基于細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)基因肝細胞癌預后模型的構(gòu)建及功能分析

葉必成，繆夏曄，劉樹青

1徐州醫(yī)科大附屬淮安醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇淮安223001；2揚州大學醫(yī)學院

肝癌全球發(fā)病率在惡性腫瘤中居第六位，是腫瘤相關(guān)死亡的第四大原因［1］。肝細胞癌（HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌，早期HCC患者的主要治療手段為外科手術(shù)切除，然而大部分患者在診斷時已為晚期，其對應的治療手段非常局限，因此預后極差。對于HCC患者預后的預測及治療方案的確定，臨床通常用AJCC分期、肝功能指標及AFP進行評估［2-3］，然而相同分期的HCC患者預后也可能不同，且分子遺傳學也證明不同亞群的HCC患者預后有差異［4］。因此，有必要探尋一種新型的生物學標志物以有效評估HCC患者預后。CTL作為T細胞的重要組成部分，其表面受體主要為CD8，是抵抗腫瘤進展的主要免疫細胞［5］。先前一項研究通過規(guī)律間隔成簇短回文重復序列在小鼠癌細胞株（腎癌、乳腺癌、黑色素細胞瘤、結(jié)直腸癌）中確定了182個與CTL相關(guān)的基因（CRG），CRG增強或減弱了CTL對癌細胞的殺傷［6］。然而，CRG在HCC中的作用尚未被系統(tǒng)研究。本研究旨在觀察CRG在HCC的表達情況以及探索其與預后的關(guān)系，并基于這些基因構(gòu)建預后預測模型，以期有助于評估患者預后及臨床精準化治療。

1 資料與方法

1.1 資料來源 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下載371例HCC患者共424個樣本（包含50個癌旁樣本）的資料，其中3例HCC組織重復測序2次。下載時間：2017年6月—2021年1月。排除生存時間為0患者6例，共納入HCC患者365例。患者男246例、女119例；年齡16～90歲，中位年齡61歲；腫瘤分級G1級55例、G2級175例、G3級118例、G4級12例、未知5例；腫瘤分期Ⅰ期170例、Ⅱ期84例、Ⅲ期83例、Ⅳ期4例、未知24例；存在血管浸潤106例、無血管浸潤205例、未知54例；AFP≤200 ng/mL 201例、AFP＞200 ng/mL 75例、AFP未知89例。

從ICGC（https：//dcc.icgc.org/projects/LIRI-JP）下載231例HCC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床資料，用作模型驗證。下載時間：2019年3月—2021年1月。該隊列患者未存在重復測序以及生存資料缺失，既往有乙型肝炎或丙型肝炎病史。患者男170例、女61例；年齡31～89歲，中位年齡69歲；腫瘤分期Ⅰ期36例、Ⅱ期105例、Ⅲ期71例、Ⅳ期19例。對于重復測序的HCC組織，取其基因表達譜數(shù)據(jù)的平均值。若有多個探針對應同一個基因，則該基因的表達量為這些探針的均值。以上數(shù)據(jù)均為公開數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達CRG的篩選 應用“base”R軟件包中的“wilcox.test”函數(shù)對371例HCC組織和50例癌旁組織的CRG進行表達差異分析，篩選標準：錯誤發(fā) 現(xiàn) 率（FDR）＜0.05且|log2Fold Change|≥1，F(xiàn)oldChange為差異倍數(shù)。

1.3 與總生存期（OS）相關(guān)CRG的篩選 將具有生存信息的365例HCC患者與各個CRG的表達數(shù)據(jù)進行合并，并用“base”R軟件包中的“coxph”函數(shù)對CRG進行基于OS以及生存狀態(tài)的單因素回歸分析，計算各個CRG的P值以及風險比（HR），P＜0.05為與OS相關(guān)CRG。

1.4 預后預測模型的構(gòu)建與驗證 利用R軟件“base”包中的“intersect”函數(shù)確定既為差異表達又與OS相關(guān)的CRG，并使用“glmnet”R軟件包中的“glmnet”函數(shù)和“cv.glmnet”函數(shù)對這些基因進行基于OS以及生存狀態(tài)的Lasso-Cox回歸分析，其中maxit=1 000。計算經(jīng)Lasso-Cox回歸所確定的各個基因的系數(shù)，并乘以這些基因?qū)谋磉_水平，所得結(jié)果之和為風險評分。以風險評分的中位數(shù)為截斷值，將TCGA隊列以及ICGC隊列的患者分為高危組和低危組。利用“survival”包的“survdiff”對高、低危組患者進行基于Kaplan-Meier法的生存分析，并進行Log-rank檢驗評估兩組的預后差異。利用“Rtsne”的“prcomp”和“Rtsne”函數(shù)對Lasso-Cox回歸所確定的基因進行PCA及t-SNE分析，以探索高、低危組患者分布情況。利用“timeROC”R軟件包的“timeROC”函數(shù)進行時間相關(guān)的ROC曲線分析，計算曲線下面積（AUC）。

