化學(xué)品生物降解影響因素研究進(jìn)展

林春駿，劉濟(jì)寧，周林軍，石利利*，馮潔

1.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210044 2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042

化學(xué)品的大量生產(chǎn)、使用帶來(lái)很多環(huán)境污染，已對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類健康產(chǎn)生潛在的風(fēng)險(xiǎn)[1]。人體持續(xù)地暴露在這些物質(zhì)下，即使極低濃度，也可能對(duì)自身健康產(chǎn)生巨大危害[2]。

生物降解是有機(jī)化學(xué)品在環(huán)境中的主要去除途徑之一。土壤和水體中的微生物(如細(xì)菌和真菌)在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)以有機(jī)化學(xué)物質(zhì)作為碳源，消耗基質(zhì)中的化學(xué)物質(zhì)使其濃度逐漸降低。

目前各國(guó)的新化學(xué)物質(zhì)登記都要求提交化學(xué)物質(zhì)的生物降解性數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)其在環(huán)境中的持久性?；瘜W(xué)品的生物降解性測(cè)試普遍采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)的《化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則》中的快速生物降解(301)、固有生物降解(302)以及模擬生物降解方法(303)[3]。但是由于眾多的測(cè)試方法測(cè)試條件不同，導(dǎo)致化學(xué)品的生物降解過(guò)程多樣、影響因素復(fù)雜，且降解機(jī)理尚未完全明了，難以對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行合理有效的解釋。因此有必要對(duì)生物降解機(jī)理、生物降解過(guò)程、生物降解影響因素進(jìn)行詳細(xì)的研究，從而指導(dǎo)化學(xué)品生物降解測(cè)試工作。

在化學(xué)品生物降解過(guò)程中，降解途徑(如生長(zhǎng)代謝和共代謝)對(duì)化學(xué)品的生物降解性影響較大，此外微生物群落、溫度、pH、溶解氧、基質(zhì)濃度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)都會(huì)對(duì)化學(xué)品的生物降解性產(chǎn)生影響[4-10]。

筆者闡述了化學(xué)品降解過(guò)程中生長(zhǎng)代謝、共代謝的原理和作用，同時(shí)詳細(xì)分析了異養(yǎng)和自養(yǎng)微生物在化學(xué)品生物降解過(guò)程中的作用，以及各自降解酶對(duì)降解性的影響，以期為化學(xué)品的生物降解測(cè)試中化學(xué)品降解規(guī)律解釋以及提高化學(xué)品固有生物降解性測(cè)試能力提供指導(dǎo)。

1 化學(xué)品在環(huán)境中的生物降解途徑

生物降解是將大分子有機(jī)化合物轉(zhuǎn)變成小分子化合物或礦化為二氧化碳、水的復(fù)雜過(guò)程。在一般生物降解過(guò)程中，微生物利用有機(jī)物作為細(xì)胞生長(zhǎng)的主要底物(生長(zhǎng)基質(zhì))，同時(shí)誘導(dǎo)酶進(jìn)行同化作用，該過(guò)程一般稱為生長(zhǎng)代謝。

化學(xué)品在自然環(huán)境中濃度一般在ng/L級(jí)別[11]，很多化學(xué)品有毒或抑制微生物生長(zhǎng)，微生物可能不利用化學(xué)品作為唯一碳源。在這種情況下，微生物可能利用其他物質(zhì)或碳源，作為生長(zhǎng)基質(zhì)維持微生物的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)產(chǎn)生酶類，通過(guò)共代謝降解化學(xué)品，最終促進(jìn)化學(xué)品的生物降解[12]。

化學(xué)品在自然界和污水處理廠(sewage treatment plant，STP)中，生長(zhǎng)代謝和共代謝這2種降解方式是同時(shí)存在的，共同對(duì)化學(xué)品的去除起著決定性作用。

1.1 生長(zhǎng)代謝降解方式

在化學(xué)品生長(zhǎng)代謝過(guò)程中(圖1)，微生物利用化學(xué)品作為唯一碳源以維持其生物量，同時(shí)產(chǎn)生有關(guān)的酶和輔酶對(duì)其進(jìn)行氧化/還原。因此，如果化學(xué)品以微生物生長(zhǎng)代謝的方式進(jìn)行降解，則該化學(xué)品應(yīng)該對(duì)微生物無(wú)毒或低毒，且具有足夠高的濃度。

