NOS3串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性與Hcy及冠心病的相關(guān)性分析

趙唱，賀欣

（1.阜新市中心醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 阜新 123000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)三科，遼寧 錦州 121000）

近年來，研究發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）和糖尿病、高血脂一樣，是心腦血管疾病的另一獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與CHD的關(guān)系受到臨床廣泛關(guān)注[1]。心血管疾病常常也與內(nèi)皮一氧化氮合成酶（NOS3）基因多態(tài)性相關(guān)。NOS3為一氧化氮（NO）合成途徑的關(guān)鍵酶，NO的生成受eNOS的影響，故心血管疾病的候選基因?yàn)閑NOS[2]。eNOS 基因多態(tài)性位點(diǎn)有多個(gè)[3]，人們意識(shí)到遺傳因素在冠心病的發(fā)病及發(fā)展中的重要作用[4]。本研究旨在探討NOS3 的基因串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）多態(tài)性與Hcy、冠心病的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年12月至2019年10月于本院住院和門診就診的經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影153 例患者為CHD 組，同時(shí)收集體檢志愿者149名作為對(duì)照組。冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：中華醫(yī)學(xué)會(huì)急性非ST段抬高型ACS診斷和治療指南及急性ST段抬高型心肌梗死診斷與治療指南中頒布的ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法 采集空腹12 h以上外周靜脈血置于EDTA 抗凝，血漿-80 ℃凍存待測(cè)Hcy，血細(xì)胞作提取DNA用。Hcy通過用酶循環(huán)法測(cè)定（上?？迫A卓越生化分析儀），檢測(cè)試劑批號(hào)：14030403（北京中生公司）。通過全自動(dòng)生化儀（BeckmanDXC800）測(cè)定血脂、腎功、血糖。

1.2.2 DNA檢測(cè)方法 試劑和儀器：采用人外周血DNA提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN 公司），提取人基因組DNA，采用Nano-Drop檢測(cè)基因組DNA濃度，基因組DNA置于-80 ℃貯存，應(yīng)用毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)NOS3 VNTR 基因多態(tài)性。PCR 引物為：上游5’-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3’，下游5’-TCTCT-TAGTGCTGTGGTCAC-3’。PCR體系為：基因組DNA模板100 ng，上下游引物各2 μL，2×PCR MIX 25 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)溫度設(shè)置如下：94℃變性8 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min，PCR 產(chǎn)物4 ℃貯存。PCR 產(chǎn)物采樣毛細(xì)管電泳檢測(cè)片段大小，出現(xiàn)420 bp DNA 片段提示為5 個(gè)重復(fù)序列的NOS34b 等位基因，出現(xiàn)393 bp DNA 片段則提示為4 個(gè)重復(fù)序列的NOS34a 等位基因。酶切體系為內(nèi)切酶1 μL，10×Hbuffer溶液2 μL，PCR 產(chǎn)物6 μL，加ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。37 ℃金屬浴酶切，酶切片段用毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用“±s”表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。基因型頻率的分布采用Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗(yàn)；采用二元Logisitic回歸模型分析等位基因OR值。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOS3 VNTR基因多態(tài)性對(duì)血漿Hcy的影響 302例受試者經(jīng)過PCR 和電泳，NOS3 VNTR 等位基因4b 可產(chǎn)生420 bp 的片段，其中有27 bp 重復(fù)，而等位基因4a 有一種393 bp 的片段，有4 次重復(fù)。因此，純合子4b/4b 和4a/4a 分別有一個(gè)420 bp 和393 bp 片段，雜合子4b/a 有420 bp 和393 bp 的片段，雜合子4b/a 有420 bp 和393 bp 的兩個(gè)片段。4a 等位基因在CHD 組中的頻率明顯高于對(duì)照組中的頻率[23.2%（71/306）vs.14.1%（42/298），P=0.003]，見表1。NOS3 基因多態(tài)性與Hardy-Wenberg 平衡相符合，具有群體代表性。NOS3 VNTR 依據(jù)基因型進(jìn)行分組，比較兩組人群中各基因型血漿Hcy 水平，對(duì)照組中，4a4a 基因型組血漿Hcy 水平（14.96±4.03）μmol/L，4a4b 基因型組血漿Hcy 水平為（13.68±4.06）μmol/L，4b4b 基因型組血漿Hcy 水平為（13.28±3.88）μmol/L，Hcy 水平在上述3 種基因型中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.718）。CHD 組中，4a4a 基因型組血漿Hcy 水平為（23.67±3.71）μmol/L，4a4b 基因型組血漿Hcy 水平為（18.51±4.60）μmol/L，4b4b 基因型組血漿Hcy 水平為（16.32±5.07）μmol/L，比較3 組基因型的Hcy 水平可知4a4a 基因型最高（P=0.002），見表2。在4a4a 基因型、4a4b基因型和4b4b基因型3組中的CHD組Hcy含量均顯著高于相應(yīng)基因型的對(duì)照組，見圖1。

