慢性乙型病毒性肝炎中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展＊

鄧曉靖，雷亞云，曹貴霞，馮培民，2＊＊

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 成都 610075)

慢性乙型病毒性肝炎，又稱(chēng)慢性乙型肝炎(CHB，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“慢乙肝”)，是因感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)而導(dǎo)致的肝臟慢性疾病，是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的傳染性常見(jiàn)病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)全世界有超過(guò)2.57億人被感染，每年因HBV感染造成的死亡超過(guò)88.7萬(wàn)人，大約40%的肝癌病例由慢乙肝發(fā)展而來(lái)，其死亡率在癌癥中居第2位[1]。盡管我國(guó)乙肝疫苗在預(yù)防乙肝中取得了不錯(cuò)的成績(jī)，但2014年WHO發(fā)布的白皮書(shū)中提到在中國(guó)一般人群中乙肝病毒表面抗原流行率約為5.49%，仍有超過(guò)7400萬(wàn)例HBV攜帶者[2]。目前核苷(酸)類(lèi)似物和干擾素是抗病毒治療中的有效方案，但仍不能徹底治愈乙肝、不能徹底消除炎癥、不能逆轉(zhuǎn)所有肝硬化、不能完全阻斷肝臟癌變進(jìn)程[3]。中醫(yī)藥治療慢乙肝在臨床中有豐富的病例報(bào)道，并有諸多成功案例，但由于醫(yī)學(xué)指征、癥候的不同，也存在較大的辨證差異，療效不確定等不足。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。蛋白質(zhì)組是指一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組的研究為眾多疾病機(jī)理的闡釋提供理論依據(jù)，并且亦為疾病的治療提供了可量化可衡量指標(biāo)，是人類(lèi)認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)規(guī)律的重要手段。由于在疾病的不同階段，不同分型的蛋白質(zhì)表達(dá)情況不盡相同，因此可以說(shuō)蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上不斷動(dòng)態(tài)變化著的整體，這與中醫(yī)學(xué)“整體觀念”的認(rèn)識(shí)相契合[4]。通過(guò)比較正常個(gè)體與病理個(gè)體之間的蛋白質(zhì)組差異，可以找到疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的特異性蛋白質(zhì)分子，這為疾病的早期診斷提供了有效的分子標(biāo)志，亦可成為新藥設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，因此近年來(lái)，在人類(lèi)疾病發(fā)病機(jī)制、治療和藥物篩選研究中蛋白質(zhì)組學(xué)被廣泛運(yùn)用，并取得了大量有意義的結(jié)果[5-7]。

有研究表明，中醫(yī)“證”的本質(zhì)是基因型及其表達(dá)，疾病的癥狀體征變化是基因及其在mRNA、蛋白質(zhì)水平差異的外在表現(xiàn)[8]。慢乙肝中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學(xué)是研究慢乙肝不同證型間差異蛋白質(zhì)的有效方法，找到不同證型所對(duì)應(yīng)的病理狀態(tài)下人體血清蛋白質(zhì)組，組建不同證型蛋白質(zhì)組學(xué)信息庫(kù)，從整體層面尋找慢乙肝的證侯分子標(biāo)簽，是病證結(jié)合的中西醫(yī)結(jié)合現(xiàn)代化研究的新模式[9]，也是中醫(yī)學(xué)走“精準(zhǔn)”技術(shù)層面的升級(jí)，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)能夠全面系統(tǒng)地分析慢乙肝不同證型相關(guān)蛋白譜的特征及其差異，有助于進(jìn)一步提高中醫(yī)證候診斷的客觀性，揭示中醫(yī)證候本質(zhì)，為臨床應(yīng)用提供重要的技術(shù)指導(dǎo)。本文將對(duì)慢乙肝中醫(yī)證型的蛋白組學(xué)研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，介紹目前蛋白質(zhì)組學(xué)在中醫(yī)證候研究中的主要技術(shù)手段和研究方法，并對(duì)不同證型的慢乙肝蛋白組學(xué)研究現(xiàn)狀進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為當(dāng)前慢乙肝中醫(yī)證候客觀化研究提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)從本質(zhì)上講是在細(xì)胞水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的平行分離和分析，因此其處理的數(shù)據(jù)是海量的，這就要求所采用的技術(shù)具有高通量、快速、準(zhǔn)確、高效等特性，可以說(shuō)蛋白質(zhì)組學(xué)研究能否成功，在較大程度上取決于所采用的技術(shù)手段和研究方法水平的高低。近年來(lái)，物理和化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的手段，當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展所采用的主要研究技術(shù)包括：

