胰腺癌差異表達(dá)基因的篩選及其功能分析

田莉，胡月明

唐山中心醫(yī)院病理科，河北唐山063000

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、易早期轉(zhuǎn)移、病死率高等特點(diǎn)，患者5年存活率＜5%。2018年全球新發(fā)胰腺癌病例和死亡病例分別為45.89萬人、43.22萬人［1］；中國癌癥中心發(fā)布的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示2015年我國胰腺癌發(fā)病率為6.92/10萬、死亡率為6.16/10萬［2］。目前胰腺癌的干預(yù)手段包括手術(shù)、化療、放療等，但臨床療效欠佳［3］。超過90%的胰腺癌患者會(huì)發(fā)生KRAS突變，70%的患者會(huì)發(fā)生TP53錯(cuò)義突變。研究顯示，突變型KRAS與p53蛋白之間存在依賴于GTP酶激活蛋白（GAP）的異常剪接和膜定位的通路；TP53通過RNA剪接蛋白hnRNPK介導(dǎo)的通路對(duì)GAP異常剪接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而促使TP53與KRAS突變協(xié)同促癌［4］。近年來，基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展極大地促進(jìn)了惡性腫瘤的分子診斷及分型的進(jìn)步，亦有利于探索胰腺癌的分子機(jī)制和尋找潛在生物學(xué)標(biāo)志。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)和資料，尋找胰腺癌的差異表達(dá)基因（DEG），并對(duì)DEG進(jìn)行功能分析和通路富集分析，以期尋找胰腺癌核心基因和潛在藥物作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的來源 通過美國國家生物技術(shù)信息中心公共基因芯片（GEO）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因芯片篩選。以“pancreatic cancer”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索胰腺癌患者臨床標(biāo)本，檢索時(shí)間：2000年1月—2021年4月，獲得GSE15471［5］、GSE62165［6］兩個(gè)數(shù)據(jù)集，剔除重復(fù)標(biāo)本，兩個(gè)數(shù)據(jù)集均有胰腺癌組織樣本和正常胰腺組織樣本，共納入157例胰腺癌組織樣本和52例正常胰腺組織樣本。

1.2 DEG的篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫的GEO2R在線工具分析GSE15471、GSE62165，篩選符合條件的DEG。篩選條件：校正后P＜0.05；|log FC|＞1.5，F(xiàn)C為差異倍數(shù)。同時(shí)滿足以上2個(gè)條件的基因?yàn)镈EG。通過Venny2.1在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）對(duì)篩選出來的DEG進(jìn)行映射，找出共同數(shù)據(jù)，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.3 DEG的功能和信號(hào)通路富集分析 用在線工具 DAVID（version 6.7，http：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因本體（GO）功能分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，明確DEG在胰腺癌發(fā)生中的作用。GO功能分析將DEG功能注釋分生物過程、細(xì)胞組分和分子功能；KEGG通路富集分析對(duì)DEG作用機(jī)制和信號(hào)通路進(jìn)行總結(jié)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建和基因模塊分析在 STRING（http：//string-db.org）和 Cytoscape（version 3.6.0）軟件中繪制關(guān)于DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并處理為可視化網(wǎng)絡(luò)圖。用Cytoscape3.6.0生物信息學(xué)軟件平臺(tái)的插件MCODE工具對(duì)構(gòu)建的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，篩選出核心蛋白質(zhì)簇和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白。MCODE選擇標(biāo)準(zhǔn)：MCODE scores＞10，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k-score=2。將篩選的核心基因利用cBioPortal網(wǎng)站繪制Kaplan-Meier法生存曲線，以明確核心基因與患者預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 DEG篩選結(jié)果 GSE15471數(shù)據(jù)集納入78例組織樣本，分析得到708個(gè)DEG，其中表達(dá)上調(diào)基因625個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因83個(gè)；GSE62165數(shù)據(jù)集納入131例組織樣本，分析得到1 943個(gè)DEG，其中表達(dá)上調(diào)基因1 386個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因557個(gè)。對(duì)兩組DEG進(jìn)行映射，明確548個(gè)為共表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)基因476個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因72個(gè)。

