單核苷酸多態(tài)性在鵝育種上的應(yīng)用

楊 紅，郭徵力，葉 麗，王天松，沈 杰，郭 勇，楊遠青，曾姍姍，袁 建，王智偉

（1.畢節(jié)市畜牧站，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院∕高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025；3.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

當(dāng)同物種的任何兩個基因組進行比較時，99.9%是相同的。然而，動物擁有上億個堿基對的基因組，每個個體二倍體基因組中都有上百萬個差異。大多數(shù)差異是由于單堿基替代所形成的多態(tài)性，俗稱單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。雖然大多數(shù)SNP沒有生物學(xué)意義，但一小部分處于功能基因上的替換則具有各種不同的功能意義，是遺傳多樣性的基礎(chǔ)[1]。在經(jīng)濟動物的遺傳育種過程中，科研工作者們致力于使用一些可靠的遺傳標記來提高選擇效率與效能，提高經(jīng)濟效益，而SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致，但通常所說的SNP并不包括后兩種情況[2]，因此SNP可作為遺傳標記，用來追蹤染色體區(qū)域代代相傳的遺傳模式。且SNP在基因組中分布廣泛，平均每數(shù)百個堿基對就存在一個SNP[3]，對此，有必要開發(fā)高通量檢測多個樣本的基因型方法，來進一步進行性狀關(guān)聯(lián)分析，從而針對某一性狀進行改良。

鵝的品種有很多，但只有優(yōu)良的品種才有遺傳下去的必要性。而在眾多的優(yōu)良品種中，我國是擁有品種最多的三大國家之一。在鵝的品種分類中，將其分為兩類，第一類為伊犁鵝，其余的統(tǒng)稱為中國鵝。在中國的傳統(tǒng)文化中，將鵝稱作鴻雁，這是最古老的品種。在國內(nèi)的鵝，通常具有同樣的特征，但是也有例外的情況，例如伊犁鵝。由于中國地理面積廣闊，每個地方的生態(tài)環(huán)境有著很大的差距，同樣都是中國鵝，經(jīng)過長時間的生存和演變，進行了生態(tài)演變和人工選擇，形成了不同的地方品種，形成了多樣化的特征。在不同地方生長起來的中國鵝，差距十分懸殊，表現(xiàn)在體型外貌、生產(chǎn)性能等多個方面[4]。地方品種的鵝匯聚在一起，大約有30幾個種類，列入《中國畜禽遺傳資源志——家禽志》中，是一座鵝的天然“基因庫”[5]。中國鵝的種類之多，生存和演變的歷史悠久是任何國家都不能與之相比的，為鵝的優(yōu)秀品種遺傳提供了堅實的基礎(chǔ)。鵝的營養(yǎng)價值較高，鵝肉自身具有超高的營養(yǎng)價值和保健作用。鵝是一種食草的家禽，發(fā)展養(yǎng)鵝業(yè)符合我國畜牧業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整要求。面對如此大的市場，只要對鵝某一個重要性狀進行改良就可能帶來巨大的經(jīng)濟效益。

1 SNP的特性

近年來，人們對SNP的研究力度、范圍都在逐漸擴大，SNP自身所具備的一些優(yōu)良特性使得其在遺傳分析中成為一類能夠廣泛應(yīng)用的遺傳標記，能夠更加清晰地剖分研究復(fù)雜的數(shù)量性狀。

1.1 數(shù)量多、分布廣

無論是基因的編碼區(qū)還是非編碼區(qū)，都可能存在大量的SNP，即DNA 序列中任意一個核苷酸都有可能發(fā)生變異。據(jù)統(tǒng)計，人類基因組中每1 000個核苷酸就有一個SNP，其遺傳距離為2～3 cM，密度比微衛(wèi)星更高，這么高密度的分布，使得可以在待測基因的附近或內(nèi)部提供一系列的標記[6]。