1.1 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)的生理化學(xué)特性(等電點(diǎn)和分子量)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的一種方法，是蛋白質(zhì)組學(xué)中最有用的復(fù)雜生物混合物蛋白質(zhì)分離方法之一。首先，它根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同實(shí)現(xiàn)第一維等電聚焦分離，然后，在第二維中使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)根據(jù)分子量的不同將變性的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，從而在二維平面上將復(fù)雜蛋白混合物中的各個(gè)蛋白質(zhì)片段分開(kāi)。分離后的蛋白質(zhì)可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用、致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究等諸多方面，因此雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究具有十分重要的意義。目前所發(fā)展的雙向電泳技術(shù)具有對(duì)蛋白質(zhì)檢驗(yàn)比較靈敏、高分辨率的完整分離蛋白質(zhì)等特點(diǎn)[10]，但同時(shí)也存在著對(duì)低豐度蛋白不敏感、極端相對(duì)分子質(zhì)量蛋白漏檢、樣品處理復(fù)雜以及難以自動(dòng)化等缺點(diǎn)[11]。

1.2 生物質(zhì)譜技術(shù)

生物質(zhì)譜技術(shù)是一種儀器分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物和臨床樣品的分析，其基本原理是復(fù)雜混合物樣品在線分離后經(jīng)離子化送入質(zhì)譜儀，并被裂解為不同質(zhì)量的碎片，通過(guò)辨別其質(zhì)荷比(m/z)來(lái)確定樣品組分的分子量，從而推斷出蛋白質(zhì)的組成。其目前已經(jīng)發(fā)展成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具，用于了解蛋白質(zhì)組的結(jié)構(gòu)和行為[12]。常用的質(zhì)譜主要包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)。而生物質(zhì)譜一般與液相色譜聯(lián)合使用(LC-MS)。

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF-MS)的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，激光能量被基質(zhì)分子吸收，樣品解吸附，基質(zhì)與樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移從而使樣品分子電離，離子化后的樣品在質(zhì)譜飛行管中飛行從而被測(cè)定分子量。MALDI-TOF-MS一般用于小肽和多肽質(zhì)量指紋圖譜的分析，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)中最為常用的一種鑒定方法[13]，該技術(shù)具有檢測(cè)操作程序簡(jiǎn)單、靈敏度較高、分析時(shí)間較短、短時(shí)間內(nèi)可達(dá)到高通量、且分析時(shí)產(chǎn)生的電荷準(zhǔn)分子離子抗干擾能力較強(qiáng)等特點(diǎn)[14]。此外，基于質(zhì)譜的分子組織學(xué)新興技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像(MALDIMSI)的發(fā)展使可視化蛋白質(zhì)組成為可能[15]。

電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)是利用高壓電場(chǎng)將質(zhì)譜進(jìn)樣端毛細(xì)管柱流出液荷電，在氮?dú)鈿饬鞯淖饔孟?，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫(kù)侖力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為眾多荷電的子液滴，子液滴不斷重復(fù)這一過(guò)程，從而使最終的液滴呈非常細(xì)小的噴霧狀，此時(shí)液滴表面的電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以荷電離子的形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。分析過(guò)程無(wú)需其它的基質(zhì)輔助，可以檢測(cè)原子質(zhì)量單位幾千道爾頓的小分子乃至上百萬(wàn)道爾頓的大分子待測(cè)物，并且可以通過(guò)改變噴霧溶劑種類(lèi)，顯著提高不同種類(lèi)待測(cè)物的萃取效率和選擇性等，但是也存在分析時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)[16]。

