核酸適配體在病原微生物檢測中的應(yīng)用研究進展

王佳齊，吳倩倩，鄭曉雪，李倩

1 濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，山東濰坊261053；2 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

核酸適配體是一種分子量較小的生物分子，通常為20～100 bp 的寡核苷酸分子，能夠依靠自身的三維結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的同源配體相結(jié)合［1］。ELLING?TON 和 SZOSTAK 首次提出了適配體的概念［2］。同年，TUERK 和GOLD 也建立了指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（SELEX）技術(shù)，用來篩選核酸結(jié)合蛋白的高親和力和高特異性適配體，進而開展快速簡便的結(jié)合位點研究［3］。核酸適配體可以通過其獨特的三維結(jié)構(gòu)高選擇性地與目標(biāo)靶點結(jié)合，具有與抗原-抗體反應(yīng)相類似的高親和性、高特異性。同時，核酸適配體還具有分子量小、無免疫原性、合成成本低、可通過化學(xué)修飾獲得高穩(wěn)定性等區(qū)別于蛋白質(zhì)抗體的優(yōu)點，成為目前病原微生物檢測的研究開發(fā)熱點?，F(xiàn)將核酸適配體在病原微生物檢測中的應(yīng)用研究進展綜述如下。

1 核酸適配體的制備及修飾

1.1 核酸適配體的分子結(jié)構(gòu) 核酸適配體的典型三維結(jié)構(gòu)基序包括莖環(huán)、富含嘌呤的凸起和發(fā)夾、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、假節(jié)、口袋及G-四分體結(jié)構(gòu)等。核酸適配體可以通過適應(yīng)性地改變自身構(gòu)象和三維結(jié)構(gòu)折疊狀態(tài)來結(jié)合各種各樣的靶分子［4］。核酸適配體識別靶分子的過程類似于抗原—抗體的構(gòu)象識別，結(jié)構(gòu)復(fù)合物的形成方式亦相似，該過程主要通過范德華力、氫鍵、靜電作用、平面結(jié)構(gòu)堆疊及形狀互補來達到高特異性和高親和性的結(jié)合。結(jié)合過程的解離常數(shù)（Kd）非常小，范圍在pM 到nM 之間，因此，核酸適配體常被叫做“化學(xué)抗體”［5］。

1.2 核酸適配體的制備 SELEX 技術(shù)是研發(fā)特定核酸適配體的“金標(biāo)準(zhǔn)”。SELEX 技術(shù)首先制備一個與給定配體具有高特異性和親和性的隨機序列文庫，然后將該文庫中具有高親和性的小分子進行多輪高親和性篩選和指數(shù)富集，隨即通過RT-PCR 和PCR 進行擴增［5］。核酸適配體的制備通常包含以下幾個步驟［6］：①構(gòu)建隨機寡核苷酸文庫。通過化學(xué)方法合成的單鏈DNA 或RNA 文庫一般包含1014～1018個20～70 bp 長度的單鏈寡聚核苷酸，在這些序列的兩端為特定引物的結(jié)合位點，而內(nèi)部則為隨機序列。兩端的固定序列可進行后續(xù)篩選過程的擴增。②隨機文庫與靶分子孵育。初始文庫中的隨機序列會疊成不同的二級和三級結(jié)構(gòu)，然后與固定或游離的靶分子在最佳條件下形成的核酸適配體-靶分子復(fù)合物。③除去未結(jié)合的寡核苷酸片段。通過膜過濾、親和柱、磁珠、毛細管電泳等多種不同的方法將與靶分子不具有親和性或親和性低的寡核苷酸片段與復(fù)合物分離。④擴增結(jié)合的核酸適配體。與靶分子結(jié)合的適配體序列使用PCR（DNA 適配體）或RT-PCR（RNA 適配體）方法進行擴增。擴增產(chǎn)物將作為下一輪篩選的適配體子文庫，一般進行8～20 輪篩選，即可得到高親合力和高特異性的核酸適配體。⑤將最終獲得的適配體進行克隆和鑒定。

1.3 核酸適配體的修飾 由于核酸適配體是一類小分子物質(zhì)，且對核酸酶敏感性高，因此可以通過化學(xué)修飾核酸適配體戊糖骨架或側(cè)鏈基團摻入非天然核苷酸，或在核酸適配體末端進行加帽處理，來提高其功能穩(wěn)定性［7］?；瘜W(xué)修飾有助于在核酸適配體的篩選過程中體現(xiàn)最佳的藥代動力學(xué)特性，還有助于提高核酸適配體的親和力，增加文庫的多樣性，從而提高SELEX技術(shù)的成功率。大多數(shù)核酸酶水解核酸時極化核糖的2′-OH基團，攻擊磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸序列的水解。將2′-OH基團化學(xué)置換為不同的基團（如2′-氟，2′-氨基或2′-甲氧基），或?qū)⒘姿岫ユI進行硼垸化磷酸鹽修飾和硫代磷酸修飾，或兩種修飾方法同時使用，均可改進適配體的穩(wěn)定性。此外，核酸適配體與較大的生物納米材料結(jié)合，增加復(fù)合物的總分子量，可以有效增強對核酸酶抗性和靶分子親和力，如聚乙二醇、金納米粒子、脂質(zhì)體等［8］。

