血清sLAG3、miR-221水平對帕金森病的診斷效能

楊東鋒，李傳俠，王義義

1 天津市寧河區(qū)醫(yī)院，天津301500；2 天津市海河醫(yī)院

帕金森病（PD）是常見的神經(jīng)退行性疾病，目前尚缺乏有效治療手段，大多數(shù)患者會隨著疾病的不斷進展喪失生活自理能為，給患者家庭和社會帶來精神和經(jīng)濟上的雙重負擔［1］。由于PD 發(fā)展至一定程度后較難控制，因此如何在疾病早期對疾病進行有效的診斷和治療已成為臨床研究重點［2］?？扇苄粤馨图毎罨?（sLAG3）是淋巴細胞活化基因3（LAG3）的裂解產(chǎn)物。LAG3 可經(jīng)跨膜金屬蛋白酶介導(dǎo)裂解為sLAG3，sLAG3可在血液中穩(wěn)定表達，且其表達水平可較好的反映組織細胞中LAG3 的表達水平。近年來有研究［3］顯示，LAG3 可調(diào)控 PD 發(fā)病中的重要因子α-突觸核蛋白（α-Syn）的表達，可能在PD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。微小RNA（miR?NA）是一類內(nèi)源性的小分子單鏈RNA，具有較豐富的生物學(xué)功能，如調(diào)控細胞的分裂、參與免疫炎癥的調(diào)節(jié)等，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA 與PD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如 miR-7［4］、miR-133b［5］等。研究［6］顯示，miR-221 在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中異常表達。本研究觀察了血清sLAG3、miR-221 水平對PD患者的診斷效能，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月天津市寧河區(qū)醫(yī)院收治的PD 患者92 例，記為PD 組。納入標準：①PD 診斷標準參考《中國帕金森病的診斷標準（2016 版）》中的相關(guān)內(nèi)容［7］；②臨床資料完整；③未同時參與其他研究；④患者或其家屬對本次研究知情同意。排除標準：①合并有其他類型的腦部疾病，有明確的腦外傷史；②合并有惡性腫瘤者；③合并有嚴重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；④合并有自身免疫性疾病者；⑤合并有嚴重感染者。另選取同期體檢健康志愿者50例作為對照組。PD 組92 例患者中，男58 例、女 34 例，年齡（61.23 ±10.26）歲，病程（3.67± 3.01）年，合并高血壓27例，合并糖尿病23 例，文化程度初中及以下40 例、高中38 例、大專及以上 14 例。對照組男 30 例、女 20 例，年齡（60.89±9.52）歲，合并高血壓11例，合并糖尿病10 例，文化程度初中及以下21 例、高中19 例、大專及以上10 例。PD 組和對照組的性別、年齡、文化程度、合并高血壓和合并糖尿病等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。所有PD 患者均采用帕金森病評定量表（UPDRS）評估病情的嚴重程度［8］，包括精神行為、情感障礙、日常生活、運動能力、治療的并發(fā)癥5 個部分。本研究主要選用其中的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分，其中UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分分別代表了患者的精神活動和情感障礙、日常生活能力及運動功能，各項目均分為5 個等級，計分為0～4 分，分數(shù)越高表示癥狀越重。同時，依據(jù)Hoehn-Yahr 分級將患者進行分組。Hoehn-Yahr 分級是根據(jù)患者的病情嚴重程度將其分成 0 期、1 期、1.5 期、2 期、2.5 期、3 期、4 期、5 期這8 個分期，分期越高代表病情越嚴重。92 例PD 患者中，1～2 期 38 例，納入到輕度組，2.5～3 期 30 例，納入到中度組，4～5 期 24 例，納入到重度組［9］。本研究經(jīng)天津市寧河區(qū)醫(yī)院倫理委員會同意并批準。

1.2 兩組研究對象血清sLAG3 檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法。收集所有研究對象的空腹靜脈血5 mL，采用離心機以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，移取上清液至EP 管，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清sLAG3 水平。Elisa 試劑盒購自英國Abcam 公司，Elx800 酶標儀購自美國Biotek 公司，相關(guān)檢測均嚴格遵循對應(yīng)試劑盒的操作指南進行。