1.3 同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)

目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段主要包括：細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)、非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)(Label-free)等，其中iTRAQ技術(shù)在慢乙肝中醫(yī)證候研究方面使用最為廣泛。

iTRAQ技術(shù)是利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)N段或者蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，然后通過(guò)高精度質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測(cè)定蛋白表達(dá)量的方法。它一次可同時(shí)分析4-8個(gè)蛋白樣本，通過(guò)蛋白質(zhì)信息學(xué)手段分析獲得差異蛋白的表達(dá)和定量?；谫|(zhì)譜分析的iTRAQ技術(shù)為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了樣本來(lái)源廣、高通量、高敏感性、高特異性、高重復(fù)性、操作相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，是當(dāng)今定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要高通量篩選技術(shù)之一[17]。但也存在一些明顯的缺點(diǎn)，如在樣品前期處理階段，樣品酶解程度對(duì)結(jié)果的測(cè)定有非常大的影響，甚至?xí)霈F(xiàn)樣品處理不當(dāng)，結(jié)果偏差令人無(wú)法接受等問(wèn)題；此外對(duì)于蛋白質(zhì)的定量，iTRAQ主要依靠在二級(jí)質(zhì)譜中離子峰面積比值計(jì)算，對(duì)其篩選差異蛋白也會(huì)產(chǎn)生一定影響。

1.4 蛋白質(zhì)芯片及細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)存在和變化的高效技術(shù)，它為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了新的有力工具。其工作原理是：酶、抗原、抗體、細(xì)胞因子等探針蛋白分子與經(jīng)化學(xué)處理的固體載體結(jié)合所得到的基質(zhì)，處理血清、血漿等樣品時(shí)，存在于這些樣品中的某些蛋白就會(huì)與探針?lè)肿赢a(chǎn)生特異性結(jié)合，從而被探針?lè)肿硬东@，經(jīng)過(guò)洗滌、純化后的結(jié)合蛋白可以采用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)，這為研究疾病發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)譜的變化規(guī)律提供了有力的技術(shù)支持。目前已有關(guān)于IMAC3、WCX2芯片和SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)分析和交叉驗(yàn)證慢性肝病患者的血清中特異蛋白，并根據(jù)蛋白的分子量和組織來(lái)源在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索、確定目標(biāo)蛋白成為分子標(biāo)志物的報(bào)道[18]。

細(xì)胞因子抗體芯片是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高通量免疫檢測(cè)分析方法，可以應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)微量樣品中大量細(xì)胞因子表達(dá)水平的快速定性分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行高通量、高特異性和系統(tǒng)重現(xiàn)性的檢測(cè)，對(duì)不同樣品之間細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)豐度具有突出的表現(xiàn)[19]。細(xì)胞因子抗體芯片目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病生物標(biāo)志物的篩選和鑒定[20-22]，在慢乙肝中醫(yī)證候客觀化研究方面已有報(bào)道[23]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究與慢乙肝中醫(yī)證候客觀化

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢乙肝是由濕熱疫毒之邪內(nèi)侵機(jī)體，正氣不足無(wú)力抗邪時(shí)而發(fā)病，多因外感、情志、飲食、勞倦而誘發(fā)。2018年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝膽病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)制定了《慢性乙型肝炎中醫(yī)診療指南》[24]，提出慢乙肝常見(jiàn)的中醫(yī)證型分5種，分別為：肝膽濕熱證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡(luò)證、脾腎陽(yáng)虛證，其中，又以肝膽濕熱證和肝郁脾虛證最為常見(jiàn)。近年來(lái)的研究表明：通過(guò)對(duì)慢乙肝不同證型進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不同證型與正常組、證型與證型間都存在著不同的差異蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)的表達(dá)在一定程度上也影響了不同慢乙肝患者的癥狀、體征等外在表現(xiàn)，充分證明了不同中醫(yī)證候具有不同的客觀化指標(biāo)。