2 核酸適配體在病原微生物檢測中的應(yīng)用

病原微生物所導(dǎo)致的感染性疾病曾隨著抗感染藥物的問世而得到有效的控制，但隨著耐藥性的發(fā)展，病原微生物可以通過不同的耐藥機制使藥物無法實現(xiàn)治療效果，導(dǎo)致大部分感染性疾病難以治愈［9］。大部分抗感染治療依靠經(jīng)驗用藥，導(dǎo)致藥物選擇失誤、病情延誤、治療成本上升等問題接踵而至［10］。因此，快速靈敏、低成本的病原微生物檢測方法成為目前的研究熱點。常見的檢測方法大多基于抗原抗體反應(yīng)，但抗體制作過程復(fù)雜、易變。相比之下，核酸適配體的優(yōu)勢更為明顯，更適合病原微生物檢測。

2.1 核酸適配體在寄生蟲檢測中的應(yīng)用 目前，原生動物寄生蟲仍影響著全世界數(shù)百萬人，迫切需要新的檢測技術(shù)與藥物治療靶點。最近，已有不少報道將核酸適配體作為寄生蟲診斷和靶向控制的工具，并討論其在臨床應(yīng)用中的可行性。CHEUNG等［11］使用靶向惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的DNA 適配體和適配體系留酶捕獲分析方法對兩種瘧原蟲進行了物種特異性的鑒定，并在臨床樣本中進行了測試，結(jié)果表明，核酸適配體檢測對惡性瘧原蟲血樣是特異的，并且可以區(qū)分間日瘧原蟲血樣，有望成為一種新的特異性瘧疾診斷策略。IQBAL 等［12］利用DNA適配體耦合磁珠的方法，同時使用一種靈敏而特異的電化學(xué)傳感器作為第二配體與鏈霉親和素包覆的磁珠結(jié)合，以監(jiān)測和鑒定隱孢子蟲的卵囊，此方法快速簡便、技術(shù)要求低。OSPINA-VILLA 等［13］利用分子生物學(xué)和計算機工具對溶組織阿米巴中的多聚腺苷酸化所必需的mRNA 裂解因子EhCFIm25 進行了鑒定，同時采用SELEX 篩選了針對EhCFIm25 的單鏈RNA 適配體，RNA-蛋白質(zhì)的結(jié)合分析證實，適配體可在體外與EhCFIm25 相結(jié)合，并可抑制溶組織阿米巴寄生蟲增殖，導(dǎo)致細胞迅速死亡，證實了RNA 適配體在控制溶組織阿米巴感染方面的潛在價值。

2.2 核酸適配體在細菌檢測中的應(yīng)用 目前檢測細菌的核酸適配體主要針對全細胞，其次包括細胞裂解液和單一蛋白。近年來，通過SELEX 方法，已獲得了多種高特異性的結(jié)合細菌的核酸適配體，如結(jié)合Escherichia coliO157：H7外膜脂多糖、Salmonel?la entericaser. Typhimurium、Vibrio fischeriATCC 49387 霍 亂 毒 素 B 亞 基 、Streptococcus pneumoniaeATCC 49619、Staphylococcus aureus的ssDNA適配體，以及針對Mycobacterium tuberculosisH37Rv HspX、FbpA、MPT64 的 DNA 適配體等［14-21］。單一蛋白靶位適配體雖然結(jié)合力強，但是由于篩選使用的是體外純化蛋白，在細菌表面的分布、構(gòu)象較體外有很大不同，因此這種核酸適配體與細胞的結(jié)合力不穩(wěn)定，且體外表達純化蛋白程序復(fù)雜，不一定能獲得可溶性功能蛋白。某一種微生物的全細胞或細胞裂解液靶位復(fù)雜，核酸適配體特異性不強，加入另一種微生物進行反向篩選，可以顯著提高核酸適配體的特異性。另外，SELEX 篩選后的優(yōu)化措施，如鑒定靶分子-適配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分析結(jié)合反應(yīng)的機理、特異性和敏感性等，對核酸適配體檢測的開發(fā)亦有重要意義。

2.3 核酸適配體在病毒檢測中的應(yīng)用 病毒感染可引起許多危及生命的疾病，如艾滋病、非典、肝炎、癌癥等。由于病毒體外培養(yǎng)困難，臨床檢測多采用免疫學(xué)檢測方法。然而，病毒所含蛋白質(zhì)數(shù)量少、復(fù)雜程度低，更符合核酸適配體篩選檢查的要求。相比其他病原微生物而言，病毒個體較小，核酸適配體亦可用于其治療。目前，已有處于研發(fā)或臨床應(yīng)用階段的病毒核酸適配體。PANG 等［22］通過SELEX 技術(shù)篩選出特異性結(jié)合人類免疫缺陷病毒（HIV）穩(wěn)定蛋白質(zhì)（如整合酶）的shRNA 適配體，可抑制HIV 在細胞培養(yǎng)物中的復(fù)制。PLESHAKOVA 等［23］獲得了針對丙型肝炎病毒（HCV）的特異性結(jié)合HCVcoreAg的ssDNA 適配體，已被成功地用作在復(fù)雜蛋白質(zhì)基質(zhì)（如人血清）存在條件下進行HCVcoreAg 檢測的探針分子。BAI 等［24］獲得了針對滅活完整的H1N1病毒顆粒的DNA 適配體，擁有更好的病毒變異適應(yīng)性。HMILA 等［25］通過 SELEX 技術(shù)篩選出對 H7N9具有高結(jié)合親和力的適配體，并使用該適配體作為配體，開發(fā)了高度靈敏的實時免疫聚合酶鏈反應(yīng)（RT-I-PCR）檢測方法。

