明了程序性壞死的可調(diào)控性。在程序性壞死的信號通路中，最核心、最經(jīng)典的通路由3 個(gè)重要部分組成：受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）和混交激酶域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）。由此得出一個(gè)與傳統(tǒng)理論不同的觀點(diǎn)，即壞死也可以是細(xì)胞的一種程序性死亡方式，其發(fā)生和發(fā)展是可調(diào)控的。本文重點(diǎn)討論程序性壞死在疾病中的作用，包括在腫瘤和炎癥性疾病中的雙重作用，并探討程序性壞死的誘導(dǎo)劑和抑制劑，以及誘導(dǎo)或抑制程序性壞死所具有的科研和臨床意義。

1 程序性壞死在疾病中的影響及調(diào)控

程序性壞死與多種疾病相關(guān)。以往的研究認(rèn)為，程序性壞死參與了炎癥性疾病和缺血再灌注等疾病的發(fā)展過程；近年來的研究[2-3]表明，程序性壞死與惡性腫瘤也密切相關(guān)，其有望成為抗癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

1.1 腫瘤

以往很多程序性壞死相關(guān)疾病的研究是聚焦于炎癥性疾病，然而近年來，越來越多的研究開始關(guān)注程序性壞死在腫瘤中的作用。研究[2]表明，程序性壞死相關(guān)分子RIPK1、RIPK3 和MLKL 與放射治療（放療）后的腫瘤再增殖密切相關(guān)。此外，乳腺癌和肺癌等腫瘤細(xì)胞能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移。使用程序性壞死抑制劑Nec-1 或條件性敲除內(nèi)皮細(xì)胞Ripk3 基因能夠減少腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞壞死，抑制腫瘤細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移[4]。雖然內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死可能利于腫瘤轉(zhuǎn)移，但是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死卻有望成為治療腫瘤的新策略。許多研究[5-6]表明，程序性壞死通路中的關(guān)鍵蛋白在某些腫瘤中是低表達(dá)的，比如RIPK3在原發(fā)性結(jié)腸癌中低表達(dá)[6]。由此可以推斷，在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中程序性壞死被抑制，這有可能是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的原因之一。目前，抗癌藥的機(jī)制主要是靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但存在腫瘤細(xì)胞耐藥問題。Han等[3]人發(fā)現(xiàn)，在耐藥腫瘤細(xì)胞中可以通過激活程序性壞死通路來介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。事實(shí)上，程序性壞死被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡受到抑制或阻斷時(shí)發(fā)生的一種替代性死亡方式[7]。雖然前面提到程序性壞死會促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但也有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)天然化合物紫草素和酯蟾毒配基能通過激活程序性壞死從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，程序性壞死有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

1.2 炎癥性疾病

發(fā)生了程序性壞死后，細(xì)胞破裂，細(xì)胞的炎性物質(zhì)（如炎癥因子等）釋放進(jìn)入組織液中，引起炎癥反應(yīng)；同時(shí)炎癥反應(yīng)又能引起包括程序性壞死的細(xì)胞壞死。與程序性壞死相關(guān)的炎癥性疾病包括腸炎、腎炎和骨關(guān)節(jié)炎等。以腸炎[10]為例，建立小腸上皮細(xì)胞Fas 相關(guān)死亡域蛋白（Fas-associated protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD）基因敲除的小鼠模型后，小鼠馬上發(fā)生了小腸炎和大腸炎。然而敲除Ripk3 基因則能阻止腸炎的發(fā)生，表明程序性壞死參與了腸炎的發(fā)生過程。RIPK1 和RIPK3 能激活炎癥信號通路，分泌促炎因子。如RIPK3 能夠激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligometric domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體，引起白細(xì)胞介素-1（interleukin 1，IL-1）等細(xì)胞因子的釋放。進(jìn)一步研究[11]表明，RIPK3 在Mlkl 敲除的情況下仍能激活NLRP3，表明在細(xì)胞死亡前炎癥反應(yīng)就已經(jīng)發(fā)生。事實(shí)上，程序性壞死還參與其他疾病，如缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病等的炎癥反應(yīng)，加重細(xì)胞或組織損傷。

綜上所述，程序性壞死在疾病中的作用可分為2 個(gè)方面：既能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)和加重炎癥性疾病，是一個(gè)危險(xiǎn)因素；又能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，提供了一個(gè)潛在的治療策略。