2.1 肝膽濕熱證

戴幸平等[25]用MALDI-TOF-MS生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)慢乙肝中醫(yī)辨證為肝膽濕熱證的患者和正常人進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)鑒定分析，找到了46個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并初步鑒定了一些慢乙肝肝膽濕熱證型差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)慢乙肝肝膽濕熱證的病理過(guò)程中有可能發(fā)生單個(gè)核細(xì)胞的激活、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減弱以及可能影響細(xì)胞免疫功能；也有一定概率存在肝細(xì)胞抗損傷能力降低。隨后對(duì)清肝利濕湯治療慢乙肝肝膽濕熱證外周血單個(gè)核細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡信號(hào)分子、凝血相關(guān)蛋白、細(xì)胞免疫及能量代謝相關(guān)酶可能是清熱利濕湯治療慢乙肝肝膽濕熱證的作用靶點(diǎn)[26]。最近，席婷[27]對(duì)慢乙肝肝膽濕熱型表達(dá)蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)I-309(重組人趨化因子CCL1)、MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白-1)、SDF-1(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1)、FAP(成纖維細(xì)胞激活蛋白)、M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1)、VCAM-1(血管細(xì)胞黏附分子-1)在慢乙肝肝膽濕熱證表達(dá)水平升高，而ApoM(載脂蛋白M)呈低表達(dá)，提示慢乙肝肝膽濕熱證中細(xì)胞免疫反應(yīng)比較活躍且存在著炎癥損傷，這與筆者相關(guān)課題組的研究結(jié)果相契合。筆者[28]對(duì)慢乙肝肝膽濕熱證患者及健康對(duì)照組的血清采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、iTRAQ結(jié)合液相色譜和質(zhì)譜串聯(lián)的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)：肝膽濕熱證組與健康人組相比，IGF-1有顯著性差異，表明肝膽濕熱證組中細(xì)胞的增殖、分化和凋亡比較劇烈。

2.2 肝郁脾虛證

劉友平等[29]通過(guò)對(duì)比分析慢乙肝肝郁脾虛證及健康人的血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比較肝郁脾虛證存在8個(gè)明顯的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，但遺憾的是未能對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能做進(jìn)一步更加深入的研究。陳文莉等[30]對(duì)慢乙肝肝郁脾虛證、濕熱中阻證及健康男性的血清進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析鑒定出7個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，在對(duì)這7個(gè)差異蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛組中與肝功能、以及機(jī)體免疫水平相關(guān)的蛋白表達(dá)降低，且纖維化趨勢(shì)更明顯，同時(shí)檢測(cè)出CRP和SAMP顯著升高，從而表明肝郁脾虛患者存在明顯的乙肝炎癥活動(dòng)。楊健坤等[31]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對(duì)慢乙肝肝郁脾虛證、脾胃濕熱證的血清差異蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了廣泛篩查，在肝郁脾虛證組與正常對(duì)照組的比較中發(fā)現(xiàn)了30個(gè)差異表達(dá)蛋白，后續(xù)的差異蛋白生物學(xué)功能研究表明TU BAl A可能是慢乙肝肝郁脾虛證的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，可用于慢乙肝肝郁脾虛證分組；此外，還發(fā)現(xiàn)LGALS3BP(可溶性半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白)在慢乙肝患者中存在差異表達(dá)，亦有可能成為肝郁脾虛證的良好標(biāo)志物；而在肝郁脾虛證中上調(diào)的PON3(血清對(duì)氧磷酶3)可能對(duì)肝組織改變和導(dǎo)致肝病的肝細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用[32]。

2.3 虛證(肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證)

