植物細(xì)胞器基因編輯研究進(jìn)展

武志強(qiáng) 周家偉

摘 要：基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯或基因組工程，是一種以插入、刪除或堿基替換的形式引起DNA序列突變的技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)有多種類型，如鋅指核酸酶技術(shù)（zinc-finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALENs），以及近幾年迅速發(fā)展起來的規(guī)律成簇短回文重復(fù)序列及其核酸酶9技術(shù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)加速了植物功能基因組學(xué)的發(fā)展，并將在作物精準(zhǔn)育種方面具有巨大的開發(fā)潛力。植物細(xì)胞器基因編輯主要是指對植物線粒體和葉綠體基因組的編輯。植物線粒體和葉綠體分別被稱為細(xì)胞的“動力工廠”和“生產(chǎn)車間”，對于細(xì)胞及整個植株的生長發(fā)育及各種生命活動具有非常重要的作用。對線粒體和葉綠體基因組進(jìn)行編輯將有利于了解其遺傳規(guī)律從而開發(fā)它們在作物改良和工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。目前，細(xì)胞器基因編輯技術(shù)已經(jīng)開始嶄露頭角，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。該文將從基因編輯技術(shù)的發(fā)展、植物細(xì)胞器基因組的結(jié)構(gòu)和特點、線粒體基因編輯和葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化等方面進(jìn)行總結(jié)，并對植物細(xì)胞器基因編輯的研究前景進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：基因編輯，TALENs，細(xì)胞器基因組，線粒體基因編輯，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）10-1654-11

Abstract：Gene editing，also known as genome editing or genome engineering，is a technique that introduces mutations in DNA sequences in the form of insertion，deletion，or base substitution. There are many types of gene editing techniques，such as zinc-finger nucleases （ZFNs），transcription activator-like effector nucleases （TALENs） and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9（CRISPR/Cas9）. CRISPR/Cas9 has developed rapidly in recent years. The emergence of gene editing techniques has accelerated the development of plant functional genomics and has great potential in precision crop breeding. Plant organelle gene editing mainly refers to editing plant mitochondrial and chloroplast genomes. Plant mitochondrion and chloroplast are often referred to as the “power house” and “production workshop”，respectively，due to their importance in central metabolic functions. Editing mitochondrial and chloroplast genomes will improve the understanding of the genetic function of these genomes and develop their applications in crop improvement and industrial production. At present，organelle gene editing techniques have emerged and have a very broad application prospect. In this review，we summarized the development of gene editing techniques，structures and characteristics of plant organelle genomes，mitochondrial gene editing，and chloroplast genetic transformation，and finally we proposed the future research directions and prospects of organelle gene editing.

Key words：gene editing，TALENs，organelle genome，mitochondrial gene editing，chloroplast genetic transformation

植物細(xì)胞內(nèi)擁有三套獨立的基因組——細(xì)胞核基因組、線粒體基因組和葉綠體基因組（圖1）。除去擁有巨大遺傳信息的細(xì)胞核之外，線粒體和葉綠體是植物細(xì)胞中具有雙膜系統(tǒng)的細(xì)胞器，它們的發(fā)育和增殖是受細(xì)胞核基因組及其自身基因組兩套遺傳系統(tǒng)的控制，稱為半自主性細(xì)胞器。細(xì)胞核與線粒體和葉綠體之間存在著密切的、精準(zhǔn)的和嚴(yán)格調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制。線粒體和葉綠體分別作為細(xì)胞中有氧呼吸和光合作用的場所，對細(xì)胞生命活動的正常進(jìn)行至關(guān)重要。因此，了解它們的基因功能和生命過程機(jī)制，如復(fù)制、遺傳、基因表達(dá)和基因組維持等對于進(jìn)一步探索植物生命活動的奧秘和作物遺傳改良等研究意義重大（Kazama et al.，2019）。近年來，利用基因編輯技術(shù)對植物細(xì)胞核基因組的修飾取得了顯著的進(jìn)展，已經(jīng)成功應(yīng)用在擬南芥、煙草、水稻、玉米、棉花、小麥、油菜、大豆、高粱、西瓜、葡萄、蘋果、香蕉、橙子、西紅柿、牽?；ā⑷n苣、木薯等眾多植物中，并取得了相應(yīng)的研究成果（Manghwar et al.，2019）。而植物細(xì)胞器基因編輯方面的研究卻相對緩慢，目前僅在水稻、油菜、擬南芥、煙草、萵苣等植物中有相關(guān)報道。細(xì)胞器基因編輯技術(shù)的發(fā)展雖然面臨許多嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，但是在近幾年取得了一些技術(shù)上的突破。本文將對植物細(xì)胞器基因編輯研究進(jìn)展進(jìn)行全面的綜述。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

1.1 ZFNs基因編輯技術(shù)

ZFNs是第一代基因編輯技術(shù)，是由鋅指蛋白的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與FokI內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域融合而成的限制性內(nèi)切酶（圖2：A）（Carroll，2011）。鋅指（zinc-finger，ZF）是一種DNA結(jié)合基序，在許多識別DNA真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域發(fā)現(xiàn)它的存在（Khalil，2020）。FokI是源于細(xì)菌的ⅡS限制性內(nèi)切酶（Li et al.，1992），其剪切結(jié)構(gòu)域并沒有明顯的序列特異性（Carroll，2011）。當(dāng)DNA結(jié)合域和DNA剪切域融合在一起時，就會形成一對高度特異性的“分子剪刀”而造成DNA序列的雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。而造成的DSB 通常是通過同源介導(dǎo)的修復(fù)（homology-directed repair，HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的方式進(jìn)行修復(fù)，由于修復(fù)過程容易發(fā)生錯誤進(jìn)而導(dǎo)致基因突變的發(fā)生。

