外泌體生物學發(fā)生機制的研究進展

郝慧強，李姝赟，郭松佳，李榮山

1山西醫(yī)科大學，太原030000；2山西省人民醫(yī)院腎內科；3山西醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院腎內科

外泌體是一種主要存在于細胞外的小泡，大部分細胞都可以分泌外泌體。起初認為外泌體僅與細胞內代謝廢物排出相關，近年來研究證實，外泌體還具有細胞間通訊功能。細胞外小泡根據其發(fā)生部位不同分為外泌體和微泡。外泌體被認為是早期內體成熟為晚期內體（MVB）后與質膜融合被釋放，直徑30～100 nm［1］；而微泡是直接從質膜脫落，也被稱為微粒體、胞外體等，直徑50 nm～1 μm［2］。外泌體可作為生物標記物來發(fā)揮診斷價值，同時因外泌體攜帶體內的生理病理學信息，也可用來研究相關疾病的發(fā)病機制、治療方法。外泌體本身也是很好的載體，可用作藥物的載體靶向作用于相應器官。對外泌體進行深入研究將有助于對其功能的挖掘。因此，本文將對外泌體生物發(fā)生的相關研究進展進行綜述。

1 外泌體的發(fā)生途徑

外泌體的生物發(fā)生目前認為主要有質膜和內體兩種途徑。研究最多的是內體途徑，即先由質膜出芽形成早期內體，然后早期內體萌發(fā)腔內囊泡形成MVB，最終MVB與質膜融合釋放外泌體。這一機制來自于對網織紅細胞成熟過程中轉鐵蛋白受體的研究，目前很多報道均基于這一生物發(fā)生機制定義外泌體［1］。此外，已有多項證據表明外泌體可以從質膜直接出芽形成，即質膜途徑。

人類CD4+T細胞系可以通過質膜“內體樣結構域”出芽直接分泌外泌體，該結構域富含CD63、CD81以及各種內體和外泌體蛋白［3］。有研究通過對外泌體標志蛋白CD63、CD81、CD9進行質膜和內體標記，發(fā)現(xiàn)人胚胎腎細胞、鼠NIH3T3成纖維細胞的質膜是外泌體生物發(fā)生的主要部位，這些囊泡與MVB來源的外泌體具有相同大?。?］、標記物、蛋白質以及脂質。因此有理由認為外泌體可以直接從質膜出芽產生。還有少部分細胞可能不通過MVB和質膜途徑形成外泌體，如巨噬細胞［3］。巨噬細胞的質膜連接腔室（IPMC）也可能是外泌體產生的一種途徑。與MVB不同的是，IPMC通過頸部與質膜相連，并與細胞外環(huán)境相通，小分子物質可以自由通過。感染HIV病毒的巨噬細胞中，IPMC是主要的病毒萌芽場所，任何打開連接膜通道的刺激都會導致病毒顆粒以及CD81/CD9的外泌體和其他膜結構的快速釋放［5-6］。這一機制在其他細胞中并未發(fā)現(xiàn)?？傊?，在各種類型的細胞中，可能有不同的或主要發(fā)生途徑不同的外泌體產生機制。