1.2 代表性強

位于基因組內(nèi)部的某些SNP位點可能會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達水平產(chǎn)生直接的影響，從而引起機體的一系列變化。例如R.Kambadur 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，皮爾蒙特牛在MSTN 基因的第三外顯子上發(fā)生了G→A 的單堿基突變，導(dǎo)致了保守的半胱氨酸替換為酪氨酸，從而導(dǎo)致了雙肌隱性表型的顯示。毛海光[8]也發(fā)現(xiàn)鴿DGAT2、ADSL、FABP1和FABP3基因上一些單堿基的突變顯著影響了鴿屠體和肉質(zhì)性狀。

1.3 易實現(xiàn)快速、規(guī)?；瘷z測

SNP標記的檢測方式在傳統(tǒng)的簡單標記方式基礎(chǔ)上進行了技術(shù)的提升。在傳統(tǒng)的標記方法下，SNP基因標記需要消耗大量的時間，具有紛繁復(fù)雜的電泳步驟，消耗大量的金錢。而在新的標記技術(shù)下，實現(xiàn)了自動化檢測，只需要簡單的人工輔助，就可以大大地提升檢出率。SNP的基因組成比較簡單，通常是由兩部分組成，是等位基因的兩個組成部分[9-10]。由于結(jié)構(gòu)簡單，而在分析的過程中，僅需要判斷是這部分還是那部分就可以，非此即彼。在整體片段的分析過程中，無需對長度進行分析，減少了人工檢測的步驟，有利于自動化基因檢測和SNP基因篩選。

1.4 具有遺傳穩(wěn)定性

堿基C和T之間具有多個SNP鍵，而且具有固定的比例，通常為1∶2。SNP 具有甲基化過程，該過程發(fā)生在生物基因組中，CpG二核苷酸的胞嘧啶極易自發(fā)地脫去氨基從而形成胸腺嘧啶，在生物基因組中發(fā)生率較高[11]。SNP 與其他分子標記不同，其他分子基因標記為多核突變，而SNP基因標記是一種單核酸突變，由于突變發(fā)生很難，而突變率也十分低。該基因突變沒有任何的癥狀，與遺傳學(xué)的關(guān)系微乎其微，沒有不良性狀相關(guān)聯(lián)。因此，SNP標記屬于遺傳穩(wěn)定性高的遺傳變異。

1.5 易于基因分型

在動植物群體中,SNP標記可能由2個、3個或4 個等位基因構(gòu)成，但實際上后2 種情況出現(xiàn)的概率異常少見，常被忽略，故SNP標記一般只有兩種等位型的堿基組成，又由于具有等位基因性，所以在任何種群中其等位基因的頻率都便于估計[12]。

2 SNP的檢測方法

SNP的開發(fā)和利用是學(xué)者們研究的重點，而在開發(fā)之前，需要發(fā)現(xiàn)它并進行檢測。隨著科技的發(fā)展，SNP的檢測方法也在逐步完善。最初，主要是采用生物信息學(xué)的方法，只有了解已知位點，才能夠進一步檢測。而通常人們都是通過對DNA數(shù)據(jù)庫搜索和文獻查找的方式進行的，如文獻和NCBI 查找等，這種方式雖然簡單直接，但是不夠精準。有很多未知的SNP位點只有經(jīng)過試驗檢測才能夠找到。通過試驗研究可以得知，目前的SNP的基因分型方法有多種，被人們采用的至少有20種，而不同的方法具有各自的特點和優(yōu)缺點[13]，大致可以分成以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法和以高通量自動化為鮮明特點的新方法兩類。

2.1 RFLP法與PCR-RFLP法

限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）是一種查找方式，通過內(nèi)切酶的體內(nèi)反應(yīng)，進行限制性的切定。限制性內(nèi)切酶是一種具有特殊序列的酶，當(dāng)遇到反應(yīng)物時，可以對DNA 上特殊位點的序列進行切割。當(dāng)DNA 上有堿基突變時，會對限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生一定的反作用，甚至停止活動，因此突變和未突變個體間就會產(chǎn)生長度的多態(tài)性。對DNA 進行酶切后，立即進行電泳，DNA 就可以進行轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的過程中形成一定的支持物。這種支持物較多，常見的為尼龍膜。在轉(zhuǎn)移的過程中，進行特意標記性檢測，是一種雜交檢測，即可檢測到該限制酶位點上不同的等位基因[2]。