1.5 基因本體（GO）富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析及單樣本基因集富集分析（ssGSEA） 利用“clusterProfiler”R軟件包的“enrichGO”函數(shù)以及“enrichKEGG”函數(shù)對TCGA隊列的高、低危組之間的差異表達基因進行GO以及KEGG富集分析，其中GO富集分析包括生物學過程（BP）、細胞組成（CC）以及分子功能（MF）。利用“gsva”R軟件包的“gsva”函數(shù)對TCGA隊列的高、低危組進行ssGSEA，以量化免疫細胞浸潤及免疫相關(guān)功能激活情況。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用R4.0.2軟件。差異表達基因（DEG）的鑒定采用Wilcoxon檢驗，并用BH法對P值進行矯正，篩選標準為FDR＜0.05且|log2 Fold Change|≥1。如上文無特殊規(guī)定，則P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 與OS相關(guān)的差異表達CRG 共篩選出37個與OS相關(guān)的差異表達DRG。見圖1。

圖1 與OS相關(guān)差異表達CRG的篩選

2.2 基于TCGA隊列建立預后模型 Lasso-Cox回歸將上述37個DRG進行再次篩選，并使用交叉驗證建立模型，最終建立了基于6個CRG（ATG10、HDAC1、PIGU、AHSA1、CAD、CEP55）的預后預測模型，其風險評分的計算公式為0.384×ATG10表達值+0.076×HDAC1表 達值+0.270×PIGU 表 達 值+0.153×AHSA1表達值+0.208×CAD表達值+0.169×CEP55表達值。

2.3 預后預測模型的外部驗證結(jié)果 上述公式計算ICGC隊列的風險評分，并以風險評分的中位數(shù)作為截斷值將ICGC隊列的患者分為高危組和低危組。考慮到OS超過5年的患者僅2例，因此僅評估該模型對患者術(shù)后1～4年生存率的預測價值。ROC曲線顯示，該模型對患者術(shù)后1～4年預后預測的曲線下面積分別為0.70、0.70、0.74、0.74。

2.4 GO富集分析、KEGG富集分析及ssGSEA結(jié)果

2.4.1 GO富集分析結(jié)果 差異表達的DRG在淋巴細胞介導免疫、補體激活、細胞吞噬、離子通道活性相關(guān)分子功能等生物學過程富集。見表1。

表1 GO富集分析結(jié)果（BP、CC及MF的前5位）

2.4.2 KEGG富集分析結(jié)果 差異表達的DRG基因在細胞因子-細胞因子受體的相互作用、細胞周期及部分癌癥通路顯著富集。見表2。

表2 KEGG富集分析（前10位）

2.4.3 ssGSEA結(jié)果 高危組活化的樹突細胞（aDC）、未成熟的樹突細胞（iDC）、漿細胞樣樹突細胞（pDC）、抗原提呈細胞共刺激（APC co-stimulation）、主要組織相容性復合體Ⅰ型分子（MHC class I）富集評分（0.62、0.61、0.72、0.98分）高于低危組（中位數(shù)分別為0.60、0.60、0.68、0.97分），比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；高危組Ⅰ型干擾素反應（Type I IFN Reponse）、Ⅱ型干擾素反應（TypeⅡIFN Reponse）、NK細胞富集評分（0.82、0.77、0.60分）較低危組（0.83、0.80、0.62分）低，高危組調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）富集評分（0.81分）較低危組（0.80分）高（P＜0.05），比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［7］。腫瘤微環(huán)境主要由癌細胞、基質(zhì)細胞、免疫細胞、趨化因子和細胞因子共同構(gòu)成［8］，其中CTL是抵抗腫瘤進展的主要免疫效應細胞。然而，由于癌細胞不具有很強的免疫原性，因此CTL在腫瘤微環(huán)境中是被抑制的［9］。目前已開發(fā)了諸如免疫檢查點抑制劑（PD-1、PDL-1和CTLA4）等免疫療法用于促進CTL特異性免疫應答，然而對于HCC患者，PD-1及PDL-1的有效應答率卻不到20%［10］。因此識別HCC中影響CTL功能的關(guān)鍵基因至關(guān)重要。本研究綜合分析182個CRG，最終篩選了6個與OS顯著相關(guān)的關(guān)鍵CRG，并基于CRG構(gòu)建了HCC預后預測模型。該模型對患者術(shù)后1～4年預后預測的曲線下面積均≥0.70。提示該模型具有良好的預測效能。