一些學(xué)者研究了化學(xué)品生長(zhǎng)代謝降解途徑。如Murdoch等[13]研究發(fā)現(xiàn)，菌株SphingomonasIbu-2能夠?qū)⒉悸宸?ibuprofen)作為唯一碳源，以生長(zhǎng)代謝方式降解。此外，Iasur-Kruh等[14]使用富雌激素降解菌(EDB)的菌株NovosphingobiumJEM-1對(duì)雌二醇(EstradiolE2)進(jìn)行降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠通過(guò)生長(zhǎng)代謝方式直接降解高濃度的E2(50 mg/L)。其他研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，以生長(zhǎng)代謝方式降解化學(xué)品的微生物只有異養(yǎng)細(xì)菌，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)微生物。

1.2 共代謝降解方式

20世紀(jì)50年代，在含氯溶劑、芳香族化合物和石油烴的生物降解試驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了共代謝現(xiàn)象[16]。圖2顯示了化學(xué)品的共代謝降解方式。許多化學(xué)品是有毒的或抑制微生物生長(zhǎng)，且該類化學(xué)品通常在環(huán)境中含量很低。這2個(gè)特點(diǎn)使得化學(xué)品很難進(jìn)入微生物細(xì)胞進(jìn)行分解代謝和合成代謝，因此，化學(xué)品必須在生長(zhǎng)基質(zhì)或其他可利用的化合物的共同存在下才能進(jìn)行降解。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，共代謝能將一些難降解化學(xué)品轉(zhuǎn)化為易降解中間產(chǎn)物[17]，但是最終降解產(chǎn)物可能比母體化合物的毒性更強(qiáng)，導(dǎo)致微生物不能進(jìn)一步降解。Haiss等[18]研究發(fā)現(xiàn)，泛影葡胺(diatrizoate)是3,5-二氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的好氧生物降解產(chǎn)物，該降解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的毒性，不能被常見(jiàn)細(xì)菌降解。同樣，Groning等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雙氯芬酸(diclofenac)很容易被河流沉積物中微生物降解，形成中間產(chǎn)物對(duì)苯醌亞胺，但是該中間產(chǎn)物具有毒性，也無(wú)法繼續(xù)降解。

化學(xué)品的共代謝降解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)微生物(自養(yǎng)氨氧化菌)的參與，該菌的非特異性酶——氨單加氧酶(AMO)可以氧化大量有機(jī)污染物[20]。這主要是因?yàn)樽责B(yǎng)氧化菌能夠利用無(wú)機(jī)碳和氨作為其生長(zhǎng)的能量來(lái)源，誘導(dǎo)產(chǎn)生AMO和輔酶因子(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD和煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸 NADH)對(duì)化學(xué)品進(jìn)行降解[21]。對(duì)于異養(yǎng)微生物，降解過(guò)程可能為共代謝和/或生長(zhǎng)代謝，具體取決于化學(xué)品的濃度和其對(duì)微生物的毒性[22]。

2 環(huán)境條件和化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)降解率的影響

化學(xué)品的生物降解過(guò)程中受到許多非生物因素和生物因素的影響，如溫度、pH、氧含量、生物利用度、生長(zhǎng)基質(zhì)、理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和毒性等。這些條件可以限制或刺激微生物的生長(zhǎng)，影響微生物的生物降解性。在STP中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)化學(xué)品的生物降解性存在顯著差異。

2.1 溫度影響

溫度會(huì)直接影響微生物的活性。微生物需要在合適的溫度范圍內(nèi)才能生長(zhǎng)，如氨氧化菌(AOB)可以在低溫下生長(zhǎng)[23]，而氨氧化古菌(AOA)在4～25 ℃生長(zhǎng)緩慢[24]。

為了研究溫度對(duì)AOB和AOA的影響，Wu等[24]研究了AOB和AOA中的amoA因子的豐度變化，發(fā)現(xiàn)該因子能夠通過(guò)編碼AMO中的A亞單元，氧化氨和各種化學(xué)品。經(jīng)過(guò)4周的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在4 ℃時(shí)AOB和AOA的amoA因子相對(duì)豐度較低，這可能是在低溫下DNA分解、細(xì)胞死亡加劇，生長(zhǎng)速率減緩導(dǎo)致的。在37 ℃時(shí)，2種微生物中amoA因子豐度發(fā)生顯著增加。

Suarez等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在16～26 ℃內(nèi)E2和EE2降解結(jié)果無(wú)顯著差異，表明在正常溫度范圍內(nèi)，溫度對(duì)化學(xué)品降解影響差異不顯著。