王磊瓊等[33]對(duì)中醫(yī)虛證(肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證)慢乙肝患者和健康正常人血漿進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)的分析鑒定，發(fā)現(xiàn)慢乙肝中醫(yī)虛證中APO-A2、HP表達(dá)均明顯下降，從而推測(cè)肝細(xì)胞的損害、脂代謝紊亂、肝細(xì)胞合成HP的能力下降、分解增加、機(jī)體的非特異性免疫力下降均與慢乙肝中醫(yī)虛型證型的形成機(jī)制有關(guān)，進(jìn)而認(rèn)為慢乙肝中醫(yī)二虛證(肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證)具有相同的蛋白質(zhì)變化規(guī)律。劉友平等[34]采用雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析對(duì)慢乙肝脾腎陽(yáng)虛證患者及健康對(duì)照者的血漿蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行研究，共鑒定出7個(gè)差異蛋白，其中VN、載脂蛋白等反映肝臟分泌功能的蛋白質(zhì)在脾腎陽(yáng)虛證中呈較低水平，脾腎陽(yáng)虛證組中急性時(shí)相蛋白SAMP較對(duì)照組下調(diào)，這充分說(shuō)明慢乙肝脾腎陽(yáng)虛證中肝臟組織不存在明顯的炎癥反應(yīng)，而表現(xiàn)為明顯的蛋白合成功能障礙。

2.4 脾胃濕熱(濕熱中阻證)

魏嵋等[35]對(duì)慢乙肝濕熱中阻證患者及健康對(duì)照的血漿蛋白質(zhì)，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定獲得7個(gè)蛋白點(diǎn)，認(rèn)為慢乙肝濕熱中阻證患者肝臟損害較輕微，亦無(wú)明顯的炎癥反應(yīng)，以及差異表達(dá)蛋白Apo AⅠ、Apo AⅣ對(duì)慢性乙肝濕熱中阻證的診斷、藥物治療及臨床預(yù)后具有重要價(jià)值；然而陳文莉等[30]的研究則認(rèn)為在濕熱中阻證中急性時(shí)相蛋白以及和脂類(lèi)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)較高，臨床表現(xiàn)出的濕熱證候相關(guān)癥狀越明顯，肝功能損害越重，所以對(duì)比正常組反應(yīng)急性時(shí)相蛋白質(zhì)如CRP(C反應(yīng)蛋白)、SAMP(血清淀粉蛋白P)在濕熱中阻組中表達(dá)升高較突出。楊健坤等[31]在脾胃濕熱組篩選出24個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中AcTA2、AcTG 2、zN F628、DEFAl、D EFA3、caM可能是慢乙肝脾胃濕熱證的潛在生物學(xué)標(biāo)志物；同時(shí)作者還發(fā)現(xiàn)了慢乙肝脾胃濕熱證特異性差異表達(dá)的蛋白，如ITIH1(α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H1)，THBS1(血小板反應(yīng)蛋白-1)，C5(補(bǔ)體C5)和ALB(白蛋白)，其中ITIH1的低表達(dá)表明可用于區(qū)別慢乙肝脾胃濕熱證和肝郁脾虛證。

慢乙肝是一種傳染性疾病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其是由于外來(lái)邪氣入侵，正氣不能鼓邪外出，正邪交爭(zhēng)于內(nèi)而發(fā)病，其病因應(yīng)歸于“疫毒、雜氣”。一般而言，濕熱證患者感邪較重，正氣亦不虧，濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)肝膽、中焦，正邪抗?fàn)巹×?，屬“?shí)證”，上述蛋白質(zhì)組學(xué)研究亦提示肝膽濕熱證組機(jī)體內(nèi)有較重的炎癥反應(yīng)以及較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，脾胃濕熱證組結(jié)果同肝膽濕熱證相類(lèi)似，表現(xiàn)為肝細(xì)胞損害較重，同時(shí)細(xì)胞修復(fù)及能量代謝調(diào)節(jié)活躍；肝郁脾虛證患者感邪后肝氣失于疏泄，郁結(jié)而橫逆犯脾，致脾氣虧虛，正氣不足，正邪交爭(zhēng)不如濕熱證，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果則表明其炎癥表現(xiàn)較輕，而肝纖維化趨勢(shì)明顯；虛證患者由于原本素體正氣虧虛或久病正氣消耗，其正氣無(wú)力與邪氣抗?fàn)?，相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示肝細(xì)胞損害較輕，但細(xì)胞的正常合成功能受到了影響；綜上所述，慢乙肝中醫(yī)證候的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果與中醫(yī)理論在一定程度上相契合，這對(duì)闡述慢乙肝中醫(yī)證候的客觀化具有一定的指導(dǎo)性意義。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示慢乙肝中醫(yī)證候間差異的生物學(xué)基礎(chǔ)

