WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3對胃惡性腫瘤細(xì)胞增殖的影響

賈佳 王琦 盧光新 金靈莉

胃癌是全球第五大最常見的惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大原因，然而胃癌發(fā)生的確切分子機(jī)制尚不清楚[1]，阻礙了個(gè)性化治療策略的發(fā)展，因此，尋找可靠的胃部惡性腫瘤治療性分子標(biāo)記物至關(guān)重要。WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(RFWD3)參與DNA的損傷修復(fù)[2]；125碘(125I)粒子放療對裸鼠肝癌起到抑制作用，通過下調(diào)RFWD3表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，成為晚期胃癌重要的輔助治療手段[3]，但RFWD3表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后也尚不清楚。本研究通過對癌癥基因譜圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫及mRNA芯片數(shù)據(jù)分析、進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)等，探索可能的分子生物學(xué)機(jī)制，論證RFWD3作為胃癌分子靶向治療潛在靶點(diǎn)的可能性。

材料與方法

1.材料：通過TCGA數(shù)據(jù)庫選取RNAseqV2的成對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。TCGA數(shù)據(jù)庫現(xiàn)存443個(gè)有可用數(shù)據(jù)的樣本，其中有RNAseqv2成對樣本數(shù)據(jù)且有病理信息的一共32對，根據(jù)32對樣本的barcode信息，使用TMM(Trimmd Mean of M-Values)法過濾樣本。細(xì)胞株、主要試劑和儀器：人胃腺癌細(xì)胞株AGS、人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901均購于上海吉?jiǎng)P基因公司；Trizol購于上海普飛生物有限公司；GV115載體、TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、Oligo dT購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNA sequencing購于上海美季生物有限公司；分光光度計(jì)Thermo、熒光顯微鏡、奧林巴斯凝膠成像儀購于上海天能科技有限公司。

2.方法

(1)篩選候選基因：對于多個(gè)成對樣本的統(tǒng)計(jì)，首先估算離散度，然后用一般線性模型估算基因在不同分組間是否有差異，同時(shí)采用計(jì)算方法log2(Cancer/Normal)過濾標(biāo)準(zhǔn)為≥1或≤-1，最終確定用于分析的基因列表。

(2)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測RFWD3 mRNA在不同胃癌細(xì)胞中的表達(dá)：收集細(xì)胞，提取AGS、MGC-803、BGC-823、SGC-7901 4種細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，RFWD3引物序列：上游引物5’-GACCAACTTCATCAGCGGACT-3’，下游引物5’CCTGCAACTCTTCAGATACAGGA-3’。采用2-ΔΔct反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達(dá)水平。

(3)構(gòu)建載體，收獲慢病毒：以RFWD3基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn)序列，合成含干擾序列的單鏈DNA oligo,退火配對，產(chǎn)生雙鏈DNA，通過其兩端酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的慢病毒載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP 10,送測序驗(yàn)證，對測序結(jié)果比對正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提；質(zhì)粒載體制備完畢，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完成48～72 h進(jìn)行病毒收獲，然后離心濃縮去除雜質(zhì)，純化后樣品分裝。

(4)慢病毒感染胃腺癌細(xì)胞AGS：復(fù)蘇液氮中的胃腺癌細(xì)胞AGS，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右傳代培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞，完全培養(yǎng)基制成3～5×104/ml細(xì)胞懸液，將其分為shCtrl組和shRFWD3組，加入最適病毒進(jìn)行感染(按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，8～12 h左右更換常規(guī)培養(yǎng)基，觀察感染后細(xì)胞狀態(tài)及感染率。

(5)RT-PCR檢測細(xì)胞中mRNA水平RFWD3基因消減效率：經(jīng)慢病毒感染72 h后，采用RT-PCR檢測shRFWD3組胃腺癌細(xì)胞AGS中RFWD3基因在mRNA水平的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷靶點(diǎn)的干擾效果。

(6)使用Celigo儀檢測RFWD3基因消除對細(xì)胞增殖的影響：將處于對數(shù)生長期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞采用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)；根據(jù)細(xì)胞生長速度決定鋪板細(xì)胞密度(大多數(shù)細(xì)胞鋪板數(shù)設(shè)定為2 000)，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)體系為100 μl/孔，鋪板過程中需確保每孔加入細(xì)胞數(shù)目一致，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天使用Celigo儀檢測讀板一次，連續(xù)3～5天；通過調(diào)整分析設(shè)置的輸入?yún)?shù)，準(zhǔn)確計(jì)算出每次掃描孔板中的帶綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量；對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，繪出5天的細(xì)胞增殖曲線，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

