響應(yīng)曲面法優(yōu)化蒺藜中黃酮和皂苷的提取工藝*

張 劍，譚健聰，楊鈺蓉，張 博，韓 祿，劉春葉

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果實，在中國有著悠久的用藥歷史，歷代醫(yī)學(xué)家對其多有論述和應(yīng)用，目前為臨床常用藥，并被收載入中國藥典?，F(xiàn)代研究表明，蒺藜在心腦血管、抗氧化、抗衰老、改善性功能、治療皮膚病等方面具有重要作用[1-2]。蒺藜水溶性成分主要是黃酮、皂苷類，黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、清除自由基等多種生物活性[3-5]，蒺藜皂苷可以減少自由基的生成，促進(jìn)自由基的清除，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6-7]。蒺藜提取物可通過干擾花生四烯酸代謝調(diào)節(jié)血小板黏附、抗血小板凝集和抗氧化功能，對心血管疾病具有預(yù)防作用[8]。李明娟等[9]和Sharawy等[10]研究認(rèn)為，蒺藜提取物能夠顯著抑制動物的糖異生作用，同時顯著降低血清甘油三酯含量。因此，從蒺藜中高效、經(jīng)濟(jì)地提取黃酮和皂苷類成分，使蒺藜更廣泛地得到應(yīng)用顯得尤為重要。

現(xiàn)有的報道大多以蒺藜果為研究對象[11-13]，并且是以蒺藜中單一組分的提取作為研究目標(biāo)[14-17]，將黃酮和皂苷同時提取并比較蒺藜果和葉中含量的研究并不多見[5]。作者采用綜合評價較高的微波輔助法[11]對蒺藜中黃酮和皂苷同時提取，對比了蒺藜葉和果實中總黃酮和總皂苷的含量，通過響應(yīng)曲面法對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到蒺藜中總黃酮和皂苷的最佳提取條件，為蒺藜的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

蒺藜果實和葉：產(chǎn)自陜北，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室張寒副教授鑒定為蒺藜科植物蒺藜的果實和葉。

薯蕷皂苷：B21176-20mg，蘆丁：B20771-20mg，上海源葉生物科技有限公司；水為超純水；其余試劑均為分析純，市售。

電熱恒溫水浴鍋：HH-2，北京科偉永興儀器有限公司；電腦微波超聲波組合萃取儀：XH-300A，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；紫外分光光度計：UV762，上海佑科儀器儀表有限公司；循環(huán)水真空泵：SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

(1)黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[18]。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品14.7 mg，加適量甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用移液管精密吸取該溶液0、1、2、3、4、5和6 mL分別置于25 mL容量瓶中，加0.04 g/mL NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入0.1 g/mL Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入0.1 g/mL NaOH溶液10 mL，最后用水稀釋至刻度，搖勻放置15 min。在200～600 nm掃描標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長，在最大吸收波長處測量吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=17.75x+0.005 5，R2=0.998 6。

(2)皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[18]。精密稱取薯蕷皂苷9.1 mg，加甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，得薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取該溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 mL于7支具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑。在每支試管中精密加入高氯酸5 mL，密塞，于25 ℃水浴30 min。取出后立即放入冰水中冷卻，在300～500 nm掃描標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長，在最大吸收波長處測量其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=29.867x+0.038 1，R2=0.999 6。

1.2.2 蒺藜中總黃酮與總皂苷成分的提取方法及提取率比較

分別取蒺藜葉和果實飲片，粉碎，過孔徑380 μm篩[14]，分別用石油醚回流3 h脫脂，陰干，得供試品粉末，于密封袋中保存?zhèn)溆?。精密稱取供試品粉末1.00 g，加入乙醇靜置20 min后進(jìn)行微波提取，減壓過濾提取液，取濾液減壓蒸餾至干，使用甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，作待測液供黃酮和皂苷提取率測定，比較蒺藜葉和果實的提取率。

1.2.3 單因素實驗

以黃酮和皂苷提取率為考察指標(biāo)，在微波功率為300 W的條件下分別考察提取時間、提取溫度、m(提取液)∶m(原料)(以下簡稱液料比)、φ(乙醇)4個因素對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

在單因素實驗基礎(chǔ)上，確定自變量，分別以黃酮提取率和皂苷提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken實驗方法對實驗的提取溫度、提取時間、液料比和φ(乙醇)進(jìn)行四因素三水平實驗設(shè)計。數(shù)據(jù)處理采用Design Expert.V 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒺藜葉和果實活性成分提取率比較結(jié)果