慢乙肝中醫(yī)證候的準(zhǔn)確判斷是中醫(yī)藥對(duì)癥治療的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。慢乙肝的發(fā)生、發(fā)展是多環(huán)節(jié)、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，在分子水平上講，不同的證侯是不同功能的蛋白質(zhì)參與其中的結(jié)果。在研究慢乙肝不同中醫(yī)證候差異性蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上發(fā)掘出辨證的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，并通過(guò)對(duì)慢乙肝患者血清蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定、評(píng)估，可以在一定程度上提高中醫(yī)辨證的準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)辯證的“可量化”“精準(zhǔn)化”，更易于使中醫(yī)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所理解和接受。

周威龍等[36]篩選了慢乙肝脾胃濕熱證、肝郁脾虛證、健康者的證候間差異蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)功能研究，結(jié)果顯示肝郁脾虛組和脾胃濕熱組存在61個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中16個(gè)表達(dá)上調(diào)，45個(gè)表達(dá)下調(diào)，兩證型之間差異蛋白主要包含了脂肪酸代謝、視黃醇代謝、精脯氨酸代謝、丙-谷-天冬氨酸代謝、氧化磷酸化代謝以及與肝酶P-450相關(guān)的毒物和共棲代謝通路，它們和處于差異蛋白功能網(wǎng)圖中交點(diǎn)位置的YWHAH、RhoA、RhoC、ATP5A1、ATP5B、CDH1蛋白都有可能是證候間差異的生物學(xué)基礎(chǔ)。最近，筆者課題組[37]采用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)對(duì)慢乙肝肝郁脾虛、肝膽濕熱、脾胃濕熱證型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各證型之間存在差異蛋白表達(dá)，以及具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白通路，并且差異蛋白功能表達(dá)也具有顯著差異，這充分說(shuō)明不同證型蛋白質(zhì)功能發(fā)揮作用時(shí)的途徑亦有不同，各證型均有不同的病理和轉(zhuǎn)歸過(guò)程，從而有效證明慢乙肝的傳統(tǒng)中醫(yī)辨證不是仁者見(jiàn)仁智者見(jiàn)智的憑空想象，而是有著深刻的微觀生物學(xué)基礎(chǔ)，這與現(xiàn)代西醫(yī)的“物質(zhì)可量化”觀點(diǎn)之間不謀而合，充分佐證了中醫(yī)的科學(xué)性和科學(xué)內(nèi)涵。