最常用的鋅指結(jié)構(gòu)是一組Cys2His2鋅指，該結(jié)構(gòu)中每30個左右的氨基酸結(jié)合一個鋅原子，鋅指DNA結(jié)合域通常包含3個獨立的鋅指結(jié)構(gòu)，每個鋅指結(jié)構(gòu)能識別3個堿基，即一個鋅指結(jié)構(gòu)域能識別9 bp長度的DNA特異性序列（Carroll，2011）。由于FokI只有形成二聚體時才能行使剪切作用（Smith et al.，2000），所以一對ZFNs包括6個鋅指結(jié)構(gòu)，可以識別18 bp長的DNA特異性序列（Carroll，2011）。有研究表明，增加鋅指的數(shù)量可以提高ZFNs的特異性和效率并改善靶向性，對鋅指的定制組裝可以靶向不同的DNA序列（Khalil，2020）。在農(nóng)作物中，ZFNs誘導(dǎo)內(nèi)源基因突變的第一個例子是在玉米細(xì)胞中，通過表達(dá)工程化的ZFNs靶向插入破壞玉米的IPK1基因，產(chǎn)生具有除草劑抗性和在種子發(fā)育過程中具有預(yù)期肌醇磷酸鹽分布變化的基因編輯玉米植株（Shukla et al.，2009）。此外，對大豆（Curtin et al.，2011）、油菜、水稻、番茄、蘋果和無花果（Peer et al.，2015）

及雜合楊樹（Lu et al.，2016）等多個重要經(jīng)濟(jì)植物的細(xì)胞核基因也實現(xiàn)了定向突變。Bonawitz et al.（2019）利用ZFNs編輯技術(shù)通過NHEJ介導(dǎo)的多基因靶向插入獲得了可育的轉(zhuǎn)基因大豆植株。

1.2 TALENs基因編輯技術(shù)

TALENs是繼ZFNs之后的第二代基因編輯技術(shù)，與ZFNs有許多相似之處：（1）TALENs也是一種人工限制性內(nèi)切酶;（2）DNA結(jié)合域同樣由多個模塊組成;（3）也包含有FokI限制性內(nèi)切酶。典型的TALENs系統(tǒng)是由N端的核定位信號（nuclear localization signal，NLS）、中間可識別并結(jié)合特異性DNA序列的TALE串聯(lián)重復(fù)，以及C端FokI核酸組成（圖2：B）（Khalil，2020）。TALE是由一種植物病原菌——黃單胞桿菌（Xanthomonas spp.）分泌產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)（Gaj et al.，2013）。TALE的DNA識別結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一段長的串聯(lián)重復(fù)序列，可以特異地識別并結(jié)合特異DNA序列。每個重復(fù)序列含有33～35個氨基酸殘基，其中的第12位和第13位的氨基酸殘基是識別特異DNA堿基的靶向關(guān)鍵位點，該位點隨DNA序列的變化而變化，稱作重復(fù)可變雙殘基（repeat variant diresidue，RVD），其他位置的氨基酸殘基相對固定不變（Khalil，2020）。每個RVD都與一個特定的核苷酸結(jié)合：HD = C，NG = T，NI = A和NN = G（Khalil，2020）。重復(fù)單元經(jīng)串聯(lián)組裝以后，就可以特異地識別一段DNA序列。根據(jù)這個原理，可以利用TALENs技術(shù)對植物基因進(jìn)行定向特異性編輯。如Shinoyama et al.（2020）利用TALENs介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)敲除菊花DMC1基因獲得雌雄不育的菊花植株，這種產(chǎn)生完全不育植株的策略可廣泛應(yīng)用于防止轉(zhuǎn)基因植株向野生近緣植物流動。TALENs比ZFNs對靶基因更具有序列特異性，更易于產(chǎn)生DSB和更小的細(xì)胞毒性，因此應(yīng)用也更加廣泛（Huo et al.，2019）。

1.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種RNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，能對目標(biāo)基因進(jìn)行精確性的敲除、敲入、替換等，以實現(xiàn)探究基因功能、修復(fù)致病基因等目的（Gao，2021）。該技術(shù)憑借操作簡便、價格低廉、可對基因位點進(jìn)行編輯、可拓展性強(qiáng)等優(yōu)勢，在近幾年迅速發(fā)展完善，成為繼ZFNs和TALENs之后迅速發(fā)展起來的第三大基因編輯技術(shù)。瑞典皇家科學(xué)院將“2020年的諾貝爾化學(xué)獎”頒發(fā)給了開發(fā)出CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的兩位女科學(xué)家Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna，可見CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)對于科學(xué)研究的巨大意義。