2.2 GO功能分析結(jié)果 對(duì)548個(gè)DEG進(jìn)行GO功能分析，相關(guān)數(shù)據(jù)可分為生物過程、細(xì)胞組分、分子功能等三類，篩選P＜0.05的結(jié)果有38條。生物過程：膠原蛋白分解代謝過程、細(xì)胞黏附、膠原纖維組織、細(xì)胞外基質(zhì)分解、內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)節(jié)、內(nèi)胚層細(xì)胞分化、骨骼系統(tǒng)開發(fā)、免疫應(yīng)答、白細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)；細(xì)胞組分：細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)、胞外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、基底膜、血小板α顆粒管腔、質(zhì)膜；分子功能：包括與肝素結(jié)合、與膠原結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、與鈣離子結(jié)合、與整合素綁定、與血小板衍生生長因子結(jié)合、與蛋白多糖結(jié)合等。

2.3 KEGG通路富集分析結(jié)果P＜0.05篩選得到的結(jié)果有18條。包括ECM受體作用、蛋白質(zhì)消化吸收、PI3K-Akt信號(hào)通路、吞噬體、血小板活化、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)膜遷移、癌癥相關(guān)通路、細(xì)胞因子-受體相互作用、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、胰腺分泌物等。

2.4 PPI的構(gòu)建和核心基因生存分析結(jié)果 構(gòu)建548個(gè)DEG的PPI，有67個(gè)屬于核心基因，分別屬于2個(gè)子簇（得分≥10）。子簇A包含30個(gè)節(jié)點(diǎn)、241條邊；子簇B包含37個(gè)節(jié)點(diǎn)、272條邊。其中節(jié)點(diǎn)度排名前6的核心基因：FN1（節(jié)點(diǎn)度=138）、MMP2（節(jié)點(diǎn)度=97）、PTPRC（節(jié)點(diǎn)度=80）、ITGAM（節(jié)點(diǎn)度=77）、COL1A2（節(jié)點(diǎn)度=76）、COL3A1（節(jié)點(diǎn)度=71）。見圖1。對(duì)6個(gè)核心基因進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)將胰腺癌患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。FN1高表達(dá)組中位生存時(shí)間（19.77個(gè)月）短于低表達(dá)組（22.80個(gè)月），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.029）；MMP2高表達(dá)組中位生存時(shí)間（11.13個(gè)月）短于低表達(dá)組（13.13個(gè)月），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.011）。PTPRC、ITGAM、COL1A2、COL3A1高表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為19.87、19.87、19.73、19.77個(gè)月，低表達(dá)組中位生存時(shí)間分別為24.6、22.8、22.0、35.3個(gè)月，比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

圖1 核心基因的PPI圖

3 討論

近年來，隨著DNA、RNA測序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于胰腺癌的分子分型展開了較多的探索，以期開展胰腺癌的精準(zhǔn)治療。COLLISSON等［7］根據(jù)臨床胰腺癌組織標(biāo)本和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)基因組學(xué)分析的結(jié)果，將胰腺癌區(qū)分為經(jīng)典型、類間充質(zhì)型和外分泌樣型，對(duì)臨床和預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。其中經(jīng)典型的GATA6、KRAS等黏附基因及上皮細(xì)胞相關(guān)基因多處于高表達(dá)狀態(tài)；類間充質(zhì)型的TWIST1、CAV1存在異常表達(dá)的狀態(tài)；而外分泌樣型的消化酶基因高表達(dá)。有研究將胰腺癌患者區(qū)分為基底樣A型、基底樣B型、混合型、典型性A型、典型性B型等5個(gè)類型［8］。但可應(yīng)用于的胰腺癌分子分型及發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步進(jìn)行探索。