蒺藜葉和果實活性成分提取率見表1。

表1 葉和果實提取率比較結(jié)果

由表1可知，蒺藜葉中活性成分提取率顯著高于果實活性成分提取率，故選擇蒺藜葉作為蒺藜活性成分提取工藝優(yōu)化的原料，擴(kuò)大中藥來源，可為藥材的選擇提供借鑒和參考。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取溫度為30 ℃，功率為300 W，液料比為30，φ(乙醇)=70%，靜置20 min后提取，設(shè)定提取時間分別為5、10、15、20、25、30和35 min，考察提取時間對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖1。

t/min圖1 微波時間對黃酮及皂苷提取率的影響

由圖1可知，在提取過程中，隨著時間的增加，黃酮和皂苷提取率逐漸增加，這是因為溶劑隨時間增長逐漸滲透到細(xì)胞內(nèi)部，直至皂苷和黃酮達(dá)到溶解平衡。在提取時間為25 min黃酮和皂苷的提取率達(dá)到最大值。時間繼續(xù)延長，提取率有所下降，這可能是由于時間過長導(dǎo)致過多雜質(zhì)也隨之析出，且目標(biāo)產(chǎn)物也容易分解，從而影響黃酮和皂苷的收率[18]。

2.2.2 提取溫度對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取時間為25 min，功率為300 W，液料比為30，φ(乙醇)=70%，靜置20 min后提取，設(shè)定提取溫度分別為30、40，50、60和70 ℃，考察提取溫度對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖2。

t/℃圖2 溫度對黃酮和皂苷提取率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，黃酮提取率逐漸升高，在60 ℃時提取率趨于穩(wěn)定；皂苷提取率先上升，60 ℃后有下降的趨勢。由此說明，提取溫度也不是越高越好，因為提取溫度過高可能導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的分解，提取率反而下降[19]。

2.2.3 液料比對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取時間為25 min，提取溫度為60 ℃，功率為300 W，φ(乙醇)=70%，設(shè)定液料比10～70，靜置20 min后提取，考察液料比對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖3。

液料比圖3 液料比對黃酮和皂苷提取率的影響

由圖3可知，液料比對黃酮和皂苷提取率影響較大，隨著液料比逐漸增大，黃酮和皂苷提取率有較大的提升，在液料比為50時趨于穩(wěn)定，若進(jìn)一步擴(kuò)大液料比不僅對黃酮和皂苷提取率貢獻(xiàn)意義不大，反而增加了提取成本。

2.2.4φ(乙醇)對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取時間為25 min，功率為300 W，液料比為50，提取溫度為60 ℃，靜置20 min后提取，設(shè)定φ(乙醇)=10%、30%、50%、70%和90%，考察φ(乙醇)對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖4。

φ(乙醇)/%圖4 φ(乙醇)對黃酮和皂苷提取率的影響

由圖4可知，隨著φ(乙醇)的升高，黃酮和皂苷提取率變化顯著，呈先升后降的趨勢，當(dāng)φ(乙醇)=70%，黃酮和皂苷提取率同時達(dá)到最大值。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

根據(jù)蒺藜黃酮和皂苷單因素提取結(jié)果，得蒺藜黃酮和皂苷提取率(Y1和Y2)為評價指標(biāo)，對微波提取時間(A)、微波提取溫度(B)、液料比(C)、φ(乙醇)(D)為主要影響因素，每個因素3個水平，Box-Behnken實驗設(shè)計的因素水平表見表2，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 蒺藜黃酮和皂苷提取實驗因素水平及編碼

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表

2.3.1 方差分析

分別對以黃酮和皂苷提取率為響應(yīng)值建立的回歸模型進(jìn)行方差分析，考察回歸模型的顯著性、重現(xiàn)性、擬合程度以及各因素對響應(yīng)值的影響情況。

(1)以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析結(jié)果見表4。

表4 以黃酮提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析1)

由表4可知，該模型P<0.000 1，表明模型達(dá)到高度顯著水平。失擬項P=0.067 3>0.05，表現(xiàn)為不顯著；校正確定系數(shù)R2=0.902 0，說明該模型能解釋90.20%的響應(yīng)值變化，擬合程度良好，能夠較好地反映微波提取時間，微波提取溫度，液料比和φ(乙醇)與蒺藜黃酮提取率的關(guān)系；模型響應(yīng)值的變異系數(shù)CV=5.90%，表明實驗操作重復(fù)性好(<10%)。因此可以用此模型對蒺藜黃酮提取進(jìn)行分析和預(yù)測，各因素對蒺藜黃酮提取率影響的大小順序為溫度>液料比>時間>φ(乙醇)。各因素對蒺藜黃酮提取率的交互影響不顯著。