CRISPR/Cas9同樣是一種人工核酸內(nèi)切酶，其系統(tǒng)的主要組成部分包括DNA切割酶Cas9，由反式激活的crRNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）合成的向?qū)NA（sgRNA），以及PAM序列（protospacer adjacent motif）（NGG）（圖2：C）（Jinek et al.，2012）。sgRNA向?qū)蛄校?0 nt）靶向目的基因片段，招募Cas9蛋白的結(jié)合，在PAM上游的目標(biāo)序列三個核苷酸處生成位點特異性DSB（Penewit et al.，2018）。這些DSB導(dǎo)致宿主細(xì)胞中DNA修復(fù)系統(tǒng)的激活，通常通過NHEJ途徑進(jìn)行修復(fù)，由于修復(fù)路徑容易出錯，因此在修復(fù)過程中將引入小的缺失或插入，從而產(chǎn)生突變（Voytas，2013）。CRISPR/Cas9技術(shù)的一些創(chuàng)造性和獨特的CRISPR設(shè)計使該系統(tǒng)成為許多研究者用來操作基因的工具，已被廣泛應(yīng)用于水稻、棉花、高粱、玉米、小麥等植物的位點特異性誘變。例如最近的一項研究：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國家植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中心首次通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得谷子單倍體誘導(dǎo)系（Cheng et al.，2021），開啟谷子育種的新方向。

2 植物細(xì)胞器基因組的結(jié)構(gòu)及特點

線粒體和葉綠體是植物細(xì)胞中僅有的兩個具有獨立遺傳基因組的細(xì)胞器，它們的結(jié)構(gòu)和功能受到細(xì)胞核基因組及自身基因組兩套遺傳系統(tǒng)的控制，稱為半自主性細(xì)胞器。

2.1 線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和特點

線粒體是生物進(jìn)行呼吸代謝，為生命活動提供能量的細(xì)胞器。不同生物的不同組織中線粒體數(shù)量的差異是巨大的。一般來說，細(xì)胞中線粒體數(shù)量取決于該細(xì)胞的代謝水平，代謝活動越旺盛的細(xì)胞中線粒體含量越多。一個細(xì)胞內(nèi)有許多個線粒體，每個線粒體有幾十至上百份基因組拷貝，所以一個細(xì)胞內(nèi)有多個線粒體基因組。不同物種的線粒體基因組相差懸殊（Sloan et al.，2012;Gualberto & Newton，2017）。大部分植物線粒體基因組由不同大小、不同比例的環(huán)狀DNA分子和線性DNA分子組成（Gualberto & Newton，2017）。陸地植物的線粒體基因組大?。?08 kb～11 Mb）不一，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于動物的線粒體基因組（15～17 kb）（Sloan et al.，2012;Gualberto & Newton，2017）。線粒體基因組存在大量的重復(fù)序列，根據(jù)長度大小通常分為長重復(fù)序列（>500 bp）、中間重復(fù)序列（50～500 bp）和短重復(fù)序列（<50 bp）三種類型（Gualberto & Newton，2017）。大量重復(fù)序列的存在容易造成基因組重組或重排，導(dǎo)致線粒體基因組結(jié)構(gòu)的變化。盡管植物線粒體基因組的大小和基因順序有很大的差異，但是線粒體基因的數(shù)目相對保守（Small et al.，2013）。在陸生植物如被子植物、裸子植物（Sloan et al.，2012）、蕨類（Grewe et al.，2014）、石松類（Park et al.，2020）、角苔類（Gualberto & Newton，2017）、苔類（Guo et al.，2017）、蘚類中，已知有30～70個基因被發(fā)現(xiàn)（Small et al.，2020）。這些基因編碼rRNAs，tRNAs，核糖體蛋白，呼吸復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的各個亞基，ATP合酶的亞基和細(xì)胞色素C發(fā)生因子（CCM）等成分（Small et al.，2020）。一些線粒體基因可能來自葉綠體或者細(xì)胞核，也可能在進(jìn)化過程中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，這種現(xiàn)象稱之為基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）或基因橫向轉(zhuǎn)移（lateral gene transfer，LGT）（Gao et al.，2014; Wu et al.，2017）。這種現(xiàn)象是編碼基因數(shù)量在不同植物物種中差異的主要原因。例如，無油樟的線粒體含有超過250個編碼基因，這可能就是進(jìn)化過程中基因水平轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的（Rice et al.，2013），以及被子植物中葉綠體基因轉(zhuǎn)移到線粒體基因組中（Sloan & Wu，2014）。此外，線粒體基因組也可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核基因組中，如擬南芥的細(xì)胞核基因組中存在線粒體假基因（nuclear-encoded mitochondrial DNA sequences，NUMTs）的現(xiàn)象（Arimura et al.，2020）。

2.2 葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和特點

葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的場所。細(xì)胞中葉綠體基因組有多種構(gòu)型，最常見的結(jié)構(gòu)是雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括一個小的單拷貝區(qū)（SSC）和一個大的單拷貝區(qū)（LSC），這兩個區(qū)域被一對反向重復(fù)區(qū)域（IRa，IRb）分開，形成典型的四分體結(jié)構(gòu)，其基因組大小變化范圍為120～160 kb（Hong et al.，2020）。與線粒體或細(xì)胞核基因組相比，植物葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)、基因數(shù)量和基因組成上具有更高的保守性，進(jìn)化速度相對適中，介于核基因組和線粒體基因組之間，其自身缺少重組，有較小的基因組大小和高拷貝數(shù)。鑒于之前已有很多關(guān)于葉綠體基因組的綜述報道，這里就不做詳細(xì)的贅述。