4 問(wèn)題與展望

蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究慢乙肝中醫(yī)證候差異，提高辨證準(zhǔn)確度和評(píng)估預(yù)后的重要手段已被中醫(yī)界所廣泛接受，并取得了豐富的成果，為慢乙肝辯證分型提供了可參考、可量化的指標(biāo)，促進(jìn)了中醫(yī)辯證技術(shù)的客觀化，為慢乙肝的辯證分型和辯證施藥提供了重要參考和技術(shù)手段，但也應(yīng)該看到目前仍存在許多不足之處，如：①當(dāng)前大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究納入的病例數(shù)偏少，且揭示的結(jié)果難以得出統(tǒng)一的結(jié)論，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更大范圍的驗(yàn)證；②由于目前研究中發(fā)現(xiàn)的慢乙肝中醫(yī)證候差異蛋白數(shù)量較多，暫時(shí)不能完全進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的鑒定，需進(jìn)一步分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在慢乙肝發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)意義，并發(fā)掘出辨證的標(biāo)志性蛋白質(zhì)；③慢乙肝中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物尚依賴(lài)于進(jìn)一步臨床研究的證實(shí)，多種差異蛋白的作用機(jī)制尚不明晰，其在臨床診斷、評(píng)估中的應(yīng)用仍有待深入研究。不過(guò)，相信隨著蛋白質(zhì)組研究手段的不斷進(jìn)步和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，快速、低成本鑒定差異蛋白，實(shí)現(xiàn)蛋白與功能的一一對(duì)應(yīng)將成為可能，這必將從根本上揭示慢乙肝證候的生物學(xué)基礎(chǔ)，闡釋慢乙肝中醫(yī)證候的本質(zhì)。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的發(fā)展一直與臨床實(shí)踐聯(lián)系密切，形成了“方證對(duì)應(yīng)”的基本診療模式，客觀上強(qiáng)調(diào)方劑與證候之間的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，強(qiáng)調(diào)“辨證施藥”，而蛋白質(zhì)組學(xué)恰好從微觀物質(zhì)基礎(chǔ)角度提供了中醫(yī)證候的客觀解釋?zhuān)沟棉q證施藥有了物質(zhì)作用基礎(chǔ)，這為中醫(yī)理論的現(xiàn)代發(fā)展提供了有力支撐，因此，可以說(shuō)蛋白質(zhì)組學(xué)是唯物論在中醫(yī)學(xué)中的體現(xiàn)和再實(shí)踐。以蛋白質(zhì)組學(xué)作為微觀物質(zhì)基礎(chǔ)，“中醫(yī)證候”與“方劑”形成了巧妙的對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)，“蛋白質(zhì)組學(xué)”“中醫(yī)證候”和“方劑”三者之間形成了互為支撐的客觀事實(shí)，其中“蛋白質(zhì)組學(xué)”和“中醫(yī)證候”之間的關(guān)系是：“蛋白質(zhì)組學(xué)”揭示了“中醫(yī)證候”的物質(zhì)基礎(chǔ)，“中醫(yī)證候”為蛋白質(zhì)組差異的外在體現(xiàn)；而“蛋白質(zhì)組學(xué)”和“方劑”之間的關(guān)系是：蛋白質(zhì)組是中藥方劑中有效成分的作用靶點(diǎn)，中藥多組分、多功能、多通路協(xié)同作用與蛋白質(zhì)組中呈現(xiàn)的多作用靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)和鍥合；同時(shí)，“方劑”和“中醫(yī)證候”之間的關(guān)系則是：“證候”是“方劑”的施藥基礎(chǔ)，而“方劑”則是“證候”的客觀量化和解決對(duì)策；因此，在慢乙肝中醫(yī)證候與蛋白質(zhì)相關(guān)關(guān)系的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)該重視和加入“方劑”的研究，這不僅有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)慢乙肝中醫(yī)證候與蛋白質(zhì)組之間的關(guān)聯(lián)性，并且方劑與蛋白質(zhì)的作用及其在證候上的反映，更有助于理解蛋白質(zhì)的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，這可為創(chuàng)新藥物的開(kāi)發(fā)和慢乙肝病理機(jī)制的闡釋提供更加豐富的數(shù)據(jù)和事實(shí)支撐。

此外，蛋白質(zhì)組學(xué)與慢乙肝中醫(yī)證候的關(guān)系研究，不應(yīng)該被割裂和孤立，而應(yīng)該在更大的視角下進(jìn)行觀察和深入思考，特別是近年來(lái)隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)的發(fā)展，將蛋白質(zhì)組學(xué)與之相關(guān)聯(lián)，將有助于更全面、更寬闊的視角下理解研究慢乙肝中醫(yī)證候與蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)聯(lián)性，更加深刻的揭示慢乙肝中醫(yī)證候的科學(xué)本質(zhì)，從而真正實(shí)現(xiàn)中醫(yī)理論的現(xiàn)代化，使得中醫(yī)藥發(fā)展邁向精準(zhǔn)時(shí)代。