生防菌Bacillus safensis的鑒定及其對核桃病原菌的抑菌特性

張知曉，戶連榮，劉 凌，季 梅

(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201)

核桃(Juglansregia)學(xué)名胡桃，是多年生落葉喬木，核桃仁是高檔堅(jiān)果，其種殼能開發(fā)成工藝品，木材是制作高檔家具的原料，葉子及果皮可以入藥。因核桃具有良好經(jīng)濟(jì)社會價值，云南省將核桃作為發(fā)展八大產(chǎn)業(yè)的重要物種之一及打造云南“綠色食品牌”的重要組成部分[1]。近些年來，核桃的種植面積快速增加，有數(shù)據(jù)顯示，截至2017年，云南省核桃種植面積達(dá)286.67萬hm2，核桃(干果)總產(chǎn)量為115萬t，產(chǎn)值318億元，居全國首位[2]。但核桃病蟲害發(fā)生較嚴(yán)重。在云南省，核桃黑斑病、炭疽病、枝枯病及根腐病等發(fā)生普遍，對核桃生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[3]。目前，防治病害仍然依賴化學(xué)藥劑，鑒于人們對綠色無公害食品需求以及生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識的提高，生物防治成為核桃病害防治的重要發(fā)展方向之一。

芽孢桿菌具有抗逆能力強(qiáng)、抑菌譜廣的特點(diǎn)，近些年研究較多的如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)等，在由絲狀真菌引起的植物病害的生防領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[4]。而芽孢桿菌資源豐富，還有許多具有生防效果的種類等待發(fā)掘研究。芽孢桿菌抑菌譜廣泛，但不同菌株對不同病原菌抑制效果不一，且不同芽孢桿菌抑制病原菌的作用機(jī)制不同[5]，因此，在發(fā)掘新生防菌資源的同時，有必要對其抑菌特性進(jìn)行研究。鑒于此，選用前期試驗(yàn)分離驗(yàn)證的具有抑菌效果的1株生防細(xì)菌7-3，對其進(jìn)行分類鑒定，并測定其對核桃主要真菌病害的抑菌特性，為開發(fā)新的生防微生物資源及將生防微生物菌株應(yīng)用于核桃病害防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試生防菌 菌株7-3由云南省林業(yè)和草原科學(xué)院核桃有害生物綠色防控技術(shù)集成與產(chǎn)品開發(fā)項(xiàng)目組，于2019年4月在云南省昆明樹木園(東經(jīng)102°44′48″、北緯25°8′39″)核桃根際土壤中分離篩選得到。

1.1.2 供試病原菌 病原菌7株，均為前述項(xiàng)目組前期分離鑒定的病原菌：鏈格孢菌(Alternariaalternate)，菌株編號B1；胡桃葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictajuglandis)，菌株編號B2；間座殼菌(Diaporthenobilis)，菌株編號B3；鐮孢菌(Fusariumsp.)，菌株編號B4；胡桃楸擬莖點(diǎn)菌(Phomopsisjuglandina)，菌株編號B5；膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)，菌株編號B6；廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)，菌株編號B7。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH值自然，用于生防細(xì)菌培養(yǎng)及形態(tài)鑒定。

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH值自然，用于病原真菌培養(yǎng)及對峙培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防細(xì)菌鑒定 形態(tài)觀察：將菌株7-3在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察菌落生長情況，并用革蘭氏染色法制片完成細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯微觀察[6]。

生理生化特性鑒定：完成菌株溫度(5～60 ℃)、pH值(4.0～13.0)、NaCl(0～12%)耐受試驗(yàn)，測定其水解淀粉和明膠能力，用葡萄糖、麥芽糖、乳糖等碳源及硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等氮源進(jìn)行唯一碳氮源的生長試驗(yàn)[7]。

16S rRNA序列測定：采用DNA提取試劑盒按照操作說明提取菌株的基因組總DNA，用細(xì)菌通用引物27F/1492R擴(kuò)增16S rRNA片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送深圳華大基因有限公司進(jìn)行測序。將獲得的基因序列與GenBank中已知的核酸序列進(jìn)行BLAST比對，選取相關(guān)近緣種序列用MEGA 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.2.2 生防菌對核桃主要病原真菌拮抗功能評價 采用平板對峙試驗(yàn)測試生防菌株7-3發(fā)酵液對7種病原菌的抑菌效果。用5 mm的打孔器沿菌落邊緣選取新鮮的菌絲制成菌餅，單個菌餅接種在PDA培養(yǎng)基平板中央，用移液器吸取50 μL生防菌發(fā)酵液，均勻?qū)ΨQ地接種在距菌餅中央30 mm處的4個點(diǎn)，以接無菌水為對照(CK)。于 28 ℃下培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。待對照組菌落長滿平板后，分別測量對照菌落半徑(R)、處理菌落半徑(r)，計(jì)算抑制率。抑制率=[(R-r)/(R-2.5)]×100%。