3 線粒體基因編輯研究進(jìn)展

在陸生植物中，盡管細(xì)胞核基因組的編輯修飾已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是線粒體基因組的遺傳轉(zhuǎn)化仍然進(jìn)展緩慢（Kazama et al.，2019）。從結(jié)構(gòu)上來說，植物線粒體基因組比動物線粒體基因組更大、更復(fù)雜（Small，2013;Gualberto & Newton，2017）。特別是在維管植物中，由于重復(fù)序列之間的活躍重組，即使在同一種植物中線粒體基因的順序也會發(fā)生變化。盡管人們對陸地植物線粒體基因組序列了解甚多（Kubo & Newton，2008;Knoop，2013），但是由于缺乏穩(wěn)定的線粒體轉(zhuǎn)化方法，對植物線粒體基因組詳細(xì)和直接的分子分析一直受到限制。同時，不能將gRNA遞送到線粒體，阻礙了線粒體DNA（mtDNA）的編輯。因此，迄今為止，對mtDNA的操作僅限于通過設(shè)計核酸酶對線粒體基因的靶向突變。

3.1 mitoTALENs與mito-cTALEN介導(dǎo)的線粒體基因編輯

mitoTALENs線粒體基因編輯技術(shù)是直接在TALENs的N端加上一個線粒體定位信號（mitochondrial targeting signal，MTS），用來對線粒體基因組進(jìn)行基因編輯（Kazama et al.，2019）?；赥ALENs基因編輯的方法通常需要兩個蛋白質(zhì)，但有研究者對TALENs技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)使得使用單一蛋白質(zhì)成為可能，稱為“compact TALEN”（cTALEN）（Kazama et al.，2019）。在cTALEN的N端加了一個線粒體定位信號得到mito-cTALEN，可實現(xiàn)對線粒體DNA的編輯。I-TevI（Mueller et al.，1995;Edgell et al.，2004）是GIY-YIG家族的歸巢內(nèi)切酶成員，呈現(xiàn)出三部分蛋白布局。I-TevI的C端區(qū)域負(fù)責(zé)DNA結(jié)合的特異性以及大部分蛋白質(zhì)與DNA的相互作用親和力，一種連接體連接并調(diào)節(jié)N端催化結(jié)構(gòu)域（Dean et al.，2002）。野生型I-TevI的N端融合到TALE的DNA結(jié)合骨架的N端或C端（Beurdeley et al.，2013）。用TALE-ΔN152/ΔC220支架取代I-TevI 的C端DNA結(jié)合域，從而保留野生型I-TevI的天然N-C端布局，最終生成融合cTALEN（圖3）（Beurdeley et al.，2013）。

通過對靶基因靶點的選擇設(shè)計合成TALE陣列，進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)載體。功能元件在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞質(zhì)中翻譯出MTS-TALE-FokI蛋白復(fù)合體，在線粒體導(dǎo)肽的作用下定位進(jìn)入到線粒體中，TALE 中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向目的基因，F(xiàn)okI核酸酶形成二聚體后對目的基因進(jìn)行切割，主要通過同源重組修復(fù)，修復(fù)過程中造成基因大片段缺失，最終導(dǎo)致基因破壞失去功能，達(dá)到基因敲除的目的。

在植物中，一種被稱為細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）的雄性不育系通常表現(xiàn)為花粉敗育和結(jié)實率為零，在農(nóng)業(yè)上經(jīng)常被用于生產(chǎn)F1雜交種子（Kazama et al.，2019）。一般來說，CMS被認(rèn)為是由線粒體基因引起的（Hanson & Bentolila，2004）。敲除典型線粒體基因可能是致命的或引起不利的表型變化，但敲除CMS植物中的一個CMS相關(guān)基因有望在不引起其他表型變化的情況下恢復(fù)育性（Kazama et al.，2019）。2019年，日本東京大學(xué)的一個科研團(tuán)隊同時以水稻BoroTaichung 型CMS材料（BTA）和油菜Kosena型CMS材料（SW18）作為研究對象，分別利用mito-cTALEN和mitoTALENs線粒體基因編輯技術(shù)對BTA中的線粒體基因orf79和SW18中的線粒體基因orf125進(jìn)行基因編輯（Kazama et al.，2019）。該研究結(jié)果顯示，被成功敲除CMS基因的株系花粉恢復(fù)了育性——自交產(chǎn)生了種子（Kazama et al.，2019）。這是對植物線粒體基因組穩(wěn)定和可遺傳靶向基因修飾的首次報道，是植物線粒體基因組編輯的重要突破性研究進(jìn)展，具有重要意義（Arimura et al.，2020）。隨后，該團(tuán)隊又在2020年利用mitoTALENs技術(shù)分別對擬南芥線粒體基因組中ATP合成酶亞基6基因—atp6-1和atp6-2進(jìn)行了基因編輯，這兩個基因分別被成功刪除，驗證了mitoTALENs技術(shù)在植物線粒體基因編輯中應(yīng)用的廣泛性。作者同時也比較了mitoTALENs和mito-cTALEN兩種技術(shù)對線粒體基因的編輯效果，研究表明，mitoTALENs的編輯效率更好（Arimura et al.，2020）。