2 外泌體的發(fā)生機制

目前研究最多的外泌體發(fā)生機制是內體途徑。早期內體產生后逐漸成熟為MVB，MVB的形成有內吞體分選轉運復合體（ESCRT）依賴和ESCRT非依賴兩種機制。ESCRT系統(tǒng)包括異源二聚體ESCRT-0（由HRS和STAM兩個蛋白組成）、異源四聚體ESCRT-Ⅰ（由 TSG1010亞基、VPS28、VPS37以及MVB12組成）、異源四聚體ESCRT-Ⅱ（由EAP45、EAP30和2個EAP20組成）、ESCRT-Ⅲ（由CHMP2、CHMP3、CHMP4和CHMP6等組成）和液泡蛋白分選蛋白4（VPS4）等5個復合物以及Bro1蛋白家族（ALIX、HD-PTPT等）組成［7］。ESCRT依賴機制產生MVB需要貨物聚集、膜內陷、貨物運輸至新生囊泡以及囊泡頸分裂4個步驟，ESCRT參與了全過程［8］。首先通過HRS：STAM（ESCRT-0）和相關的接頭將貨物聚集在內體膜上［7］。要想完成這一過程需要先將貨物蛋白進行泛素化，然后把HRS：STAM接頭通過HRS網格蛋白綁定盒連接到內體膜并形成蛋白質網絡，最后通過接頭捕獲泛素化的貨物蛋白完成聚集［9］。除上述接頭外，ESCRT-I中VPS27、MVB12的C末端結構域和ESCRT-Ⅱ的EAP45 GLUE域也可與泛素化蛋白結合［10］幫助貨物聚集。完成聚集后，HRS：STAM 的 HRSPASP 基序招募 TSG101［11］，形成ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ復合體，使聚集的貨物定位至芽頸部并且負責背負泛素化蛋白和含有PT/SAP基序的蛋白到腔內囊泡［12］。在貨物運輸過程中，ESCRT-Ⅰ的VPS28的C末端結構域招募ESCRT-Ⅱ形成復合體，負責膜彎曲出芽和貨物的封存，并將ESCRT-0泛素結構域募集到芽體中，在芽頸部組織ESCRT 復合物的組裝［8，13］。隨后 ESCRT-Ⅲ被 ESCRT-Ⅱ或ALIX招募，輔助ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ復合體完成貨物封存，并通過VPS4復合體催化膜的分裂和因子的循環(huán)，最終形成 MVB［7-8］。此外，Syndecan-Syntenin-ALIX機制控制著約50%的外泌體生物發(fā)生。這一機制是通過定位于細胞膜的多配體聚糖（Syndecan）作用于其胞質受體Syntenin，并通過Syntenin的LYPXnL基序與ALIX結合，招募ALIX至胞內囊泡，刺激腔內囊泡形成和外泌體生物發(fā)生，是CD63陽性的腔內囊泡萌發(fā)必需條件［14］。

ESCRT機制并不唯一，因為多個實驗室發(fā)現(xiàn)ESCRT機制被抑制后外泌體生物發(fā)生無實質性降低［15］?？偨Y目前報道的其他產生途徑，把他們均歸入ESCRT非依賴機制。ESCRT非依賴機制中神經酰胺（nSMase）途徑報道最多。研究蛋白脂蛋白（PLP）在Oli-neu細胞的膜轉運機制發(fā)現(xiàn)，PLP不依賴于ESCRT進入內體。而nSMase抑制劑，如GW4869，可顯著減少外泌體和PLP的釋放，提示神經酰胺可產生另一類不被運往溶酶體，而作為外泌體分泌的腔內囊泡［16］。這一觀點在其他研究中被證實。如巨噬細胞通過外泌體向樹突狀細胞進行抗原遞呈［17］，供體細胞miRNA的轉運［18］，都部分依賴于神經酰胺途徑。在神經酰胺途徑中，它分解產生的神經酰胺代謝物鞘氨醇1磷酸（S1P）被抑制后阻斷了神經酰胺誘導的CD63外泌體的分泌，而不減少外泌體的分泌的數(shù)量，證實了S1P在腔內囊泡的貨物分選中起著關鍵作用［19］。除神經酰胺途徑外，在人類黑色素瘤細胞中CD63直接參與前黑素小體蛋白（PMEL）的ESCRT非依賴性分選，而CD63抑制后PMEL以ESCRT依賴的方式進行降解［20］；在人胚腎293細胞（HEK293），CD82和CD9促進裝載β-連環(huán)蛋白的外泌體排出［21］；在胰腺癌中通過四旋蛋白8募集特定的蛋白和mRNA到外泌體［22］。這些機制均被發(fā)現(xiàn)是非依賴ESCRT的外泌體形成途徑。但無論通過抑制哪種產生途徑，都不能完全消除外泌體的產生［15］。這提示，同一種細胞有多種產生MVB的途徑，同一個MVB會同時存在不同途徑來源的腔內囊泡。此外，也有研究報道了在同一種細胞存在不同的MVB亞群，通常會與溶酶體結合而降解，而一部分會與質膜結合進行胞吐，將外泌體釋放入細胞外空間［23］。