(7)比色法(MTT)檢測胃腺癌細(xì)胞AGS的增殖：分為shCtrl組和shRFWD3組，采用shRNA慢病毒感染AGS細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，經(jīng)MTT法處理后觀察，采用多功能酶標(biāo)儀在490 nm處檢測細(xì)胞光密度值。

結(jié) 果

1.TCGA數(shù)據(jù)過濾與標(biāo)準(zhǔn)化：胃癌在TCGA數(shù)據(jù)庫現(xiàn)存443個(gè)可用數(shù)據(jù)的樣本，其中RNAseq數(shù)據(jù)樣本有416個(gè)，有RNAseqV2成對樣本數(shù)據(jù)且有病理信息的一共32對，根據(jù)樣本的barcode信息，拆分出32個(gè)成對樣本的原始數(shù)據(jù)文件，顯示大部分樣本Normal(癌旁)與Cancer(癌癥)樣本被明顯分離開，而編號27～32的樣本表現(xiàn)則與其他有明顯差異。前26個(gè)成對樣本數(shù)據(jù)具有較高穩(wěn)定性，更適合進(jìn)行后續(xù)分析，因此對32個(gè)樣本和26個(gè)樣本的分組均進(jìn)行計(jì)算。過濾后的26對樣本通過差異基因列表獲取。

2.RFWD3基因篩選：候選基因篩選，通過標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定有效減少篩選目的基因數(shù)量：(1)去除本項(xiàng)目所研究的癌種已有功能與臨床相關(guān)性SCI論文報(bào)道的基因；(2)去除多次跨膜蛋白基因；(3)去除PubMed中相關(guān)文章數(shù)量>100的；相關(guān)的數(shù)據(jù)來源均為可靠度較高的基因疾病數(shù)據(jù)庫，最終得到的基因列表經(jīng)過一定的隨機(jī)濃縮，經(jīng)過Card基因分析結(jié)果，得到最終RFWD3。

3.RFWD3在4種胃癌細(xì)胞中mRNA的表達(dá)比較：RFWD3 mRNA在4種胃癌細(xì)胞中的表達(dá)均較高，在AGS中最高(P<0.05)。見圖1。

圖1 RFWD3 mRNA在不同細(xì)胞中的表達(dá)

4.shRNA慢病毒感染胃腺癌細(xì)胞AGS：胃腺癌細(xì)胞AGS經(jīng)過shRNA慢病毒感染72 h后顯微鏡下熒光觀察結(jié)果顯示，shCtrl組細(xì)胞感染效率較低，而shRFWD3組細(xì)胞感染效率達(dá)到80%以上，兩組細(xì)胞狀態(tài)均正常。見圖2、3。

圖2 顯微鏡下shCtrl組細(xì)胞的慢病毒感染結(jié)果(A：明視野，×100；B：明視野，×200；C：熒光視野，×100；D：熒光視野，×200)

圖3 顯微鏡下shRFWD3組細(xì)胞的慢病毒感染結(jié)果(A：明視野，×100；B：明視野，×200；C：熒光視野，×100；D：熒光視野，×200)

5.胃腺癌細(xì)胞AGS中RFWD3基因敲減率：經(jīng)shRNA慢病毒感染后，實(shí)驗(yàn)組胃腺癌細(xì)胞AGS中RFWD3基因在mRNA水平的表達(dá)量受到抑制(P<0.05)，敲減率達(dá)50.7%。見圖4。

圖4 基因RFWD3敲減后mRNA表達(dá)豐度比較(注：aP<0.05)

6.兩組胃腺癌細(xì)胞AGS中敲除RFWD3基因后比較：Celigo儀檢測結(jié)果顯示，經(jīng)shRNA慢病毒感染AGS細(xì)胞72 h后，與shCtrl組比較，shRFWD3組的細(xì)胞數(shù)量及倍數(shù)增加明顯降低(P<0.05)，提示細(xì)胞增殖抑制明顯。見圖5。

圖5 慢病毒感染細(xì)胞后RFWD3敲減組的變化(A:細(xì)胞計(jì)數(shù)；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)倍數(shù))

7.兩組胃癌細(xì)胞AGS增殖情況比較：與shCtrl組相比較，shRFWD3組細(xì)胞吸收率隨時(shí)間及倍數(shù)的增加而降低(P<0.05)，提示細(xì)胞增殖抑制明顯，見圖6。