3.2 DdCBEs介導(dǎo)的線粒體基因編輯

上述兩種編輯技術(shù)都能夠進(jìn)入線粒體發(fā)揮基因編輯的作用，但不能引起mtDNA中特定核苷酸的變化，這些系統(tǒng)是通過將攜帶的突變mtDNA直接降解來消除突變，會使得mtDNA拷貝數(shù)降低，而線粒體拷貝數(shù)的降低可能會在實際疾病治療中帶來更多的風(fēng)險。2020年，哈佛大學(xué)David R. Liu團(tuán)隊利用一種細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶毒素——DddA分開的兩部分與TALE陣列蛋白和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）融合產(chǎn)生了無RNA（無CRISPR）的DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器（DddA-derived cytosine base editor，DdCBE），實現(xiàn)了催化人mtDNA中C·G-T·A的轉(zhuǎn)換，具有高的靶標(biāo)特異性和產(chǎn)物純度（Mok et al.，2020）。研究者使用DdCBEs來模擬人類細(xì)胞中與疾病相關(guān)的mtDNA突變，導(dǎo)致呼吸速率和氧化磷酸化的變化（Mok et al.，2020）。無CRISPR的DdCBEs可以精確地操縱mtDNA，而不是通過靶向核酸酶切割mtDNA來消除mtDNA拷貝，這對線粒體疾病的研究和潛在的治療具有廣泛的意義。

DddA是SCP1.201-like家族的一種細(xì)菌脫氨酶毒素，優(yōu)先作用于dsDNA，因此被命名為雙鏈DNA脫氨酶毒素A，或DddA（Mok et al.，2020）。DddA含有一個毒性結(jié)構(gòu)域DddAtox，完整地表達(dá)DddA蛋白對人體細(xì)胞有毒害作用，為了避免這種毒性，研究者將蛋白質(zhì)分成兩個不活躍的部分，這兩部分只有在相鄰的目標(biāo)DNA上組裝時才能重新形成脫氨活性，類似于在ZFNs和TALENs中組裝FokI單體來重新形成dsDNA核酸酶活性（Mok et al.，2020）。為了利用DddA的脫氨酶作用實現(xiàn)線粒體基因組的精準(zhǔn)編輯，研究者將分開的DddA與TALE融合進(jìn)行線粒體堿基編輯，形成N端到C端的“MTS-mitoTALE-split-DddAtox”連接結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)mtDNA上胞嘧啶C脫氨基變成尿嘧啶U（Mok et al.，2020）。然而，由于U是組成RNA的堿基，一旦DNA中出現(xiàn)了U，其就會在尿嘧啶糖基化酶的作用下重新轉(zhuǎn)變成C，因此就相當(dāng)于該編輯器對線粒體中DNA單堿基的替換無意義。為了防止這一現(xiàn)象的發(fā)生，研究者巧妙地在上述構(gòu)建的堿基編輯器的C端連接了UGI（Nilsen et al.，1997;Komor et al.，2017;Fuentes et al.，2018），最終形成“MTS-mitoTALE-split-DddAtox-UGI”結(jié)構(gòu)（圖4）。這樣就可以保護(hù)U免受糖基化酶的干擾，一直以尿嘧啶的形式存在直到下一輪DNA復(fù)制或修復(fù)發(fā)生為止，此時互補(bǔ)鏈的鳥嘌呤G（在編輯前與C配對）被腺嘌呤A取代，實現(xiàn)C·G-T·A的轉(zhuǎn)換（Mok et al.，2020）。UGI的加入使編輯效率提高了3～10倍，從而最終獲得了可實現(xiàn)mtDNA中堿基C-T高效特異性轉(zhuǎn)換的胞苷單堿基編輯器DdCBEs（Mok et al.，2020）。為了探究DdCBEs在mtDNA編輯中的普遍性，研究者靶向了5個線粒體基因：MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4、MT-ND5和MT-ATP8，證實了在HEK293T細(xì)胞中mtDNA編輯的持久性超過18 d，典型效率在5%～50%之間（Mok et al.，2020）。mtDNA編輯不會降低細(xì)胞活力，不會產(chǎn)生大量mtDNA刪除，也不會干擾mtDNA拷貝數(shù)（Mok et al.，2020）。該研究成果是開發(fā)針對mtDNA疾病的基因療法的重要進(jìn)展。此外，通過使用該工具實驗性地改變線粒體基因組，可以更好地了解mtDNA突變與復(fù)雜疾病、癌癥和年齡相關(guān)的細(xì)胞功能障礙的相關(guān)性。

最近，Arimura團(tuán)隊利用DdCBEs堿基編輯技術(shù)靶向擬南芥質(zhì)體基因組中16S rRNA、rpoC1和psbA三個基因，特異性地在擬南芥質(zhì)體基因組的靶向窗口中引入同源C-T突變且突變能夠穩(wěn)定遺傳給后代種子（Nakazato et al.，2021）。Kang et al.（2021）建立了Golden Gate克隆系統(tǒng)，共使用424個TALE子陣列質(zhì)粒和16個表達(dá)質(zhì)粒組裝DdCBE編碼的質(zhì)粒進(jìn)行植物細(xì)胞器堿基編輯。他們利用設(shè)計的DdCBEs分別先后對萵苣和油菜的葉綠體基因16S rRNA、psbA 和 psbB以及萵苣線粒體基因atp6和油菜線粒體基因rps14進(jìn)行了堿基編輯，在萵苣和油菜原生質(zhì)體中實現(xiàn)了高頻率的C-T轉(zhuǎn)換（Kang et al.，2021）。其DdCBEs在生菜或油菜愈傷組織中誘導(dǎo)堿基編輯頻率高達(dá)25%（線粒體）和38%（葉綠體），并且植物細(xì)胞器的編輯在細(xì)胞分裂和植物發(fā)育過程中得以維持（Kang et al.，2021）。Li et al.（2021）將DdCBEs應(yīng)用于水稻葉綠體基因編輯，選用一個編碼光合I系統(tǒng)的保守葉綠素基因psaA實現(xiàn)了水稻中C·G-T·A的轉(zhuǎn)換。