而基于聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymorase chain reac?tion,PCR）技術(shù)的出現(xiàn)，將PCR 與RFLP 聯(lián)用，又稱切割擴增多肽序列（Cleaved amplified polymor?phic sequence,CAPS），此法可僅對酶切產(chǎn)物進行電泳便可以對不同的等位基因進行區(qū)分。但是這個方法只能檢測到位于酶切位點處的SNP 位點，無法實現(xiàn)高通量檢測，具有一定的局限性。

2.2 SSCP法與PCR-SSCP法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single strand conformation polymorphism,SSCP），該方法是一種熱度變性法，當(dāng)溫度升高至95 ℃雙鏈DNA 進行變性解散，形成單鏈結(jié)構(gòu)。在這種結(jié)構(gòu)下，單鏈會形成二級結(jié)構(gòu)，堿基序列會發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不同。正是由于這種結(jié)構(gòu)的不同，可以通過對其在非變形聚丙酰胺凝膠中的遷移速度不同被檢測出來。最初的探針標記方法被稱作SSCP 法，這種方法需要酶切或探針標記。這種方式相對比較繁瑣。通過科技的改變，后來進行了技術(shù)升級。1989 年M.Orita等[14]將PCR 應(yīng)用到SSCP 中，獲得了一種新的檢測方式。這種檢測方式需要不同的信號，通常為單鏈信號，在單鏈信號下可以進行凝膠電泳分析。除了此方法之外，還可以自己對引物進行設(shè)計，設(shè)計完引物后，能夠在模具中進行PCR 擴增，對擴增后的片段進行簡易分析。據(jù)估計，此技術(shù)對于小于200 個堿基對的DNA 片段上堿基變異的檢出率為100%。當(dāng)要檢測的DNA片段較長是，檢出率會降低。SSCP 與PCR-SSCP 的優(yōu)越性在于不需要測序就可以快速檢出堿基突變，但缺陷是無法確定基因型[15]。

2.3 直接測序法

通過DNA 直接測序法，不同于其他檢測方式，這種方法相對比較直接，通過序列的檢測能夠直接檢測到突變的類型。通過直接測序能夠?qū)ζ湮稽c進行分型檢測，檢測后能夠立即得到SNP位點。當(dāng)檢測出來不同的基因片段后，能對不同的片段對比，當(dāng)發(fā)現(xiàn)相同基因后，會對其基因進行產(chǎn)物擴增，通常為PCR 擴增方式。在新的基因序列中，通過堿基檢測，能夠找到所有序列中的突變基因，然后進行檢測。在目前，所有方法中，這種方式是一種相對比較可靠的方式，檢出率可達100%。這種方式是一種擴增后進行純化的方式，先將其純化回收，然后對其進行連接，連接的方式相對比較穩(wěn)定，連接的載體更可純化回收。除此之外，也可以采用直接的方式對產(chǎn)物進行直接檢測或者測序。對不同的純合子，檢測的時候能對其進行測序檢測，但其對雜合體不易分型[16]。

2.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片（Genechip）又稱DNA 芯片，是一種基因微生物分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)需要堿基互補配對，是一種互補，也是一種微型生物分析。這是對DNA片段的集成分析，將片段集成到硅芯片或玻璃芯片表面。該技術(shù)是一種探針技術(shù)，將不同的DNA 片段進行連接，連接上熒光標記，在特殊技術(shù)的檢測中，能夠查看到芯片雜交和技術(shù)。如果當(dāng)DNA 片段中具有堿基突變，則不能與探針結(jié)合，但是能夠通過弱熒光來檢測到雜交的信號。與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片的準確率高，而且質(zhì)量相對上乘，一次查找可以對成千上萬個SNP位點進行篩查，可以通過網(wǎng)絡(luò)技術(shù)進行自動化分析，但是相對的開發(fā)成本很高[17]。