表1 NOS3VNTR基因多態(tài)性Table 1 NOS3VNTR gene polymorphism

表2 NOS3 VNTR基因型比較Table 2 Comparison of NOS3 VNTR genotypes

圖1 3組不同基因型Hcy含量比較Figure 1 Comparison of Hcy content of three different genotypes

2.2 NOS3 VNTR 基因多態(tài)性對(duì)血漿CHD 的影響 NOS3 VNTR基因型中，①4b4b 在冠心病組中所占的比例為60.1%，遠(yuǎn)低于對(duì)照組的73.8%。②4a4b 在冠心病組中所占的比例為33.3%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組的24.2%。③4a4a 在冠心病組中所占的比例為6.5%，高于對(duì)照組中的2.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。④4a 等位基因在冠心病組中的比例為85.9%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組的76.8%。4a 等位基因頻率在上述兩組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見表3。

表3 NOS3各個(gè)基因型的分布Table 3 Distribution of NOS3 genotypes

使用NOS3 VNTR（4a/4b）的3種不同基因型作為獨(dú)立變量，以各基因座的野生型純合子為基準(zhǔn)，其他基因型為虛擬變量，擬合二元Logistic 回歸模型。4a4a 基因型增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[OR=1.772，95%CI（1.552～1.992），P＜0.05]，見圖2。

圖2 NOS3 VNTR風(fēng)險(xiǎn)與冠心病的關(guān)系Figure 2 The relationship between the risk of NOS3 VNTR and coronary heart disease

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制為NO系統(tǒng)的功能障礙使損傷內(nèi)皮受損，而這一過程有Hcy 的參與，NO 是由精氨酸在NOS3催化下生成的[5]。NOS 蛋白的功能及活性降低可使NO 合成減少，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。而NOS蛋白受NOS3基因不同部位突變的影響，有研究顯示，NOS3 基因的第4 個(gè)內(nèi)含子的4a4b位點(diǎn)與個(gè)體內(nèi)血清NOS3活性水平相關(guān)[6]。已有研究認(rèn)為，Hcy對(duì)eNOS活性和NO釋放有抑制作用[7]。NO含量可反應(yīng)患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能的冠脈血流速度儲(chǔ)備（CFVR）在慢性高同型半胱氨酸血癥（HHcy）患者血漿中顯著降低[8]。本研究顯示，在冠心病患者NOS3 VNTR3種基因型中，4a4a基因型與冠心病患者血漿Hcy水平呈正相關(guān)。在對(duì)照組中，血漿Hcy水平在NOS3 VNTR3種基因型中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因納入本研究的4a4a基因型病例數(shù)較少所致。本研究中對(duì)照組的結(jié)論與Dayal[9]一致。Thomas等[10]研究發(fā)現(xiàn)3種基因型個(gè)體呼出NO水平依次降低，其中4a4a呼出NO水平最低，4b4b 呼出NO 水平最高，故認(rèn)為eNOS 水平和細(xì)胞內(nèi)NO 合成效率受該位點(diǎn)影響，NO 減少受eNOS 表達(dá)下調(diào)影響。VNTR 4a4b位點(diǎn)位于eNOS3基因的第四內(nèi)含子區(qū)，通過比較CHD組和對(duì)照組可知，4a 等位基因頻率前者中明顯高于后者，與Wang 等[11]研究相符合，4a 基因位點(diǎn)與786C 位點(diǎn)存在連鎖不均衡，他們影響NOS3基因的轉(zhuǎn)錄效率。

大量研究結(jié)果表明，eNOS 可能與CHD的發(fā)病有關(guān)[12-13]。有報(bào)道稱，血漿NO 含量和具有4a 等位基因的人群有關(guān)，4a等位基因人群中NO含量低于無該等位基因人群。Wang等[11]首次通過病例對(duì)照研究提出4a等位基因與內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)。Li等[14]的一份無發(fā)表偏倚的Meta分析顯示，4a/4b突變體無顯著性相關(guān)。本研究經(jīng)過仔細(xì)分析各組可知4a4b位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示具有4a 等位基因和4a4a 基因型的人群更易患CHD，與既往國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相吻合。但也存在與上述不同的結(jié)論[15]，可能由于研究對(duì)象為不同種族[16]或者相同種族不同民族間存在的遺傳、生活方式、環(huán)境因素、飲食差異所造成的，由于NOS3基因多態(tài)性重要的臨床意義，故需要進(jìn)一步探索。

本研究仍有很多不足之處，僅涉及本地區(qū)人群基因類型，不包含其他地區(qū)及種群基因情況。下一步研究希望增加樣本量，以驗(yàn)證可靠性。