4 葉綠體的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

葉綠體的遺傳轉(zhuǎn)化是指將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞葉綠體基因組的過程。相對于線粒體，葉綠體的轉(zhuǎn)化技術(shù)較為成熟。與植物基因工程常用的常規(guī)核轉(zhuǎn)化技術(shù)相比，葉綠體轉(zhuǎn)化具有許多的優(yōu)勢（Jin & Daniell，2015;Fuentes et al.，2018）。在大多數(shù)高等植物中，由于葉綠體基因組的母系遺傳特性，使得葉綠體轉(zhuǎn)化在一定程度上成為可以遏制基因逃逸的基因技術(shù)，很少導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的異交（Daniell et al.，2021）。又因葉綠體基因組是以高拷貝的形式存在，葉綠體轉(zhuǎn)化可以通過在每個植物細(xì)胞中引入數(shù)千個外源基因的拷貝而導(dǎo)致異常高水平的蛋白質(zhì)生產(chǎn)（DeCosa et al.，2001），提高基因轉(zhuǎn)化效率。

如今，葉綠體基因組已被改造用于表達(dá)來自細(xì)菌、真菌、原生動物或人類基因組的外源基因，以進(jìn)行各種生物技術(shù)應(yīng)用（Daniell et al.，2021）。利用細(xì)菌調(diào)控序列表達(dá)了蘇云金芽孢桿菌的細(xì)菌操縱子，達(dá)到了已知的最高水平的Bt蛋白（DeCosa et al.，2001）。小的人類基因——胰島素，以很高的水平表達(dá)（可占葉片總蛋白的70%）（Ruhlman et al.，2010;Boyhan & Daniell，2011）。對CTB-FVIII-LC基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使得最大的人血蛋白（FVIII，185 kDa單體）在葉綠體中成功表達(dá)（Kwon et al.，2018），目前已推進(jìn)商業(yè)化生產(chǎn)和臨床試驗。密碼子優(yōu)化的ACE2現(xiàn)已在臨床上經(jīng)過測試，可治療COVID-19患者（Daniell，2020）。PhylloZyme最近推出了幾種在葉中制成并在葉綠體中表達(dá)的酶產(chǎn)品，以取代價格昂貴的微生物酶工藝（Daniell et al.，2019a，b; Kumari et al.，2019）。大多數(shù)葉片酶在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)作為粗葉提取物起作用而不需要純化，葉片酶可以在環(huán)境溫度下作為凍干植物細(xì)胞儲存幾個月甚至幾年，而不喪失酶活性（Daniell et al.，2021）。當(dāng)前，商業(yè)酶在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量二氧化碳排放而導(dǎo)致溫室效應(yīng)，用葉酶代替發(fā)酵制成的酶，除了防止釋放二氧化碳外，還可以捕獲二氧化碳，每產(chǎn)生1 kg酶或蛋白質(zhì)，凈捕獲680 kg二氧化碳，從而減少人為溫室氣體排放（Daniell et al.，2021）。萵苣葉綠體中表達(dá)的蛋白藥物（protein drugs，PDs）的口服給藥已被開發(fā)用于治療傳染性或遺傳性疾病，目前已進(jìn)入臨床階段（Daniell et al.，2021）。最近的進(jìn)展包括通過去除抗生素抗性基因在無標(biāo)記葉綠體基因組中表達(dá)PDs（Daniell，2020; Park et al.，2020），在cGMP設(shè)備中生產(chǎn)萵苣中表達(dá)的PDs（Daniell et al.，2019a; Daniell，2020; Park et al.，2020），通過毒理學(xué)和藥代動力學(xué)研究評估藥物（Daniell ，2020），以及最近FDA批準(zhǔn)通過口服花生細(xì)胞產(chǎn)生的PDs治療過敏（Tilles & Petroni，2018; Vickery et al.，2018）。在開發(fā)SARS-CoV-2疫苗或治療COVID-19患者的急性/致死性肺/心力衰竭下有所應(yīng)用（Daniell et al.，2021）。接下來，對葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的幾種方式進(jìn)行介紹。

4.1 基因槍介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)化

葉綠體轉(zhuǎn)化或者叫葉綠體基因工程，這一概念是由賓夕法尼亞大學(xué)的Daniell教授所開創(chuàng)的。Daniell通過康奈爾大學(xué)的John Sanford教授設(shè)計的一種生物微粒傳遞系統(tǒng)——基因槍，用葉綠體載體演示了第一個外來基因在葉綠體中的表達(dá)（Daniell et al.，1990），從而創(chuàng)造了最早的葉綠體基因工程專利?；驑尲夹g(shù)的基本原理就是采用一種微粒加速裝置，使裹著外源基因的微米級的金或鎢顆粒獲得足夠的動量打入靶細(xì)胞或組織。到目前為止，基因槍轉(zhuǎn)化仍然是葉綠體轉(zhuǎn)化領(lǐng)域應(yīng)用最多、最有效的方法（劉佳音等，2020）。