2.2 pH影響

pH可以影響微生物的生理活性及化學(xué)品的溶解度。pH大于10或小于3時(shí)會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)，pH也會(huì)影響體系中真菌和細(xì)菌的比例。Bothe等[26]研究了土壤中的pH對(duì)真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在酸性土壤中(pH為4.5)生物量減少了5倍，而真菌卻增長(zhǎng)了5倍，表明細(xì)菌在酸性環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)力減弱，不適宜生長(zhǎng)，而真菌能夠適應(yīng)酸性環(huán)境，快速增長(zhǎng)。

pH能夠改變化學(xué)品的離子態(tài)和非離子態(tài)的比例，離子態(tài)部分易溶于水，非離子態(tài)部分易吸附于污泥，導(dǎo)致生物可利用性有所差異，最終影響生物降解性[27]。Urase等[28]研究證實(shí)，酸性受試物如布洛芬和酮洛芬(ketoprofen)的降解受pH影響明顯，pH越低，降解率越高。如異丁苯丙酸(ibuprofen)在pH<6時(shí)降解率能超過(guò)90%，酮洛芬在pH<5時(shí)降解率也能達(dá)到70%。而非電離化學(xué)品如異丙安替比林(propyphenazone)、卡馬西平(carbamazepine)的降解率比較恒定，與溶液的pH無(wú)關(guān)。

2.3 溶解氧的影響

水中的溶解氧(DO)濃度高低，會(huì)直接影響微生物的活性和種類，決定微生物的呼吸類型：厭氧、缺氧和好氧呼吸，從而直接影響微生物對(duì)化學(xué)品的降解能力。何起利等[29]模擬了濕地環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)DO與基質(zhì)中細(xì)菌、真菌等微生物數(shù)量和多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶等酶存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，DO濃度直接影響自然環(huán)境中污染物的降解能力。Czajka等[23,30]分別在有氧條件下和厭氧條件下對(duì)雌激素(17α-炔雌醇[EE2]和17β-雌二醇[E2])的生物降解性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)EE2在厭氧條件下未觀察到生物降解，而在好氧測(cè)試中E2和EE2表現(xiàn)出了生物降解性。

2.4 化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

化學(xué)結(jié)構(gòu)直接決定化學(xué)品的降解性。Tran等[7]利用富硝化菌對(duì)10種化學(xué)品進(jìn)行生物降解試驗(yàn)，結(jié)果表明，分子結(jié)構(gòu)含有一個(gè)氯原子及以上的化學(xué)品，如氯貝酸(clofibric acid)、雙氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(dichloprop)降解率很低。

總結(jié)化學(xué)品的結(jié)構(gòu)和降解性的關(guān)系，有以下規(guī)律：1)具有吸電子性基團(tuán)(—SO3，—NO2，—Br，—Cl)的物質(zhì)比推電子基團(tuán)(—H，—NH2，—OCH3，—CH3，—COOH，—OH)的物質(zhì)難降解，吸電子基團(tuán)降低了氧化酶的親電攻擊性，導(dǎo)致生物利用度降低；2)取代基多的物質(zhì)比取代基少的物質(zhì)難降解，這主要是位阻效應(yīng)也使生物利用度有所差別；3)飽和度高的物質(zhì)穩(wěn)定性更高，比飽和度低的物質(zhì)難降解；4)短鏈烴比長(zhǎng)鏈烴難降解，主要是因?yàn)殚L(zhǎng)鏈烴的分子鍵更易斷裂。

3 微生物及其酶的影響

化學(xué)品降解率受微生物影響顯著，異養(yǎng)生物比自養(yǎng)硝化生物更易降解化學(xué)品[31]。筆者主要討論自養(yǎng)氨氧菌和異養(yǎng)細(xì)菌、異養(yǎng)真菌和相關(guān)代謝酶對(duì)生物降解的作用。

3.1 自養(yǎng)氨氧化菌與硝化作用

環(huán)境中的氨主要由AOA和AOB氧化。AOA的amoA基因相對(duì)豐度直接影響STP的氨氧化速率，而AOB的amoA基因和氨氧化速率之間沒(méi)有顯著相關(guān)性[10]。因此，AOA的amoA基因在STP的氨氧化過(guò)程中有著重要作用[34]。