2 程序性壞死的誘導(dǎo)機(jī)制及誘導(dǎo)劑

2.1 誘導(dǎo)機(jī)制

程序性壞死可由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、DNA 損傷、輻射等引起，其中以TNF 誘導(dǎo)發(fā)生的程序性壞死最為經(jīng)典。本文重點(diǎn)討論TNF-α 誘發(fā)程序性壞死的信號通路。TNF-α 為TNF 的一種分型，是重要的促炎細(xì)胞因子，參與介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)。TNF-α 激活腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）可引起多種信號通路，包括核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、RIPK1 非依賴性凋亡（RIPK1 independent apoptosis，RIA）、RIPK1 依賴性凋亡（RIPK1 dependent apoptosis，RDA）和程序性壞死。三聚型TNF-α 激活TNFR1，通過結(jié)合外側(cè)死亡結(jié)構(gòu)域的方式招募RIPK1 和腫瘤壞死因子受體1 相關(guān)死亡域蛋白（TNFR1-associated death domain protein，TRADD）；TRADD 招 募 腫 瘤 壞 死因子受體相關(guān)因子2/5（TNF receptor-associated factor 2/5，TRAF2/5）和E3 泛素連接酶cIAP 1/2，形成復(fù)合物complex Ⅰ。如果complex Ⅰ中的TRADD 招募FADD 和半胱天冬酶caspase-8，在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物complex Ⅱ a，則介導(dǎo)RIA。如果RIPK1 形成RIPK1 二聚體，與FADD和caspase-8 形成復(fù)合物complex Ⅱ b，則介導(dǎo)RDA。而當(dāng)caspase-8 活性被抑制時(shí)，RIPK1 二聚體與RIPK3 結(jié)合形成復(fù)合物complex Ⅱ c（即RIPK1-RIPK3 復(fù)合物，又稱為necrosome），complex Ⅱ c 進(jìn)一步募集并磷酸化MLKL，MLKL 作為細(xì)胞死亡的執(zhí)行者最終會導(dǎo)致程序性壞死的發(fā)生[7]（圖1）。

圖1 程序性壞死的調(diào)控通路及其與不同疾病的關(guān)系Fig 1 Signaling pathways of necroptosis and its role in different diseases

雖然TNF 不僅誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，還啟動程序性壞死，具有強(qiáng)大的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，但當(dāng)大量的TNF 進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)時(shí)，會產(chǎn)生類似膿毒血癥的癥狀，甚至引起中毒性休克，最終導(dǎo)致多器官衰竭和死亡。TNF 嚴(yán)重的不良反應(yīng)使得其在臨床上的應(yīng)用受到了極大的限制，目前僅應(yīng)用于少數(shù)疾病的局部治療，如TNF 與γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和米爾法蘭（melphalan）聯(lián)合治療四肢黑色素瘤和軟組織肉瘤[12]，采用孤立肢體灌注方法避免TNF 的系統(tǒng)性反應(yīng)。考慮到TNF 應(yīng)用的局限性，尋找一些可替代的程序性壞死誘導(dǎo)劑成為了新的研究方向之一。