1.2.3 生防菌對核桃主要病原菌孢子的影響 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共4個處理：活體發(fā)酵液處理、發(fā)酵濾液處理、發(fā)酵滅菌濾液處理、對照(CK)，每個處理重復(fù)3次。其中，活體發(fā)酵液：將菌株7-3接種于PDA培養(yǎng)液，28 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)24 h，將菌液稀釋為2×109cfu/mL的活體菌液；發(fā)酵濾液：將2×109cfu/mL的活體菌液用細(xì)菌濾器過濾3次后的濾出液；發(fā)酵滅菌濾液：將2×109cfu/mL的活體菌液經(jīng)121 ℃滅菌20 min后，用細(xì)菌濾器過濾1次的濾出液；對照：121 ℃滅菌20 min的滅菌自來水。

病原菌孢子懸浮液制備：用無菌水沖洗PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)分生孢子，離心沉淀分生孢子。反復(fù)清洗3次后，配制成4×106個/mL的孢子懸浮液。

混合培養(yǎng)觀察：將分生孢子懸浮液分別和上述4個處理的液體按1∶1混合，置于離心管中，28 ℃、140 r/min搖床黑暗恒溫培養(yǎng)，分別于12、24 h后，用無菌移液器吸取病原菌孢子，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)，并拍攝照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃病原菌生防細(xì)菌鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)鑒定 如圖1，將菌株7-3在固體LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3 d后，其菌落為淡黃色，邊緣呈波浪狀，表面粗糙，中央無凸起，干燥。顯微鏡下觀察到菌株菌體直桿狀，單個，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性。

A：在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B：革蘭氏染色結(jié)果

2.1.2 生理生化鑒定 菌株生理生化特征檢測結(jié)果(表1)顯示，該菌株能利用葡萄糖、麥芽糖、核糖、甘油、蔗糖、甘露醇、D-果糖、D-核糖和海藻糖作為唯一碳源進(jìn)行生長，能利用硝酸銨、氯化銨、酪氨酸、組氨酸作為唯一氮源進(jìn)行生長，生長溫度在10～50 ℃，生長pH值在5.0～9.0，能耐受10%的NaCl，具有水解明膠的能力，不能水解淀粉。

表1 生防菌株7-3的生理生化特性

2.1.3 16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 利用16S rRNA通用引物，以菌株7-3 DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序得到了長度為1 372 bp 的16S rRNA基因片段(登錄號：MT378305)。將測序獲得的序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示，其與沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)的16S rRNA核苷酸序列同源性最高，達(dá)到100%。選取其相關(guān)近緣種，采用鄰接距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖2)顯示，菌株7-3與沙福芽孢桿菌同聚一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定菌株7-3為沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)。

圖2 生防菌株7-3的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 核桃病原菌生防細(xì)菌拮抗功能評價

菌株7-3對7株核桃病原真菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(圖3)，對鏈格孢菌(Alternariaalternate,B1)、胡桃葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictajuglandis,B2)、間座殼菌(Diaporthenobilis,B3)、鐮孢菌(Fusariumsp.,B4)、胡桃楸擬莖點(diǎn)菌(Phomopsisjuglandina,B5)、廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata,B7)的抑制率在50%以上，抑制效果十分明顯。其中，對間座殼菌(Diaporthenobilis,B3)的抑制率最高，達(dá)到82.9%(圖4)。在所測植物病原真菌中，菌株7-3對膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes,B6)的抑制率最低，僅為47.5%。

2.3 生防細(xì)菌對核桃病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

觀察培養(yǎng)12 h后的孢子萌發(fā)情況(圖5)，發(fā)現(xiàn)對照的孢子開始萌發(fā)，孢子第3色胞略微膨大變圓，產(chǎn)生粗細(xì)均勻的芽管和菌絲。加入活體發(fā)酵液處理的擬盤多毛孢菌(P.disseminata)孢子嚴(yán)重畸形，孢子第3色胞和基部無色胞膨大變形，且基部無色胞多呈囊泡狀；加入發(fā)酵濾液處理的孢子不萌發(fā)，孢子第3色胞膨大變形明顯；加入發(fā)酵滅菌濾液處理的孢子幾乎不萌發(fā)，孢子第3色胞膨大變形明顯。

A：12 h后活體發(fā)酵液孢子形態(tài)；B：12 h后發(fā)酵濾液孢子形態(tài)；C：12 h后發(fā)酵滅菌濾液孢子形態(tài)；D：12 h后對照孢子形態(tài)；E：24 h后活體發(fā)酵液孢子形態(tài)；F：24 h后發(fā)酵濾液孢子形態(tài)；G：24 h后發(fā)酵滅菌濾液孢子形態(tài)；H：24 h后對照孢子形態(tài)