許多有毒的和難降解化學(xué)品，如鹵代烴可通過(guò)硝化作用被有效地降解[35]。Helbling等[10]研究發(fā)現(xiàn)，AOB和AOA可以在氨存在的條件下，以其作為生長(zhǎng)底物誘導(dǎo)產(chǎn)生AMO酶并提供還原劑來(lái)共代謝降解該類化學(xué)品。

3.2 氨單加氧酶共代謝作用

自養(yǎng)氨氧化菌對(duì)氨的氧化過(guò)程中需要AMO及羥胺氧化還原酶(HAO)2種關(guān)鍵酶。AMO催化氨氧化成羥胺(NH2OH)。HAO進(jìn)一步將NH2OH氧化為亞硝酸鹽。AMO能夠氧化多種化學(xué)品如烷烴、烯烴和鹵代烴類化學(xué)品[36]。AMO是由A，B和C 3個(gè)亞基組成(也稱AMO-A、AMO-B和AMO-C)，這3個(gè)亞基分別由amo操縱子amoA、amoB和amoC編碼[37]。

Yi等[17]發(fā)現(xiàn)了在一定范圍內(nèi)氨氧化速率和EE2降解率之間呈線性關(guān)系：當(dāng)氨氧化速率從0.3 mmol/(g·h)(以VSS計(jì)，下同)增加到5.1 mmol/(g·h)時(shí)，EE2的降解率從1.1 μmol/(g·h)提高到4.1 μmol/(g·h)。Helbling等[10]發(fā)現(xiàn)，AMO能夠顯著促進(jìn)化學(xué)品的生物降解，且氨氧化率和化學(xué)品降解率僅與AOA的amoA基因有關(guān)。這意味著AOB和AOA產(chǎn)生AMO酶在化學(xué)品的共代謝降解中有著關(guān)鍵作用，但是具體功能尚未闡明。因此，需要進(jìn)一步研究共代謝反應(yīng)中AOA和AOB的AMO功能，以及其他AMO亞基(如AMO-B和AMO-C)在化學(xué)品生物降解中的作用。

3.3 異養(yǎng)細(xì)菌的作用

為了了解自養(yǎng)氨氧化菌和異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)化學(xué)品生物降解性的影響，可使用烯丙基硫脲(ATU)作為AMO抑制劑，抑制AOB氨氧化酶活性。Tran等[7]發(fā)現(xiàn)在ATU(10 mg/L)存在下，布洛芬和其他幾個(gè)化學(xué)品仍然發(fā)生了降解，這表明在沒(méi)有自養(yǎng)硝化作用的情況下，這些化學(xué)品仍然能被異養(yǎng)微生物降解。同樣，Rol等[39]也發(fā)現(xiàn)在AMO抑制劑存在下，雙酚A和布洛芬都被完全降解。而只有自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌(Nitrosomonaseuropea)時(shí)，布洛芬不能被降解，異養(yǎng)細(xì)菌在化學(xué)品的生物降解中也發(fā)揮重要作用。

Khunjar等[21]研究了AOB和異養(yǎng)微生物在EE2和甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim, TMP)生物降解中的作用，發(fā)現(xiàn)AOB可降解EE2但不能降解TMP，而異養(yǎng)微生物不但可以礦化EE2，而且可以轉(zhuǎn)化TMP，降解AOB產(chǎn)生的EE2衍生物。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)AOB和異養(yǎng)微生物可協(xié)同促進(jìn)EE2降解。

3.4 異養(yǎng)真菌胞外木質(zhì)素酶的作用

白腐真菌顯示出與好氧菌明顯不同的代謝途徑，其底物特異性低，氧化能力強(qiáng)，可降解如鹵代芳烴、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥和工業(yè)廢物等多種持久性有機(jī)污染物[40]。

白腐真菌主要依靠細(xì)胞外木質(zhì)素降解酶(氧化酶和過(guò)氧化物酶)起作用，這些酶包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)、錳過(guò)氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。這些降解酶對(duì)底物特異性較低，對(duì)化學(xué)品具有廣譜性[41]。此外，白腐真菌還能分泌低分子量調(diào)節(jié)物，進(jìn)一步擴(kuò)寬氧化化學(xué)品的范圍。很多學(xué)者使用胞外木質(zhì)素降解酶對(duì)化學(xué)品進(jìn)行了降解性研究。漆酶可以很明顯地降解雙酚A、三氯生和E1等酚醛類化學(xué)品[42]。一些非酚醛類化學(xué)品(如雙氯芬酸和吲哚美辛)也可以被漆酶降解[43]。其他木質(zhì)素降解酶(MnP和LiP)也可以降解化學(xué)品，但是MnP和LiP在自然條件下并不穩(wěn)定[41]。