(2)以皂苷提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析見表5。

表5 以皂苷提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析1)

由表5可見，該模型P=0.002 1，達(dá)到極顯著水平；失擬項P=0.004，表現(xiàn)為極顯著，說明實驗中存在誤差較大的失擬因素；校正確定系數(shù)R2=0.837 4，說明該模型能解釋83.74%的響應(yīng)值變化；變異系數(shù)CV=2.66%，說明該實驗重復(fù)性良好(<10%)；4個因素中，溫度、φ(乙醇)對響應(yīng)值影響極顯著，按影響大小排序為溫度>φ(乙醇)>液料比>時間；X1X2、X2X3、X3X4、X1X3、X1X4、X2X4的P值均大于0.1，說明各因素對響應(yīng)值的交互影響不顯著。

2.3.2 各因素交互作用分析

(1)以黃酮提取率為響應(yīng)值的響應(yīng)曲面分析。根據(jù)響應(yīng)面軟件可以得到各因素間對蒺藜中黃酮提取率的交互影響3D響應(yīng)面圖，見圖5～圖8。

圖5 溫度和時間交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

圖6 時間和液料比交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

圖7 φ(乙醇)和液料比交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

圖8 溫度和φ(乙醇)交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應(yīng)面圖

響應(yīng)面圖中越陡峭的一方，其對提取的影響越大。由圖5可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響大于提取時間的影響；由圖6可知，液料比的影響略大于提取時間的影響；由圖7可知，φ(乙醇)對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于液料比的影響；由圖8可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于φ(乙醇)的影響。由此可得，溫度對蒺藜中黃酮的提取率影響最大，其次是φ(乙醇)、液料比和提取時間，與方差分析得出的結(jié)論一致。

(2)以皂苷提取率為響應(yīng)值的響應(yīng)曲面分析。根據(jù)響應(yīng)面軟件可以得到各因素間對蒺藜中皂苷提取率的交互影響3D響應(yīng)面圖見圖9～圖12。

圖9 溫度和時間交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應(yīng)面圖

圖10 時間和液料比交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應(yīng)面圖

圖11 φ(乙醇)和液料比交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應(yīng)面圖

圖12 溫度和φ(乙醇)交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的等高線圖和3D響應(yīng)面圖

響應(yīng)面圖中越陡峭的一方，其對提取的影響越大。由圖9可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響大于提取時間的影響；由圖10可知，液料比的影響略大于提取時間的影響；由圖11可知，φ(乙醇)對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于液料比的影響；由圖12可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于φ(乙醇)的影響。由此可得，溫度對蒺藜中皂苷的提取率影響最大，其次是φ(乙醇)、液料比和提取時間，與方差分析得出的結(jié)論一致。

2.3.3 最佳條件預(yù)測與驗證

通過Design Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，得到最佳提取工藝為時間20.32 min，溫度70 ℃，液料比70，φ(乙醇)=69.88%。在此條件下，黃酮和皂苷提取率分別為0.71%、2.02%。平行進(jìn)行3組實驗對最佳工藝進(jìn)行驗證，為了便于操作，選取提取時間為20 min，φ(乙醇)=70%，溫度為70 ℃，液料比為70。結(jié)果表明，總黃酮的提取率分別為0.69%、0.71%、0.68%，平均值為0.69%；總皂苷提取率分別為1.99%、2.11%、1.98%，平均值為2.03%，與預(yù)測值基本吻合，說明預(yù)測模型可靠。

3 結(jié) 論

蒺藜葉中活性成分提取率顯著高于果實活性成分提取率；響應(yīng)曲面法不但可以對微波輔助提取蒺藜中黃酮和皂苷工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，還可以對最佳提取條件下的提取率進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測值與實際測量值吻合度較高。研究的最佳提取產(chǎn)率高于相關(guān)文獻(xiàn)報道[14,18]，由此表明，該方法能兼顧2種活性成分提取率的最大化，避免生產(chǎn)中的資源浪費(fèi)，對資源的合理開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義，也可為相關(guān)研究和工業(yè)化生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化提供借鑒和參考。