1.3 兩組研究對象血清miR-221 檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取離心后的血清，采用mir Vana RNA Isolation Kit 提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA 的濃度和純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，利用7900HT 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)，以U6作為內(nèi)參基因進行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共 40 個循環(huán)。引物序列如下：miR-221 上游引物為5′-GGACCACCGCT?CATCGCTAA-3′，下游引物為5′-GTTACTATATGC?CAAGCCCTAG-3′。U6 上游引物為 5′-CGCTTCG?GCAGCACATATAC-3′，下 游 引 物 為 5′-TTCAC?GAATTTGCGTGTCAT-3′。以 2-ΔΔCt表示血清中 miR-221的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。相關(guān)性分析采用Pear?son 相關(guān)分析法。采用受試者工作特征曲線（ROC）評價血清sLAG3、miR-221 水平對PD 的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象血清sLAG3 水平、miR-221 相對表達量比較 PD 組血清sLAG3 水平、miR-221 相對表達量分別為（932.54 ± 173.18）pg/mL、31.63 ±6.42，對照組分別為（705.96 ± 113.58）pg/mL、23.98± 4.89，兩組相比，P均＜0.001。

2.2 不同病情嚴重程度的PD 患者血清sLAG3 水平、miR-221 相對表達量比較 重度組血清sLAG3水平、miR-221 相對表達量分別為（1 048.88 ±126.87）pg/mL、37.08 ± 4.51，中 度 組 分 別 為（926.87 ± 163.52）pg/mL、32.03 ± 6.84，輕度組分別為（863.54 ± 142.67）pg/mL、27.87 ± 4.36，組間相比，P均＜0.05。

2.3 PD 患者血清 sLAG3 水平、miR-221 相對表達量與UPDRS 評分的相關(guān)性 PD 患者UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分分別為（4.91 ±1.58）分、（20.15 ± 8.36）分、（34.81 ± 12.54）分。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PD 患者血清sLAG3 水平與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分均呈正相關(guān)（r分別為0.384、0.426、0.453，P均＜0.05），血清miR-221相對表達量與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分均呈正相關(guān)（r分別為0.421、0.378、0.352，P均＜0.05）。

2.4 血清sLAG3、miR-221 水平對PD 的診斷效能血清sLAG3 水平診斷PD 的曲線下面積為0.828（95%CI為0.762～0.894），取截斷值為887.62 pg/mL時，血清sLAG3水平診斷PD的敏感度為55.43%、特異度為94.00%。血清miR-221 水平診斷PD 的曲線下面積為 0.801（95%CI為 0.728～0.874），取截斷值為27.22 時，血清miR-221 水平診斷PD 的敏感度為71.74%、特異度為72.00%。取血清sLAG3 水平截斷值為887.62 pg/mL、miR-221 水平截斷值為27.22 時，血清 sLAG3 聯(lián)合 miR-221 水平診斷 PD 的敏感度為80.43%、特異度為76.00%。

3 討論

PD 又稱震顫麻痹，靜止性震顫是PD 患者常見的首發(fā)癥狀，除此之外，患者還常常出現(xiàn)運動遲緩、肌強直、姿勢步態(tài)障礙、嗅覺障礙等臨床癥狀，嚴重影響患者的運動功能和日常生活，使得患者的生活質(zhì)量明顯降低［10］。PD 多發(fā)于中老年人，且其發(fā)病率會隨著年齡的增加而增加，近年來隨著我國老年化社會的到來，PD 患者的數(shù)量呈明顯上升的趨勢［11］?；颊叩呐R床癥狀是診斷PD 的重要依據(jù)，但PD 起病隱匿，通常需要在患者多巴胺能神經(jīng)元和（或）紋狀體內(nèi)多巴胺水平明顯減少時才會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此在疾病早期進行診斷存在一定的困難，臨床在診斷PD時易出現(xiàn)誤診、漏診的現(xiàn)象［12］。生物標志物是傳統(tǒng)方法診斷疾病的重要補充，其在疾病中通常呈異常表達，可通過臨床檢驗其表達水平來分析患病的可能性，且與臨床癥狀、評分量表等具有一定主觀因素的診斷手段相比，生物標志物更加客觀，可減少主觀因素的干擾，近年來在輔助臨床診斷疾病上起到了重要作用。