圖6 RFWD3對胃腺癌細(xì)胞AGS增殖的影響(A:吸收率；B:吸收率倍數(shù))

討 論

RFWD3是ATM/ATR磷酸化底物，參與DNA損傷后的修復(fù)過程[4-5]。DNA損傷修復(fù)時(shí)，RFWD3被停止在復(fù)制叉處積累，與復(fù)制蛋白A(RPA)共同定位，并通過WD40域與RPA相結(jié)合，在同源重組(HR)之后促進(jìn)復(fù)制叉重新啟動(dòng)，通過這一機(jī)制發(fā)現(xiàn)RFWD3突變與Fanconi貧血相關(guān)[6]；有文獻(xiàn)報(bào)道，RFWD3參與了惡性睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)制[7]；也有報(bào)道RFWD3基因下調(diào)能夠抑制非小細(xì)胞肺癌的集落形成，與疾病預(yù)后具有相關(guān)性，且發(fā)現(xiàn)吸煙者的RFWD3基因表達(dá)水平明顯高于非吸煙者[8]；在多發(fā)性骨髓瘤廣泛基因關(guān)聯(lián)性研究中，RFWD3屬于易感位點(diǎn)之一，為深入了解腫瘤的提供生物學(xué)基礎(chǔ)[9]。但RFWD3與胃癌相關(guān)性的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)旨在探討RFWD3是否能夠成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)首先從TCGA數(shù)據(jù)庫的大量樣本中分離Normal(癌旁)與Cancer(癌癥)，然后通過差異基因分析，有效減少目的基因數(shù)量，隨機(jī)濃縮從Card基因表中得出RFWD3,但上述實(shí)驗(yàn)僅能說明該基因在腫瘤中呈高表達(dá)，與RFWD3蛋白在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)相一致，該文獻(xiàn)是通過基因芯片和抗體芯片探討該基因在肝癌中的生物學(xué)機(jī)制[10]，說明與肝癌有相關(guān)性，但其與胃癌的相關(guān)性和機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過RT-PCR檢測在4種胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，RFWD3不僅高表達(dá)，且在胃腺癌細(xì)胞AGS表達(dá)水平極高。為探討該基因在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中是否起作用，進(jìn)而進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)：采用慢病毒轉(zhuǎn)染、感染胃腺癌AGS細(xì)胞，結(jié)果顯示感染率在80%以上；之后進(jìn)行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)shRNA慢病毒感染后，實(shí)驗(yàn)組胃腺癌細(xì)胞AGS中RFWD3基因敲減率>50.7%,說明其為有效靶點(diǎn)，并且可以用于進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。為探討RFWD3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)使用Celigo儀檢測RFWD3基因消減對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，胃腺癌細(xì)胞AGS的增殖速率受到顯著抑制，提示RFWD3基因與胃腺癌細(xì)胞AGS的增殖能力具有顯著相關(guān)性,進(jìn)一步通過MTT檢測RFWD3基因消減對細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示，經(jīng)shRNA慢病毒感染72 h后，實(shí)驗(yàn)組胃腺癌細(xì)胞AGS的增殖速率受到顯著抑制，也同樣提示RFWD3基因與胃腺癌細(xì)胞AGS的增殖能力顯著相關(guān)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出干擾目的基因RFWD3對胃腺癌細(xì)胞AGS具有抑制其增殖的作用，但本實(shí)驗(yàn)未對該基因在蛋白水平及對細(xì)胞周期的影響進(jìn)行檢測，有待進(jìn)一步研究。

在近十年的國外報(bào)道中，RFWD3基因?qū)NA損傷修復(fù)的研究較多，如RFWD3是一種E3泛素連接酶，以單鏈DNA蛋白、RPA、重組酶RAD51和人類抑癌基因P53為靶點(diǎn)；如最新報(bào)道在果蠅中發(fā)現(xiàn)RFWD3發(fā)揮的作用不同于其他哺乳動(dòng)物，由于果蠅中存在Mus302，所以能夠保留RFWD3的原始作用[11-13],而涉及對惡性腫瘤影響的研究較少，尤其是該基因?qū)δ[瘤細(xì)胞影響的機(jī)制更為罕見。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析RFWD3與癌旁、癌癥組織的關(guān)系、通過部分功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RFWD3能夠抑制胃癌細(xì)胞AGS的增殖，但其是否是通過DNA損傷影響了RFWD3基因尚不明確，有待進(jìn)一步研究深入探討。