觀察培養(yǎng)24 h后的孢子萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn)，對照的病原菌已經(jīng)形成濃密的菌絲團(tuán)，菌絲生長粗細(xì)均勻，排列整齊，菌絲表面光滑透明，內(nèi)部物質(zhì)分布均勻。加入活體發(fā)酵液處理的細(xì)菌黏附在病原菌擬盤多毛孢菌(P.disseminata)孢子周圍，病原菌孢子分散，第3色胞和基部無色胞體壁破裂乃至溶解，胞質(zhì)外泄，活體菌群的大量黏附，加大了病原孢子畸形及破裂的程度；加入發(fā)酵濾液處理的孢子聚集成團(tuán)，均不萌發(fā)，孢子第3色胞變形嚴(yán)重，且呈囊泡狀畸形；加入發(fā)酵滅菌濾液處理的孢子能夠萌發(fā)，但萌發(fā)率降低，萌發(fā)形成菌絲團(tuán)，與正常菌絲相比，整體粗短，排列雜亂，孢子形成菌絲處瘤狀突起，末端出現(xiàn)異常分枝，菌絲不能正常生長，表明其抑菌能力具有高度穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過前期生防菌的篩選，發(fā)現(xiàn)菌株7-3對病原真菌有良好的抑菌效果，通過生理生化、形態(tài)觀察和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，將菌株7-3鑒定為沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)。沙福芽孢桿菌在許多方面具有應(yīng)用價值，如用于發(fā)酵獲得新型纖溶酶[9]、果膠酶[10]、細(xì)胞外RNase[11]及角蛋白酶[12]等，而其產(chǎn)生的木聚糖酶以及絲氨酸堿性蛋白酶分別在造紙工業(yè)[13]及洗滌劑工業(yè)[14]中具有廣闊的應(yīng)用前景，該菌還被用于發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑[15]，制備調(diào)味品香蘭素[16]，其生物合成的聚羥基丁酸酯(PHB)，可被用于制造生物降解塑料[17]。該菌在油田防腐蝕領(lǐng)域[18]、廢水處理[19]及碳匯領(lǐng)域的應(yīng)用[20]都有報(bào)道。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，沙福芽孢桿菌被報(bào)道具有促進(jìn)植物生長[21]、修復(fù)有毒微量元素[22]、石油[23]及農(nóng)藥[24-25]造成的土壤污染的作用。其中，生防方面已有研究顯示，沙福芽孢桿菌對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)[26]、煙草黑脛病(Phytophthoraparasitica)[27]、硫酸鹽還原菌SRB[18]、細(xì)菌性枯萎病(Pseudomonassp.)[28]、水稻稻瘟病(Magnaportheoryzae)[29]、巴氏絲核菌(Rhizoctoniabataticola)[30]等多種病原真菌及細(xì)菌均有一定的抑制活性，此外，還有學(xué)者對其殺蟲[31]及誘導(dǎo)植株抗性[32]的能力進(jìn)行了研究。

目前，核桃病害的防治仍以化學(xué)防治為主，搭配育種及修枝、清落葉等營林措施[33]，其中化學(xué)農(nóng)藥難免對生態(tài)環(huán)境造成破壞，育種及營造健康林均需要漫長周期，生物災(zāi)害突發(fā)時難以應(yīng)對。生物防治技術(shù)因其見效快，對生態(tài)環(huán)境友好，滿足食品安全需求的優(yōu)點(diǎn)，近幾年發(fā)展迅速。本研究中，菌株7-3能對鏈格孢菌(Alternariaalternate)、胡桃葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictajuglandis)、間座殼菌(Diaporthenobilis)、鐮孢菌(Fusariumsp.)、胡桃楸擬莖點(diǎn)菌(Phomopsisjuglandina)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)和廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)7種核桃病原真菌產(chǎn)生抑菌作用，結(jié)合前人的相關(guān)研究，認(rèn)為沙福芽孢桿菌是一種潛力生防菌，抑菌能力強(qiáng)，抑菌譜廣。RONG等[29]對沙福芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分析，證實(shí)iturin A2和iturin A6 可改變菌絲膜的通透性。本研究結(jié)果顯示，菌株5-1經(jīng)液體發(fā)酵后能夠使病原菌分生孢子及菌絲畸形，進(jìn)而抑制其萌發(fā)及生長，菌群黏附性強(qiáng)，且抑菌能力穩(wěn)定，這些特征表明其在核桃生防領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。然而關(guān)于該菌株的研究才剛剛起步，要將其應(yīng)用于核桃病害的生物防治還需對其代謝途徑、功能機(jī)制等進(jìn)行深入研究，同時還要開展大量的田間防效試驗(yàn)。