LAG3 是一種編碼與CD4 同源的跨膜糖蛋白，LAG3 基因位于人染色體12p13.32 上，分布于活化的 T 淋巴細胞、NK 細胞、B 細胞、樹突樣細胞膜表面，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能和炎癥反應(yīng)的作用［13］。LAG3 可經(jīng)跨膜金屬蛋白酶介導(dǎo)裂解為sLAG3，sLAG3 可在血液中穩(wěn)定表達，且其表達水平可較好的反映組織細胞中LAG3 的表達水平。本研究結(jié)果顯示，PD 患者的血清sLAG3 水平明顯高于健康人群，且其表達水平與病程嚴重程度密切相關(guān)，提示sLAG3在PD患者血清中呈異常高表達，可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。GUO 等［14］的研究表明，LAG3 的基因多態(tài)性與中國女性人群的PD 發(fā)病風險有關(guān)。α-Syn 是PD 發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子，其可促進線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和特定的多巴胺能神經(jīng)細胞死亡，α-Syn 在細胞間朊病毒樣傳播行為是PD 病理擴散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15］。研究［3］顯示，LAG3是α-Syn的轉(zhuǎn)運受體，多巴胺神經(jīng)元細胞膜表達的LAG3 可以和α-Syn 特異性結(jié)合，觸發(fā)內(nèi)吞作用進入神經(jīng)元胞體，導(dǎo)致細胞凋亡，而在抑制LAG3 的表達后以上作用則明顯減少，提示LAG3 可能通過調(diào)控α-Syn 的傳播參與PD 的進展。

miR-221是miR-221/222家族的一員，基因位于X 染色體的 p11.3 區(qū)［16］。近年來的研究［17］發(fā)現(xiàn)，miR-221 與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如阿爾茨海默病、膠質(zhì)瘤等。miR-221 作為miRNA 的一種亞型，其可在血液中穩(wěn)定表達，便于臨床檢測，符合作為輔助臨床診斷生物標志物的基本條件。本研究結(jié)果顯示，PD 患者的血清miR-221 水平明顯高于健康人群，且其表達水平與病情嚴重程度密切相關(guān)。周梅等［18］研究亦顯示，miR-221 在 PD 患者血清中呈異常高表達，與本研究結(jié)果一致。有細胞實驗［19］證實，HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA 主要是通過促進miR-221 的表達來誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。神經(jīng)退行性疾病患者特定部位有明顯的鐵沉積，當鐵含量增多時則會出現(xiàn)脂類過氧化反應(yīng)、自由基生成、線粒體功能異常等情況，促進 PD 的發(fā)生發(fā)展［20］。有相關(guān)研究［21］顯示，miR-211 可調(diào)節(jié)PD 模型中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2 的表達，影響鐵元素的積累，進而在PD等神經(jīng)退行性病變疾病的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。

本研究通過初步分析發(fā)現(xiàn)，sLAG3、miR-221 均在PD患者血清中呈異常表達，且表達水平與病情密切相關(guān)，二者均有作為診斷PD 生物標志物的潛力。進一步的 ROC 分析發(fā)現(xiàn)，血清 sLAG3、miR-221 對PD 的診斷價值較高，sLAG3 和 miR-221 的曲線下面積分別為0.828、0.801。然而單一指標診斷通常具有一定的局限性，如sLAG3 診斷PD 的特異性雖然很高，但敏感度較低，發(fā)現(xiàn)真陽性的能力較弱，因此本研究進一步分析了sLAG3、miR-221 聯(lián)合診斷的價值，結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷可進一步提高對PD 的診斷價值，敏感度和特異度均較單一指標診斷時明顯提高。

綜上所述，PD 患者血清 sLAG3 水平、miR-221相對表達量均升高，與病情嚴重程度呈正相關(guān)關(guān)系。檢測血清sLAG3、miR-221有助于PD的診斷。