本研究共納入157例胰腺癌組織和52例正常胰腺組織，進(jìn)行相關(guān)分析后明確了548個(gè)DEG，其中大部分呈高表達(dá)狀態(tài)（476個(gè)），低表達(dá)基因較少（72個(gè)）。在548個(gè)DEG中有PTPRC、ITGAM、COL1A2、COL3A1、FN1、MMP2共6個(gè)核心基因。PTPRC具有編碼蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的作用，被公認(rèn)是T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑，在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)狀態(tài)，但其在胰腺癌中的研究較少［9］。ITGAM位于染色體16p11.2，編碼白細(xì)胞黏附分子β2，具有介導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞向炎癥局部遷移和聚集的作用，亦與腫瘤細(xì)胞的早期侵襲和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。研究表明，處于異常表達(dá)狀態(tài)的ITGAM對(duì)于調(diào)控髓源性免疫細(xì)胞遷移到腫瘤微環(huán)境具有重要作用，影響腫瘤患者的整體生存期和預(yù)后［10-12］。COL1A2、COL3A1屬于膠原蛋白基因家族，其家族構(gòu)成了細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在細(xì)胞黏附、固定、遷移中具有重要作用，在胰腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲中亦具有重要作用［13］。Ⅰ型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最豐富的膠原蛋白，根據(jù)α1（Ⅰ）鏈和α2（Ⅰ）鏈構(gòu)成的不同可分為兩個(gè)亞型。COL1A2編碼Ⅰ型膠原的α2（Ⅰ）鏈，在乳腺癌、頭頸部癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，COL1A2通過與microRNA相互作用，可直接在胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)異種移植進(jìn)程中發(fā)揮作用［15］。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)比較了胰腺癌患者、胰腺良性病變患者和健康人群血清COL6A3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者的COL6A3蛋白水平顯著升高，高COL6A3血清水平與神經(jīng)周浸潤、吸煙等因素相關(guān)，并證明循環(huán)COL6A3在胰腺癌診斷中有潛在臨床價(jià)值［16］。以上研究均顯示PTPRC、ITGAM、COL1A2、COL3A1參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展；但本研究顯示PTPRC、ITGAM、COL1A2、COL3A1與生存時(shí)間無關(guān)?？紤]以下原因：上述基因與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，但胰腺癌發(fā)生發(fā)展由多因素引起，上述基因與生存時(shí)間無必然的因果關(guān)系；進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，上述基因高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的生存時(shí)間亦存在不同，僅表現(xiàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差異，可考慮進(jìn)一步對(duì)腫瘤分期、性別、年齡等因素進(jìn)行分層分析，但因局限于數(shù)據(jù)來源于公共數(shù)據(jù)庫，難以在本文中開展探索；上述相關(guān)研究多從細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面開展，具體在臨床病例中亦存在差異。

本研究對(duì)篩選出來的6個(gè)核心基因進(jìn)行生存相關(guān)的Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示FN1和MMP2的高表達(dá)與胰腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。FN1是一種以二聚體或者多聚體的形式存在于細(xì)胞表明或細(xì)胞外基質(zhì)中的糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，在細(xì)胞黏附、遷移、生長和分化中起重要作用［17-18］。FN1可通過與整合素受體 α5β1結(jié)合激活PI3K/Akt信號(hào)通路，在食管癌、鼻咽癌、卵巢癌等多種腫瘤中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，65.7%的胰腺癌患者間質(zhì)細(xì)胞中FN1蛋白表達(dá)升高，F(xiàn)N1陽性的患者存活率明顯降低［20］。研究表明，F(xiàn)N1高表達(dá)與吉西他濱干預(yù)胰腺癌的耐藥性相關(guān)，腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞能夠分泌攜帶FN1蛋白的囊泡，F(xiàn)N1通過ERK信號(hào)通路引起胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥，采用FN1抑制劑可顯著逆轉(zhuǎn)吉西他濱的耐藥［21］。FN1在胰腺癌中處于異常表達(dá)狀態(tài)［22］，本研究亦發(fā)現(xiàn)FN1高表達(dá)與患者預(yù)后不良具有相關(guān)性。此外，MMP是一類具有裂解細(xì)胞外基質(zhì)底物能力的內(nèi)源性蛋白水解酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性及促進(jìn)微血管新生的作用，參與癌細(xì)胞的遷移、侵襲等病理過程，可分為MMP1、MMP2、MMP9、MMP11等20多個(gè)亞型［23-24］。MMP-2在胰腺癌組織中高表達(dá)，與胰腺癌患者術(shù)前血清CA19-9水平升高、組織學(xué)分級(jí)差淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移神經(jīng)周浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)［25］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，MMP2高表達(dá)組的中位生存時(shí)間短于低表達(dá)組。

綜上所述，PTPRC、ITGAM、COL1A2、COL3A1、FN1、MMP2參與胰腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，有望成為胰腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。本研究為胰腺癌的精準(zhǔn)治療提供了一定的思路和方向，但上述結(jié)果尚需通過臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。