Goldschmidt-Clermont（1991）引入了第一個葉綠體選擇標(biāo)記基因——aadA基因，隨后將其用于轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組和大多數(shù)其他農(nóng)作物。而絕大多數(shù)轉(zhuǎn)葉綠體研究使用的是Daniell在1986年構(gòu)建的第一個葉綠體DNA載體中引入的psbA調(diào)控序列（Daniell et al.，2016a，b，2021），基于植物葉綠體進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化對于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究都有著很大的便利。然而，在主要作物和模式植物中應(yīng)用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)還很困難，目前大多數(shù)的植物物種都不能進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)基因，因此該技術(shù)的應(yīng)用大大受到了局限。2019年，德國馬普分子植物生理研究所開發(fā)了一個高效的擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)，該技術(shù)通過基因槍轉(zhuǎn)化方法對來自于根的微愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)敲除一個核等位基因，增強(qiáng)植株對于篩選藥劑的敏感性以用于分離轉(zhuǎn)基因植株，該方法能夠高頻生產(chǎn)可育的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化植株（Ruf et al.，2019）。

4.2 PEG介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)化

聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)化比基因槍方法要便宜很多。1993年首次報道了利用PEG法實現(xiàn)在煙草葉綠體中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化（Díaz & Koop，2014）。PEG介導(dǎo)葉綠體轉(zhuǎn)化的原理：除去細(xì)胞壁的植物細(xì)胞原生質(zhì)體在 PEG 的作用下細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)，原生質(zhì)體縮水，在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆破壞前去除 PEG，則細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)將恢復(fù)原來的狀態(tài)，外源DNA 在這一過程中有機(jī)會進(jìn)入植物細(xì)胞以及葉綠體中，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化（劉佳音等，2020）。PEG介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)化方法的成功依賴于良好的原生質(zhì)體再生方案。由于葉綠體的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化是建立在同源重組的基礎(chǔ)上的，因此轉(zhuǎn)基因的兩翼必須有葉綠體序列，以確保轉(zhuǎn)基因整合到葉綠體的特定區(qū)域（劉佳音等，2020）。PEG介導(dǎo)葉綠體轉(zhuǎn)化在煙草（O’Neill et al.，1993）、番茄（Nugent et al.，2005a）、花椰菜（Nugent et al.，2005b）和萵苣（Lelivelt et al.，2005）中均已實現(xiàn)。

4.3 納米材料介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)化

麻省理工學(xué)院化學(xué)工程教授 Michael Strano 領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊開發(fā)了一種利用納米材料進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的新工具，利用單壁碳納米管選擇性地將質(zhì)粒DNA遞送至葉綠體內(nèi)，而無需額外設(shè)備或化學(xué)試劑（Kwak et al.，2019）。研究人員創(chuàng)造了由包裹著殼聚糖的碳納米管所組成的納米顆粒（chitosan-complexed single-walled carbon nanotubes，CS-SWNTs），帶負(fù)電荷的 DNA 可與帶正電荷的碳納米管松散地結(jié)合（Kwak et al.，2019）。將帶有DNA的納米顆粒注入植株葉片，一旦通過葉片氣孔進(jìn)入葉片內(nèi)部，納米顆粒就會穿過細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，之后穿過葉綠體的雙層膜（Kwak et al.，2019）。進(jìn)入葉綠體后，葉綠體的弱酸性環(huán)境就會促使 DNA 從納米顆粒中釋放出來。納米穿透能力主要由納米顆粒大小和表面電荷決定（Kwak et al.，2019）。為便于觀察，研究人員使用了黃色熒光蛋白YFP基因，大約 47% 的植物細(xì)胞產(chǎn)生了YFP（Kwak et al.，2019）。在成熟的芝麻菜、豆瓣菜、菠菜、煙草等植物和分離的擬南芥葉肉原生質(zhì)體中均實現(xiàn)了葉綠體靶向基因的傳遞和表達(dá)（Kwak et al.，2019）。選擇性納米顆粒介導(dǎo)的葉綠體轉(zhuǎn)基因平臺操作簡單、成本低廉，可應(yīng)用于不同品種的成熟植物，且不需要專門、昂貴的設(shè)備（Kwak et al.，2019）。同時，該研究提出的方法或可結(jié)合ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9技術(shù)用于精確的葉綠體基因組編輯（Kwak et al.，2019）。通過優(yōu)化該方法，可在作物物種中實現(xiàn)穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化，有助于作物改良和農(nóng)藝應(yīng)用。