2.4 核酸適配體在真菌檢測中的應(yīng)用 致病性真菌侵入人體組織器官，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷，尤其是侵襲性真菌病，對人類健康形成了極大的威脅。BACHTIAR 等［26］采用 SELEX 技術(shù)篩選出了針對白假絲酵母ATCC 10231 細胞的RNA 適配體。通過測試所得適配體的結(jié)合力和白假絲酵母生物膜的代謝活性，證明了核酸適配體的親和性與抗體的親和性相當(dāng)，并可抑制生物膜和菌絲的形成，具備應(yīng)用于臨床檢測和治療的潛力。JOO 等［27］建立了一個基于核酸適配體的快速檢測黃曲霉素B1的分析方法，將適配體與熒光素相連，并利用了氧化石墨烯的熒光淬滅性，該方法比傳統(tǒng)方法的檢測范圍更廣，檢測速度更快，更適合現(xiàn)場檢測。ASWANI 等［28］更是將DNA 適配體與抗體結(jié)合起來，制備二者的雜交探針進行黃曲霉素B1的檢測，具有明顯的反應(yīng)性和選擇性，可應(yīng)用于常規(guī)食品檢測實驗室中。

3 核酸適配體在病原微生物檢測中的應(yīng)用優(yōu)勢和問題

在臨床上，蛋白質(zhì)抗體被大量用于臨床病原微生物的快速檢測方法中，但抗體的應(yīng)用受到其高免疫原性和高生產(chǎn)成本的限制。而核酸適配體憑借其分子量小、無免疫原性、高穩(wěn)定性等特點成為了抗體的卓越替代品、補充品［29］。并且，核酸適配體由核苷酸組成，通過固相化學(xué)法大量合成生產(chǎn)，進行生產(chǎn)批準(zhǔn)時可被當(dāng)作是化學(xué)制品而非生物制劑，研發(fā)生產(chǎn)效率大大提升?？贵w的生產(chǎn)主要依賴于體內(nèi)合成，而且抗體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、配體類型單一，而核酸適配體是通過體外合成途徑獲得，底物類型廣泛，結(jié)構(gòu)簡單，更適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［30］。核酸適配體可通過化學(xué)修飾從而獲得良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。化學(xué)修飾的核酸適配體可在多種緩沖液中保存較長時間，亦可在常溫下進行運輸。現(xiàn)已成功針對不同類型的靶標(biāo)設(shè)計出相對應(yīng)的核酸適配體，這些靶標(biāo)包括無機離子、藥物、寡肽、蛋白質(zhì)以及復(fù)雜的細胞或組織等，極大地擴展了核酸適配體的應(yīng)用范圍［31］。理論上SELEX 可用于篩選針對各種類型靶標(biāo)的高親和力核酸適配體，但實際成功率較低，導(dǎo)致基于核酸適配體的成熟產(chǎn)品較少地應(yīng)用于臨床。影響核酸適配體開發(fā)與應(yīng)用的主要障礙包括：①核酸的構(gòu)象多樣性比蛋白質(zhì)抗體更有限；②帶有高負電荷的核酸適配體難以與帶負電荷的目標(biāo)分子結(jié)合；③體外產(chǎn)生的核酸適配體具有不同的生物可利用性和體內(nèi)應(yīng)用的結(jié)合特性；④SELEX 過程耗時且成功率低。因此，在核酸適配體的應(yīng)用可行性方面還有許多問題亟待解決。

綜上所述，核酸適配體依賴其獨特的三維結(jié)構(gòu)和制備技術(shù)，在寄生蟲、細菌、病毒、真菌等檢測領(lǐng)域具有高穩(wěn)定性、高特異性、低成本的優(yōu)勢。目前，感染性疾病的檢測和診斷方法具有較高的市場需求。在醫(yī)源性和食源性病原微生物檢測方面，核酸適配體展露出更廣闊的應(yīng)用前景，相關(guān)檢測手段能夠進一步消除診斷的不確定性，從而減少廣譜抗菌藥物的經(jīng)驗使用，規(guī)避了產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險。下一步，如何快速獲得具有優(yōu)異可利用性的核酸適配體、縮短篩選周期、提高SELEX 技術(shù)成功率、節(jié)省開發(fā)時間和成本投資將成為研究熱點，進一步促進核酸適配體技術(shù)在病原微生物檢測方面的應(yīng)用。