2.2 誘導(dǎo)劑紫草素

事實(shí)上，通過程序性壞死途徑來殺死腫瘤細(xì)胞的思路已經(jīng)在一種天然化合物——紫草素（shikonin）的相關(guān)研究中得到了證實(shí)。紫草素是從天然植物中提取出來的一種萘醌，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，發(fā)揮抗腫瘤的作用，如膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、骨髓瘤和淋巴瘤等。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，紫草素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并引起RIPK1、RIPK3 和MLKL 的表達(dá)水平升高，此過程能被Nec-1 抑制而不能被caspase 抑制劑Z-VAD-fmk 抑制，說明紫草素在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是通過程序性壞死通路引起細(xì)胞死亡而不是凋亡通路[13]。紫草素引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死可能與胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量累積有關(guān)。程序性壞死的過程往往伴隨著ROS 水平升高，ROS 累積能夠引起雙鏈DNA 斷裂。使用線粒體超氧物清除劑抑制ROS 的生成能阻止紫草素誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，而使用ROS 促進(jìn)劑能顯著提高細(xì)胞死亡率[14]。雖然研究[14]表明ROS 位于RIPK1 和RIPK3 的下游通路，但是清除ROS 會抑制RIPK1 和RIPK3 的結(jié)合，而增加ROS能夠促進(jìn)兩者的結(jié)合，說明ROS 的生成反過來又能促進(jìn)RIPK1-RIPK3 復(fù)合物的形成。除了有望應(yīng)用于膠質(zhì)瘤和骨髓瘤這樣尚無有效治療方法的疾病，紫草素還可以通過誘導(dǎo)程序性壞死來應(yīng)對腫瘤耐藥問題。Han 等[3]發(fā)現(xiàn)，紫草素能在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 中誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，這種非凋亡途徑的細(xì)胞死亡方式啟發(fā)研究人員進(jìn)一步探索紫草素在耐藥腫瘤細(xì)胞系中的作用。在Han 等[3]的研究中，他們采用過表達(dá)P 糖蛋白、Bcl-2 和Bcl-xL 的方式構(gòu)建了2 種不同機(jī)制的耐藥細(xì)胞系模型。實(shí)驗(yàn)證明，紫草素能夠誘導(dǎo)過表達(dá)P 糖蛋白的耐藥細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。雖然與非耐藥細(xì)胞相比，紫草素在耐藥細(xì)胞中的殺傷作用需要一定的反應(yīng)時(shí)間，但從最終結(jié)局來看，過表達(dá)P 糖蛋白不會影響紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。在過表達(dá)Bcl-2 和Bcl-xL 的抗凋亡MCF-7 腫瘤細(xì)胞系中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)[3]也證實(shí)紫草素可以誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。這些實(shí)驗(yàn)證明，通過紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的研究思路有望進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤的耐藥研究。

2.3 誘導(dǎo)劑苦參堿及其他化合物

苦參堿（matrine）是從中草藥苦參中提取出來的一種生物堿，在許多研究中被證實(shí)具有抗癌效果，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Xu 等[15]發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠在膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性壞死，腫瘤細(xì)胞具有典型的壞死樣特征，并且Nec-1 能夠抑制細(xì)胞死亡。同時(shí)，苦參堿能夠引起RIPK3表達(dá)水平升高，進(jìn)而活化其下游的MLKL，促進(jìn)ROS的生成。因此，在苦參堿誘導(dǎo)的CCA 細(xì)胞程序性死亡中，既涉及RIPK1-RIPK3-MLKL 信號通路，又有RIPK3-MLKL-ROS 通路的參與。事實(shí)上，苦參堿在很多腫瘤研究中被認(rèn)為是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用，但在CCA中卻是通過誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死而發(fā)揮作用。這表明不同的腫瘤細(xì)胞對凋亡和壞死的敏感度不一樣，某些腫瘤（如CCA）具有壞死敏感性。因此，在某些壞死通路易激活的腫瘤細(xì)胞中，可以通過特異性地誘導(dǎo)程序性壞死來殺死腫瘤細(xì)胞，從而在一定程度上解決腫瘤的耐藥問題。

此外，還有很多其他化合物也可以激活程序性壞死通路（表1）。

表1 程序性壞死的誘導(dǎo)劑Tab 1 Inducers of necroptosis

3 程序性壞死的抑制劑

3.1 特異性抑制劑Nec-1

針對不同的作用靶點(diǎn)，程序性壞死的抑制劑可分為RIPK1 抑制劑、RIPK3 抑制劑和MLKL 抑制劑（表2）。在程序性壞死的抑制劑中，Necrostatins 家族的相關(guān)研究最多，其中以Nec-1 最為典型。Nec-1 是一種小分子生物堿，通過作用于RIPK1 的T 環(huán)結(jié)構(gòu)，抑制RIPK1 的活性，從而抑制RIPK1-RIPK3 復(fù)合體的形成，阻斷下游程序性壞死的發(fā)生。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Nec-1 后，通常表現(xiàn)為RIPK1、RIPK3 和MLKL 的mRNA 水平和蛋白表達(dá)水平下降，以及細(xì)胞死亡率下降。