本研究發(fā)現(xiàn)，近30%的CRG在腫瘤組織與癌旁組織之間差異表達，單因素Cox回歸分析表明超過50%的CRG與OS相關(guān)，這進一步證明了CTL在HCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用。最終篩選出6個與預后相關(guān)的關(guān)鍵CRG，即ATG10、HDAC1、PIGU、AHSA1、CAD、CEP55。除AHSA1和CAD以外，均存在相關(guān)研究報道，這些基因在HCC中高表達，并且與OS相關(guān)，與本研究的發(fā)現(xiàn)一致。ATG10，位于5q14.1，是細胞自噬啟動的必要條件［11］。JO等［12］報道ATG10表達增加與血管侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。HDAC1是組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一，直接參與調(diào)控細胞自噬［13］。HDAC1的高表達促進了HCC細胞增殖并抑制HCC細胞凋亡［14］。PIGU是GPI-T復合物的一個重要亞基［15］，GPI-T復合物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。WEI等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，PIGU高表達不但促進了HCC細胞的增殖，遷移和侵襲，而且抑制了細胞凋亡。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，PIGU的下調(diào)顯著增強了NK-92細胞對HCC細胞的敏感性。AHSA1為HSP90的一個關(guān)鍵分子伴侶，參與致癌蛋白的成熟、穩(wěn)定、激活［17］，其與HSP90構(gòu)成的復合體也被證實是細胞自噬通路的關(guān)鍵蛋白［18］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，AHSA1在HCC中高表達，并且與OS顯著相關(guān)，其在HCC的具體生物學作用尚未明確，我們將進一步研究證實。CAD是一個具有三個酶結(jié)構(gòu)域的多肽，包括氨基甲?；姿岷铣擅?、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶及二氫乳清酸酶，為嘧啶從頭合成的關(guān)鍵酶［19］。CAD與腫瘤相關(guān)的報道較少，本研究首次發(fā)現(xiàn)，CAD在HCC中高表達，并且與OS相關(guān)。CEP55，又名C10orf3，為中心體蛋白相關(guān)蛋白家族成員，其主要生物學功能為中心體復制、細胞周期及胞質(zhì)分裂［20］。自噬蛋白 NBR1通過識別 CEP55，進而招募自噬相關(guān)蛋白形成自噬體。LI等［21］發(fā)現(xiàn)，CEP55通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT3-MMPs信號通路來促進HCC細胞遷移和侵襲。除PIGU和CAD以外，以上基因均有報道證明直接或間接參與細胞自噬，細胞自噬有助于癌細胞逃避CTL的攻擊［6］。本研究進一步證實，在HCC中細胞自噬通路介導CTL相關(guān)免疫逃避的關(guān)鍵性，也揭示了細胞自噬在HCC在發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而，對以上CRG在HCC中作用的了解仍然有限，其影響HCC預后的分子機制以及對HCC患者臨床治療的意義有待進一步研究。

為進一步探索高危組患者預后差的潛在機制，本研究基于TCGA隊列的高、低危組進行了GO富集分析、KEGG富集分析及ssGSEA。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)通路、離子通道以及一些癌癥通路顯著富集。研究證明離子通道在T細胞的穩(wěn)定與活化發(fā)揮重要作用［22］，這與本研究的發(fā)現(xiàn)一致。低危組和高危組的抗原提呈相關(guān)細胞及功能的富集得分存在顯著差異，表明腫瘤相關(guān)抗原在高危組更容易識別，但高危組患者預后更差，可能是與高危組的CTL功能下降有關(guān)。高危組的Tregs富集得分相對于低危組更高。Tregs顯著抑制CTL的功能，進一步證明了高危組的CTL功能被抑制。高危組的Ⅰ型干擾素反應、Ⅱ型干擾素反應及NK細胞富集得分較低危組低。因此，高危組患者抗腫瘤免疫力的減弱是其預后不良的主要因素。

綜上所述，本研究構(gòu)建的模型可有效預測HCC患者預后，有助于HCC患者預后預測體系的完善及臨床個體化治療方案的開發(fā)。