正交試驗(yàn)優(yōu)化桑葉中蛋白提取工藝

劉苗苗，史 銳，吳 鵬，叢龍嬌

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000)

桑葉為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥葉，味甘、苦，性寒，歸肝、肺經(jīng)?！吨袊?guó)藥典》記載桑葉藥材具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目的功效，主要用于治療風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等[1]，中醫(yī)稱之為“鐵扇子”，是常用的中藥材。桑葉中化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有N-糖化合物、蕓香苷、槲皮素、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、維生素及微量元素等多種活性成分，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗菌和抗病毒等藥理活性[2-4]。桑葉中蛋白含量較高，其干物質(zhì)中含有粗蛋白約29.83%[5]。隨著植物蛋白的藥用價(jià)值的逐步被植物蛋白發(fā)現(xiàn)，人們將更多的目光放在植物蛋白的深入研究上。因此對(duì)其的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藥材：桑葉于2019年7月采自于遼寧本溪的一棵野生桑樹，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國(guó)教授鑒定為?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉，采摘后的桑葉洗凈曬干后粉碎備用。

試劑：考馬斯 G-250(上海源葉生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；FW100高速萬能粉碎機(jī)；UV5100紫外可見-分光光度計(jì)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器。

2 方法

2.1 桑葉蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液制備 取牛血清白蛋白50 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，即得濃度為0.502 mg·mL-1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 線性關(guān)系考察 按文獻(xiàn)[6]方法配制考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，分別加水定容至2 mL，搖勻；再分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10 mL，振蕩，放置10 min。取空白溶液組進(jìn)行基準(zhǔn)校正后，于595 nm下測(cè)定吸光度(A)。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(mg/mL)為X軸，吸光度(A)為縱坐標(biāo)Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出線性回歸方程。

2.2 桑葉蛋白提取工藝的優(yōu)化研究

2.2.1 桑葉蛋白提取方法 先將桑葉洗凈除去雜質(zhì)，用55 ℃烘箱烘干，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，粉末過3號(hào)篩，按照一定料液比加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl提取溶劑，超聲波處理后用水浴鍋浸提，離心后取上清液，得到桑葉蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 單因素考察 (1)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)桑葉蛋白提取率的影響：精密稱取0.5 g桑葉粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的NaCl溶液為提取溶劑，按照1∶20的料液比在超聲功率為100 W，超聲溫度為40 ℃的條件下超聲處理20 min，40 ℃水浴浸提60 min，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)出A值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率。

(2)料液比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響：精密稱取0.5 g桑葉粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，分別按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的料液比加入提取溶劑，在超聲功率為100 W、超聲溫度為40 ℃的條件下超聲處理20 min，40 ℃水浴浸提60 min，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)出A值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率。

(3)超聲溫度對(duì)桑葉蛋白提取率的影響：精密稱取0.5 g桑葉粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，在超聲功率固定為100 W，超聲溫度分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的條件下超聲處理20 min，40 ℃水浴浸提60 min，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)出A值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率。

(4)超聲時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響：精密稱取0.5 g桑葉粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，在超聲功率為100 W，超聲溫度為40 ℃的條件下分別超聲處理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，40 ℃水浴浸提60 min，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)出A值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率。

(5)浸提溫度對(duì)桑葉蛋白提取率的影響：精密稱取0.5 g桑葉粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，在超聲功率為100 W，超聲溫度為40 ℃的條件下超聲處理20 min，分別在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的溫度下水浴浸提60 min，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)出A值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率。

(6)浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響：精密稱取0.5 g桑葉粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的NaCl溶液為提取溶劑，料液比為1∶30，在超聲功率為100 W，超聲溫度為40 ℃的條件下超聲處理20 min，在40 ℃水浴中分別浸提30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min，離心后取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)出A值，計(jì)算桑葉蛋白的提取率。

2.2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的考察結(jié)果，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)、浸提時(shí)間(D)4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率具有顯著性影響。為了進(jìn)一步研究4個(gè)因素對(duì)提取率的影響，優(yōu)選桑葉蛋白提取工藝，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9(34)安排試驗(yàn)，具體因素水平見表1。

表1 桑葉蛋白L9(34)因素水平提取工藝

2.3 桑葉樣品蛋白質(zhì)含量的計(jì)算

按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，得到不同提取方法所制備的桑葉蛋白溶液，從中取0.5 mL溶液，其余按照“2.1.2”項(xiàng)下條件操作，取空白溶液組進(jìn)行基準(zhǔn)校正后，于595 nm下測(cè)定吸光度。

2.4 桑葉蛋白提取率計(jì)算

根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的吸光度A求出蛋白質(zhì)濃度C(mg/mL)，桑葉蛋白提取率=(C×V/m)×100%，其中V為桑葉蛋白溶液的體積，m為提取所用桑葉樣品質(zhì)量(g)。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，以蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)為X軸，吸光度(A)為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)=2.161 4x+0.060 8(R2=0.993 6)。結(jié)果表明牛血清白蛋白在0.050 2～0.502 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