表2 程序性壞死的抑制劑Tab 2 Inhibitors of necroptosis

由于程序性壞死與凋亡的部分上游通路相同，RIPK1的激活在程序性死亡和RDA 信號通路中至關(guān)重要，研究[29]表明Nec-1 不僅能阻止程序性壞死，也能抑制細(xì)胞凋亡。然而Jie 等[30]卻得出了相反的研究結(jié)果：在炎癥模型中，Nec-1 可以特異性地誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。此外，還有一些學(xué)者[31]認(rèn)為Nec-1 不影響凋亡的發(fā)生。如此不同的研究結(jié)果提示，程序性壞死與凋亡之間可能通過復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)連接，因此在不同的疾病和條件下應(yīng)用Nec-1 會產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在TNF-α 引起的經(jīng)典信號通路中，凋亡分為2 種：RIA 和RDA。當(dāng)?shù)蛲鲆訰IA 為主時(shí)，由于此時(shí)凋亡的發(fā)生不依賴RIPK1，故Nec-1 不影響凋亡的發(fā)生；而當(dāng)?shù)蛲龅姆绞绞荝DA 時(shí)，Nec-1 抑制RIPK1 的活性，導(dǎo)致complex Ⅱ a 無法形成，故凋亡通路受阻。而導(dǎo)致Jie 等[30]的研究結(jié)果的原因可能是凋亡與程序性壞死在一定條件下可以互相轉(zhuǎn)換，當(dāng)?shù)蛲霰灰种茣r(shí)，細(xì)胞通過程序性壞死途徑死亡，而當(dāng)程序性壞死被Nec-1 抑制時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)而通過凋亡途徑死亡[16]。由此可以看出，Nec-1 在不同條件下可以產(chǎn)生不同的效應(yīng)，具有細(xì)胞特異性和疾病特 異性。

3.2 Nec-1 的保護(hù)作用

由于程序性壞死在許多非腫瘤性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著“推波助瀾”的作用，Nec-1 作為其特異性抑制劑能夠在許多疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。在心血管系統(tǒng)疾病中，Nec-1 能顯著縮小小鼠心肌梗死模型的梗死面積，起到心肌保護(hù)作用[32]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，以腦出血為例，Nec-1 可以改善小鼠腦水腫、減少顱內(nèi)損傷以及提高腦神經(jīng)功能[33-34]。Nec-1 還可以在急性肝衰竭、急性腎衰竭和缺血再灌注等疾病模型中發(fā)揮保護(hù)作用，緩解疾病進(jìn)展，提高小鼠的生存期和疾病預(yù)后。

除了程序性壞死和凋亡，Nec-1 也可以通過作用于ROS 通路發(fā)揮其保護(hù)作用。由于ROS 通路位于RIPK1 下游，應(yīng)用Nec-1 可以降低疾病狀況下急劇升高的ROS 水平。在小鼠心肌收縮功能障礙模型中，應(yīng)用Nec-1 能顯著抑制ROS 的生成[35]；在缺氧引起的細(xì)胞損傷中，Nec-1能夠提高細(xì)胞活性，抑制ROS 生成及其對細(xì)胞的損傷[36]；在急性肝衰竭小鼠模型中，Nec-1 不僅能夠緩解線粒體功能障礙，抑制肝細(xì)胞胞內(nèi)ROS 的生成，還能緩解胞外ROS 引起的肝細(xì)胞損傷[37]。雖然Nec-1 降低ROS 水平的具體機(jī)制還不是很清楚，但可以確定的是RIPK1 的激活在ROS 相關(guān)通路中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此應(yīng)用Nec-1不僅能阻斷RIPK1-RIPK3-MLKL 通路，還能抑制RIPK1下游的ROS 通路，從而在多種疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié)語與展望

作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，程序性壞死及其在疾病中的作用近年來受到越來越多的關(guān)注，逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文綜述了目前程序性壞死在多種疾病中的不同作用，并且提出了對應(yīng)的治療策略。在腫瘤疾病中，程序性壞死能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用，因此在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性壞死可能成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)；而在其他疾?。ㄈ缪装Y性疾?。┲校绦蛐詨乃滥芤鸺?xì)胞死亡和組織損傷，因而抑制程序性壞死可以緩解疾病。所以，進(jìn)一步研究程序性壞死的機(jī)制，尋找或研發(fā)特異性誘導(dǎo)劑和抑制劑，使之應(yīng)用于臨床研究，有望成為疾病治療的新策略。

參·考·文·獻(xiàn)

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