4 化學(xué)品生物降解性促進(jìn)方法

4.1 添加生長(zhǎng)基質(zhì)

共代謝過(guò)程能夠提高化學(xué)品的生物降解性，在共代謝過(guò)程中相關(guān)降解酶的數(shù)量取決于生長(zhǎng)基質(zhì)的濃度，為了提高降解化學(xué)品微生物共代謝作用，必須提供功能微生物群充足的生長(zhǎng)基質(zhì)。生活污水中生長(zhǎng)基質(zhì)含量很高，這也是很多工業(yè)廢水必須要和生活污水合并處理的原因。

4.2 控制微生物群落結(jié)構(gòu)

化學(xué)品的生物降解有自養(yǎng)微生物的共代謝降解、異養(yǎng)微生物的共代謝和/或生長(zhǎng)代謝降解。典型的AOA可以通過(guò)非特異性酶AMO共代謝降解化學(xué)品，而異養(yǎng)微生物也能夠通過(guò)他們的各種加氧酶降解多種化學(xué)品。由于自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物產(chǎn)生酶的差異，化學(xué)品的降解率也不同，通過(guò)合理控制微生物的群落結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)化學(xué)品的生物降解性。

4.3 真菌漆酶和加氧酶的組合

白腐真菌的胞外漆酶具有較低的底物專一性和降解酚類化學(xué)品的能力。在沒(méi)有其他介質(zhì)參與下，漆酶很難降解芳香族化合物或非酚結(jié)構(gòu)的化學(xué)品。細(xì)菌加氧酶能夠羥基化許多芳香族化合物和非酚結(jié)構(gòu)的化學(xué)品，但是細(xì)菌很難降解羥基化的化學(xué)品，且羥基化的化學(xué)品往往會(huì)抑制細(xì)菌活性，而真菌漆酶容易降解細(xì)菌羥基化的副產(chǎn)物(苯酚基)。因此，研究設(shè)計(jì)真菌漆酶和細(xì)菌混合培養(yǎng)方法對(duì)促進(jìn)化學(xué)品的生物降解性也具有重要意義。

5 研究展望

與快速生物降解性測(cè)試不同，固有生物降解測(cè)試用于評(píng)價(jià)化學(xué)品具有的最大生物降解能力。目前OECD化學(xué)品固有生物降解性測(cè)試方法中，302A改進(jìn)的半連續(xù)活性污泥試驗(yàn)(SCAS)、302B贊恩-惠倫斯/EMPA試驗(yàn)和302C改進(jìn)的MITI試驗(yàn)(Ⅱ)，這3個(gè)測(cè)試方法在最大限度的評(píng)價(jià)化學(xué)品的降解潛能方面存在一定不足。

3個(gè)化學(xué)品固有生物降解性測(cè)試方法中，只有302A試驗(yàn)在試驗(yàn)過(guò)程中要求不斷加入生活污水，302B和302C試驗(yàn)都在不含其他碳源的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)行，因此，302B和302C試驗(yàn)在某種程度上無(wú)法評(píng)估化學(xué)品的共代謝降解潛能。302A試驗(yàn)過(guò)程中雖然要求加入生活污水，但是沒(méi)有明確規(guī)定生活污水的組成，由于不同地區(qū)、不同時(shí)間STP中生活污水差異較大，因此302A試驗(yàn)結(jié)果預(yù)期差異較大。此外，現(xiàn)有的固有生物降解性測(cè)試方法中，也沒(méi)有對(duì)自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物組成和比例進(jìn)行明確規(guī)定。

為了評(píng)價(jià)化學(xué)品的最大生物降解能力，應(yīng)該在OECD 302A、302B和302C試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以化學(xué)品的生物降解機(jī)理為指導(dǎo)原則，充分考慮加入生長(zhǎng)基質(zhì)對(duì)化學(xué)品的共代謝促進(jìn)作用。研究并規(guī)范生長(zhǎng)基質(zhì)(生活污水)的組成和含量，通過(guò)改變SRT、HRT以及添加生長(zhǎng)基質(zhì)等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的控制。同時(shí)研究真菌漆酶和細(xì)菌等混合培養(yǎng)方法，合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)接種物中真菌和細(xì)菌的比例，實(shí)現(xiàn)化學(xué)品的增強(qiáng)生物降解性測(cè)試方法，更好地評(píng)估化學(xué)品的最大生物降解能力。

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