3 外泌體內容物的組裝

外泌體內有核酸（包括miRNA、IncRNAs、mRNAs、DNA）、脂質、蛋白質等，其內容物的攝取可能經過精細的調控。相對于細胞和微囊，外泌體富含特定的RNA種類［24］。關于RNA如何被選擇性的裝載到外泌體，目前文獻報道可能與以下幾種方式相關。RNA誘導沉默復合物（RISC）參與miRNA和miRNA-mRNA復合物在外泌體中的分泌［25］。RISC的關鍵組件Argonaute 2（Ago2）的水平和Ago2磷酸化都控制著特定miRNA分泌到外泌體中，并受KRASMEK-ERK通路的調節(jié)［26］。除RISC之外，其他蛋白也可將特定蛋白的RNA裝載至外泌體中。如主穹窿蛋白在腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)可將miR-193a裝載入外泌體排出而減少了其在細胞質中的濃度，這有利于腫瘤細胞的生長［27］；人ELAVL蛋白在饑餓應激反應期間控制miR-122向外泌體中的運輸；RNA Y盒結合蛋白1在分選小非編碼RNA（tRNA、Y-RNA、Vault-RNA、miRNA）到外泌體中發(fā)揮作用。上述報道可見外泌體RNA的分選依賴于某些特定的蛋白，這些蛋白如何從眾多的RNA中識別需要分選的RNA目前還不清楚，但在上述報道中提示可能與RNA的修飾和特定的基序相關。部分RNA分選到外泌體已被證實需要依靠特定基序，如在原代T淋巴母細胞中，異質性胞核核糖核蛋白A2B1通過識別特定的miRNA基序將miRNA載入外泌體中，而SYNCRIP蛋白與另一種外泌體特定miRNA基序結合將裝載到外泌體中，并且上述兩種蛋白對靶向的miRNA具有專一性。此外，有研究通過對人類B細胞外泌體RNA進行測序發(fā)現(xiàn)，3'端尿苷化的miRNA在外泌體中富集［28］。研究均證明靶向外泌體的RNA具有特定的序列。因此，通過對RNA的修飾或具有特定的RNA基序是RNA靶向外泌體的關鍵。除RNA外，DNA也存在于外泌體中，包含線粒體DNA、單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、逆轉錄轉座子RNA轉錄體等，但其分選入外泌體的具體機制尚不清楚。

上文已提到泛素化或含有PT/SAP基序的蛋白可通過ESCRT載入外泌體。除此外，通過低聚物寡聚化（或稱為高階寡聚化）和質膜結合的方式也可以將蛋白靶向到外泌體中，并且用抗體誘導細胞表面蛋白高階寡聚化和添加質膜錨給高度寡聚的胞質蛋白兩個獨立的實驗進行了驗證［29］。有研究進一步證實了這一結論，并且發(fā)現(xiàn)了多種質膜錨，但出芽率存在較大差異。其中二磷酸和肉豆蔻酰化最高，同時還發(fā)現(xiàn)內體膜錨并不能將蛋白質靶向外泌體和微囊中［30］。此外，許多外泌體蛋白均是與膜相關、高階化、同源寡聚和（或）異源寡聚的蛋白復合物，如四跨膜蛋白（如CD63、CD81、CD9）、逆轉錄病毒Gag蛋白、ESCRT機制蛋白、多種支架蛋白等［12］。外泌體還富含膽固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和磷脂酰絲氨酸，并且脂質參與了外泌體的結構組成，在外泌體的形成和釋放中也發(fā)揮重要作用［31］。

目前研究可見外泌體不僅通過MVB與質膜融合釋放，也可以通過質膜直接產生，并且某些細胞還可能有特殊的產生途徑。外泌體內容物組裝的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質和核酸需具備特定的條件，才可以裝載入外泌體中。這些研究為進一步向外泌體裝載特定的貨物提供了依據。外泌體生物發(fā)生機制的研究雖未明了，但對于它功能的研究已經全面展開。外泌體的通訊功能已被發(fā)現(xiàn)參與多種生理病理過程，例如免疫調節(jié)、血管生成、止血、凝血、癌癥、細菌病毒感染等。有多項研究通過提取尿液、血液中的外泌體進行內容物分析后發(fā)現(xiàn)其中的miRNA、circRNA、mRNA等分子具有顯著的表達差異，但仍需要大樣本實驗數(shù)據支持。外泌體可以作為載體，通過定向改造進行大分子遞送和基因組修飾來發(fā)揮治療作用，這將是一場革命。對外泌體發(fā)生作用機制的深入理解，將有助于外泌體的分離提純、靶向、改造等多方面的應用。