2.5 高分辨率熔解曲線

高分辨率熔解曲線（High resolution melting，HRM）是一種檢測SNP位點新手段。目前，HRM是一種應(yīng)用廣泛的技術(shù)，是檢測SNP技術(shù)中的一種先進方式。主要是一種物理的檢測熔解方式，當(dāng)熒光染色與雙聯(lián)DNA 結(jié)合，能夠產(chǎn)生減色效應(yīng)，尤其是當(dāng)溫度升高的時候減色效率提高。在檢測熔解過程中，通過檢測的系統(tǒng)軟件能夠釋放和查看出特征熔解曲線。在對其熔解曲線進行分析的時候，進而實現(xiàn)SNP 的檢測[18]。SNP 位點上的堿基類型和數(shù)目不同，則曲線的類型不同，呈現(xiàn)出來的峰值也不同。HRM 技術(shù)具有快速、靈敏、高效、高通量、低成本等特點，較適用于基因型相對不多但樣品量極大的研究。

3 SNP在鵝類育種上的應(yīng)用

SNP是指在基因組上由單個核苷酸變異引起的DNA 序列多態(tài)性，DNA 序列直接影響氨基酸密碼子的轉(zhuǎn)錄，從而影響分子水平上蛋白質(zhì)的翻譯。目前，可以通過數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait locus,QTL）作圖對基因進行性狀連鎖分析，還可以對候選基因利用各種方法與單核苷酸變異的位點進行關(guān)聯(lián)分析。如果找到了與目的性狀有關(guān)的SNP位點，便可通過芯片篩選個體，并進行優(yōu)缺點分析，最后通過雜交、回交等改良品種[9]。

近10 年來，相當(dāng)多的學(xué)者利用該方法在鵝的育種工作上進行努力。2010 年，張高娜等[20]運用PCR-SSCP 法在揚州鵝的PRL 基因1 號外顯子+11處發(fā)現(xiàn)了一處G→T 突變，研究發(fā)現(xiàn)該突變產(chǎn)生的基因型對產(chǎn)蛋量及開產(chǎn)日齡影響極顯著。2011年，徐晶等[21]運用同種方法發(fā)現(xiàn)吉林白鵝的半凈膛重、肝臟重、腿肉重與其IGFⅡ基因外顯子3 上的一處A→T 突變所產(chǎn)生的基因型差異顯著。同年，趙興濤等[22]對五龍鵝FSHβ、PRL 基因和GnRH 基因進行研究，在FSHβ 基因外顯子3 上發(fā)現(xiàn)一個C→T突變，但與生長性狀并無相關(guān)；GnRH基因的5'調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)了T→A 突變，同樣與生長性能無關(guān)；在PRL基因內(nèi)含子2第38∕39位上發(fā)現(xiàn)了GA缺失，并發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的基因型與產(chǎn)蛋總量顯著相關(guān)[22-24]。袁樹楷等[25]運用PCR-SSCP 在PRL 基因的研究中發(fā)現(xiàn)，四川白鵝與朗德鵝在1號外顯子均有一處突變，但四川白鵝為65位的C→T突變，而朗德鵝為141 位的T 缺失，分析其原因為品種差異。趙文明等[26]在2012年對三種鵝種的GH基因進行研究，均在第二與第四外顯子發(fā)現(xiàn)兩處突變，且第二外顯子突變的基因型效應(yīng)與周齡體重有極顯著相關(guān)。2014年，張蕊等[27]利用直接測序法對朗德鵝的CYP2C45 基因進行研究，在第五與第七外顯子分別發(fā)現(xiàn)2個突變，發(fā)現(xiàn)第五外顯子上的突變所產(chǎn)生的基因型與屠體重差異顯著相關(guān)。2016 年，劉杰等[28]利用朗德鵝、獅頭鵝、皖西白鵝、浙東白鵝四個鵝種的DNA 構(gòu)建DNA 池，并用直接測序法尋找四個鵝種MLPH基因的潛在SNP，最終在外顯子11 上發(fā)現(xiàn)兩個突變，但并未與性狀進行關(guān)聯(lián)分析。同年，胡彥競科等[29]同樣構(gòu)建四川白鵝、籽鵝的DNA 池，用以研究GnIH 基因的SNP 與產(chǎn)蛋量的關(guān)系，在內(nèi)含子1及外顯子3上發(fā)現(xiàn)兩處堿基突變，并且外顯子3的突變所產(chǎn)生的基因型與產(chǎn)蛋量具有顯著相關(guān)。2017 年，與張蕊同團隊的王倩繼續(xù)了CYP2C45 基因的研究，不同的是她運用的是PCRSSCP 法，且只研究了啟動子區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5'上游-93 bp處發(fā)現(xiàn)一處C→T突變，該突變產(chǎn)生的基因型同樣與屠體重差異顯著相關(guān)[30]。2019年，王猛等[31]用直接測序法探究了IGFBP5 基因與鵝肥肝的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了啟動子上游的三個SNPs，其中兩個與鵝肝重，差異顯著相關(guān)。