5 總結(jié)與展望

隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，植物核基因組編輯取得了大量成果，在植物功能基因組學(xué)和作物遺傳改良等研究領(lǐng)域做出了巨大貢獻(xiàn)。而植物中的另外兩個基因組（線粒體基因組和葉綠體基因組）在基因編輯方面的研究進(jìn)展卻相對緩慢。在科研人員的不懈努力之下，近幾年在線粒體基因組編輯和葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化方面都取得了一些新的突破。2019年，日本東京大學(xué)實驗室分別利用mitoTALENs和mito-cTALEN編輯技術(shù)編輯水稻和油菜線粒體中CMS相關(guān)基因，首次實現(xiàn)了植物線粒體基因組穩(wěn)定和可遺傳靶向基因修飾（Kazama et al.，2019）。接著，該實驗室又利用mitoTALENs技術(shù)靶向擬南芥線粒體基因成功實現(xiàn)線粒體基因編輯（Arimura et al.，2020）。2020年，David R. Liu團(tuán)隊開發(fā)出新的線粒體基因編輯工具——DdCBEs技術(shù)，該技術(shù)利用細(xì)菌毒素在HEK293T細(xì)胞的mtDNA中引入特定核苷酸，實現(xiàn)了線粒體基因的精準(zhǔn)編輯，這對人類mtDNA 突變引起的線粒體遺傳疾病的研究和治療意義重大（Mok et al.，2020）。與mitoTALENs技術(shù)相比，基因編輯器 DdCBEs 不降低細(xì)胞活力，不產(chǎn)生 mtDNA 缺失，不改變 mtDNA 拷貝數(shù)，展示了優(yōu)秀的安全性和巨大的應(yīng)用前景。最近，科研工作者們已經(jīng)成功將DdCBEs技術(shù)用于擬南芥、萵苣、油菜和水稻的線粒體和葉綠體的基因組編輯，有效實現(xiàn)了目標(biāo)基因C·G-T·A的轉(zhuǎn)換。盡管這些創(chuàng)新性的研究在細(xì)胞器編輯方面已取得了重要進(jìn)展，但是仍有許多挑戰(zhàn)需要克服，如需要有更高的編輯效率和種質(zhì)選擇能力以適應(yīng)多種植物的技術(shù)（Lee et al.，2021）。同時，ABEs堿基編輯技術(shù)在線粒體基因組的應(yīng)用以及如何突破CRISPR/Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)化線粒體基因組的瓶頸抑或是開發(fā)出其他新的轉(zhuǎn)化技術(shù)等，都需要研究者們進(jìn)行更多的思考與嘗試（Lee et al.，2021）。

相比于線粒體轉(zhuǎn)化，葉綠體轉(zhuǎn)化早在20世紀(jì)80年代就實現(xiàn)了，但技術(shù)上一直沒有很大的突破。目前，基因槍仍然是較為常用的轉(zhuǎn)化方法，但價格昂貴且效率不高;PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化耗時耗力又有物種和組織限制性，最近的突破就是利用納米材料進(jìn)行的葉綠體轉(zhuǎn)化。這個方法的主要優(yōu)點就是受物種影響小，研究人員在菠菜、西洋菜、煙草、芝麻菜和擬南芥中都進(jìn)行了測試。同時，這項技術(shù)不只限于碳納米管，還有可能擴(kuò)展到其他類型的納米材料。另外，由于該方法僅對葉綠體進(jìn)行操作，葉綠體是母系遺傳的，可以傳給后代，卻不會轉(zhuǎn)移到其他植物物種，這也是一大優(yōu)勢。同時，該研究提出的方法或可結(jié)合核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，用于葉綠體基因編輯。由于很多植物再生的外植體不是綠色組織，比如下胚軸、子葉柄、幼胚等，只含有前質(zhì)體或有色體，這些質(zhì)體和葉綠體在體積上，基因表達(dá)調(diào)控上都有很大差異，因此基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，很難將質(zhì)粒遞送到這些外植體中去，即使遞送進(jìn)去了，基因也很難正常表達(dá)。而目前主要的農(nóng)作物，例如水稻（成熟胚）、玉米、小麥（幼胚）、棉花（下胚軸）、油菜（下胚軸）做轉(zhuǎn)化時，外植體都不是綠色的。煙草、番茄、生菜這三個葉綠體轉(zhuǎn)化很成功的作物，都是用綠色葉片作為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，之后通過器官發(fā)生途徑獲得再生植株。因此，如何在不同植物中建立以葉片為外植體的再生系統(tǒng)是進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化的重要前提;同時開發(fā)在非綠色組織中高效表達(dá)的調(diào)控元件也是實現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。

雖然對細(xì)胞器基因編輯的研究困難重重，進(jìn)度緩慢，且研究者較少，但是事實上，與核基因組相比，線粒體和葉綠體基因組在進(jìn)行基因編輯時具有許多的優(yōu)勢。如葉綠體基因組作為插入基因載體的優(yōu)點：（1）葉綠體是母系遺傳，可以減少外源基因擴(kuò)散的風(fēng)險;（2）細(xì)胞中葉綠體拷貝數(shù)較高可使目的基因高水平表達(dá)獲得大量蛋白;（3）葉綠體基因結(jié)構(gòu)較簡單，可以實現(xiàn)目的基因較精確的定位在葉綠體基因組上等優(yōu)點。而線粒體參與植物生長過程中的許多重要環(huán)節(jié)，與植株育性等農(nóng)藝性狀有關(guān)。CMS相關(guān)基因存在于線粒體DNA上，對相關(guān)基因進(jìn)行編輯可以恢復(fù)植株育性用于作物育種。線粒體與核之間也具有緊密的聯(lián)系，研究線粒體基因可進(jìn)一步了解細(xì)胞內(nèi)及整個植株的生命活動機(jī)制。細(xì)胞器基因編輯具有很多的優(yōu)點，有巨大的研究價值和研究潛力。無論線粒體還是葉綠體，對其基因組的研究都需要更加完善的基因編輯技術(shù)，相信在不斷前行的步伐下，一定會取得更大的突破。

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（責(zé)任編輯 何永艷）