圖1 牛血清白蛋白曲線

3.2 桑葉蛋白提取單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 不同提取溶劑濃度對(duì)桑葉蛋白提取的影響 研究發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白質(zhì)都可以溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，而通過對(duì)植物葉蛋白提取進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，NaCl溶液是提取植物葉蛋白最常用的浸提劑，其鹽溶作用可以促進(jìn)蛋白的水解，同時(shí)稀鹽溶液中的鹽離子與蛋白質(zhì)結(jié)合可以保護(hù)蛋白質(zhì)不變性[7]。圖2顯示，NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，吸光度A值達(dá)到最高，為0.637。當(dāng)NaCl溶液濃度進(jìn)一步增加時(shí)，吸光度反而下降，原因可能是隨著鹽濃度的增加，核酸提取的量也增大，給桑葉蛋白的提取純化帶來困難[8]。故0.4% NaCl溶液為最適合提取桑葉蛋白的溶劑。

圖2 提取溶劑濃度對(duì)桑葉蛋白提取的影響

3.2.2 不同料液比對(duì)桑葉蛋白提取的影響 料液比是提取工藝中?？紤]的因素之一，在提取中不同料液比會(huì)影響溶液的黏度和濃度。料液比較小時(shí)，溶液黏度大，蛋白質(zhì)分子不易擴(kuò)散，提取率小；而料液比偏大時(shí)，由于濃度差變小，蛋白質(zhì)的提取反而更加困難，因此通過實(shí)驗(yàn)確定桑葉蛋白質(zhì)提取的最適料液比十分重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，吸光度值最高，達(dá)到0.743，因此選擇料液比為1∶30作為桑葉蛋白提取的最適條件。

圖3 料液比對(duì)桑葉蛋白提取的影響

3.2.3 不同超聲溫度對(duì)桑葉蛋白提取的影響 在關(guān)于蛋白質(zhì)的提取研究中，溫度一直是需要考慮的重要因素，本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取時(shí)超聲的溫度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖4。吸光度隨著溫度升高而增加，在40 ℃時(shí)達(dá)到最高值，為0.642，最后趨近于平穩(wěn)，相較于其他因素，超聲溫度對(duì)桑葉蛋白提取率無顯著影響，故設(shè)定超聲溫度40 ℃為提取桑葉蛋白的最適條件。

圖4 不同超聲溫度對(duì)桑葉蛋白提取的影響

3.2.4 不同超聲時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取的影響 本次實(shí)驗(yàn)中，超聲的功率設(shè)定為100 W不變，對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行考察。由圖5可知，在超聲30 min后吸光度值達(dá)到最高，為0.856，隨后逐漸下降，因此選擇超聲30 min作為提取桑葉蛋白的最適條件。

圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取的影響

3.2.5 不同浸提溫度對(duì)桑葉蛋白提取的影響 除了超聲溫度外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)浸提溫度進(jìn)行了考察。由圖6可知，當(dāng)浸提溫度為40 ℃時(shí)，吸光度值達(dá)到最高，為0.689。升高5 ℃后反而有下降現(xiàn)象，因此將浸提溫度設(shè)定為40 ℃，是桑葉蛋白提取的最適溫度。

圖6 不同浸提溫度對(duì)桑葉蛋白提取的影響

3.2.6 不同浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取的影響 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同浸提時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果如圖7。由圖7可知，隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度值有逐漸升高的現(xiàn)象，在60 min時(shí)到達(dá)最高值，A值為0.723，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，可能是由于浸提時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致溶液中的蛋白質(zhì)出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象，因此選擇浸提時(shí)間為60 min作為桑葉蛋白的最適提取條件。

圖7 不同浸提時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取的影響

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

按照上述設(shè)計(jì)的因素水平進(jìn)行提取測(cè)定，結(jié)果見表2。表中K值顯示，提取最優(yōu)的組合為A1B3C1D1，即桑葉蛋白提取的最優(yōu)工藝為NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，料液比1∶35(g/mL)，超聲時(shí)間25 min，浸提時(shí)間55 min。

3.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用上述最優(yōu)提取方法進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次，結(jié)果見表3。桑葉蛋白平均提取率為6.05%，RSD為1.29%，與正交表內(nèi)結(jié)果相比，確定此工藝為最優(yōu)提取工藝，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，含量高。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)確定的桑葉蛋白的最佳提取工藝為NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%，料液比1∶35(g/mL)，超聲時(shí)間25 min，浸提時(shí)間55 min。在此提取工藝下驗(yàn)證3次，得到桑葉蛋白提取率分別為5.94%、6.01%、6.03%，平均提取率為6.01%，RSD為1.29%。相較于以往的研究，正交試驗(yàn)法優(yōu)化得到的工藝可有效提高桑葉中蛋白質(zhì)的提取率，為后續(xù)該資源的合理應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 (n=3)

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果