綜上所述，目前在鵝的SNP研究中，PCR-SS?CP 法與測序法是目前主流的檢測方法。目前的研究著重于生長指標與繁殖性能的研究，很多學(xué)者都為其提供極有價值的輔助遺傳標記。鵝絨也是特別重要的一項經(jīng)濟性狀，但目前對于鵝絨的研究還較少。SNP作為一種分子標記、在鵝的育種方面有著極大的輔助作用，可依據(jù)該法檢測出的突變位點作為鵝選育的輔助遺傳標記、表型篩選，加快選育過程，指導(dǎo)育種實踐，從而獲得理想的經(jīng)濟性狀。

4 小結(jié)與展望

近年，隨著我國的科技不斷發(fā)展，DNA 分子標記技術(shù)也不斷發(fā)展，在實際生產(chǎn)中，分子標記輔助育種是一種新的育種方式，在社會發(fā)展過程中起著越來越重要的作用。該方法主要是利用分子標記密切相關(guān)，除此之外，與目標形狀也有著直接的聯(lián)系。在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)中，在檢測中標記的數(shù)目少，受到環(huán)境的影響較大，而該方式克服了這些問題，及時在形態(tài)學(xué)標記數(shù)目少的時候也能夠進行精準地檢測。且可以在育種早期實施性狀鑒定，大大縮短育種周期，降低育種成本。

SNP 作為新一代分子標記技術(shù)，因其數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定性高、易于自動化分型等諸多優(yōu)點，引發(fā)了廣大研究者的濃厚興趣，新的高通量檢測方法也不斷被開發(fā)出來，SNP分型檢測的方法也在不斷進步。未來，SNP的分型檢測方法可能會向以下趨勢發(fā)展：1）操作簡便，可實現(xiàn)自動化；2）通量大且靈活，可根據(jù)需要加以選擇；3）分析速度快，數(shù)據(jù)便于處理；4）適應(yīng)性強，對不純樣品也可進行可靠分析；5）結(jié)果可靠，費用適中；6）高可信度和大數(shù)據(jù)量的數(shù)據(jù)庫的建立。然而，目前的檢測方法都有其優(yōu)點，也都存在著缺點，還不能完全滿足以上要求。

目前，SNP發(fā)展已經(jīng)相對比較穩(wěn)定，但是并沒有大規(guī)模地應(yīng)用，目前發(fā)展過程中還存在著一定的挑戰(zhàn)：在遺傳育種檢測中，同一個性狀往往不是由一個基因所決定的，而是由多個基因共同決定，所以要通過進一步確定相關(guān)位點之間的關(guān)系，最終決定其相關(guān)性與顯著性，從而獲得理想的經(jīng)濟性狀；在動物品種鑒定及產(chǎn)品溯源方面，由于各研究樣本群體遺傳背景不同，不同群體間位點的適用性還有待進一步考察，要想獲得理想的普遍適合的標記組合，還需通過不斷完善標記的篩選策略及擴大代表性群體的數(shù)量來實現(xiàn)。不過，隨著研究的不斷深入、相關(guān)領(lǐng)域數(shù)據(jù)庫的逐步建立，SNP 分型檢測方法不斷取得新的突破，SNP 的研究應(yīng)用領(lǐng)域也將持續(xù)向深度和廣度推進，SNP 的研究應(yīng)用終將逐步走向成熟。