miR-146a 對LPS/Aβ1-42誘導(dǎo)的人小膠質(zhì)細(xì)胞系HMC3炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用觀察

鄒婷 ，范煒豪 ，張妙萍 ，陳燕婷 ，崔理立 ，3，梁春梅 ，3

1 廣東醫(yī)科大學(xué)/廣東省衰老相關(guān)心腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524000；2 粵北人民醫(yī)院；3 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

在神經(jīng)炎性疾病中，小膠質(zhì)細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)大腦出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活成活化狀態(tài)，其細(xì)胞體積變大、胞體變圓、細(xì)胞表面的突起消失，形態(tài)由靜止的分枝狀變成活化的阿米巴狀［1-2］。小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后以兩種極化形式（M1/M2）存在，一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦的常駐細(xì)胞，參與了組織發(fā)育、結(jié)構(gòu)完善、神經(jīng)穩(wěn)態(tài)環(huán)境的維持、對損傷的反應(yīng)以及隨后的重塑及修復(fù)，可清除病原體、死亡的細(xì)胞、碎片或異常蛋白，從而對病原體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，監(jiān)測組織變化并維持組織穩(wěn)態(tài)；另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性炎癥也對中樞神經(jīng)組織有一定的損害作用。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的自由基、超氧化物陰離子、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等多種物質(zhì)可加重?fù)p傷，影響神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［3-4］。microRNA-146a（miR-146a）是一種先天免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，在炎癥和先天免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起重要作用。研究［5-6］顯示，通過NF-κB 信號通路進(jìn)行的促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致miR-146a 表達(dá)增加，而miR-146a 可通過抑制NF-κB 信號通路上游的白細(xì)胞介素1 受體相關(guān)激酶-1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）而發(fā)揮負(fù)反饋?zhàn)饔?，從而抑制NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步抑制了 NF-κB 靶點(diǎn)的表達(dá)基因，如IL-6、IL-1β 和TNF-α?？偟膩碚f，在炎癥刺激下miR-146a 被上調(diào)，其又負(fù)反饋抑制炎癥發(fā)展。此外，研究［7］表明，miR-146a不僅參與先天免疫的調(diào)節(jié)，而且還影響其他生物學(xué)功能，例如細(xì)胞凋亡、遷移、增殖，表明其在生理和疾病過程中具有廣泛的功能。miR-146a 在許多與炎癥相關(guān)的疾病和病理過程中，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中被調(diào)節(jié)，表明其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)炎癥方面具有重要作用。2018 年12月28日—2020年6月20日，本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-146a對脂多糖（LPS）或β-淀粉樣多肽1-42（Aβ1-42）誘導(dǎo)的人小膠質(zhì)細(xì)胞系HMC3炎癥反應(yīng)及凋亡的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人小膠質(zhì)細(xì)胞系HMC3購自上海中喬新舟生物公司，LPS 購自北京solarbio 公司，Aβ1-42購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司，胰酶購自美國Gibco 公司，DMEM/F-12 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司，雙抗（青霉素、鏈霉素）購自美國Gibco 公司，Lipo?fectamine 3000 Reagent 購自美國 Thermo 公司，miR-146a 激動劑模擬物（miR-146a mimics）及陰性對照錯義鏈（mimics NC）購自廣州銳博公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Real-time PCR 試劑盒購自日本TAKARA 公司，Annxein V-PE/7AAD 凋亡試劑盒購自翊圣公司，ELISA 試劑盒購自武漢BOSTER 公司，熒光定量PCR 儀（LightCycler480）購自美國羅氏生物，低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，BD FACSCantoⅡ流式儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞分組及miR-146a 轉(zhuǎn)染 HMC3 細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%的雙抗加入到DMEM/F12 完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，每隔2～3 d傳代1次，用含EDTA 胰酶消化2 min 后加兩倍體積培養(yǎng)基終止胰酶消化，傳代3 次后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HMC3 細(xì)胞分為LPS誘導(dǎo)組和Aβ1-42誘導(dǎo)組，各組下設(shè)3個小組。將 LPS 誘導(dǎo)組分為 A、B、C 組。A 組轉(zhuǎn)染 10 nmol/L的mimicis NC；B 組轉(zhuǎn)染10 nmol/L 的mimicis NC，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，加入 100 ng/mL 的 LPS 誘導(dǎo) 72 h；C組轉(zhuǎn)染10 nmol/L 的miR-146a mimicis，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入 100 ng/mL 的 LPS 誘導(dǎo) 72 h。將 Aβ1-42誘導(dǎo)組分為 a、b、c 組。a 組轉(zhuǎn)染 10 nmol/L 的 mimi?cis NC；b 組轉(zhuǎn)染 10 nmol/L 的 mimicis NC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入 5 μmol/L 的 Aβ1-42誘導(dǎo) 12 h；c 組轉(zhuǎn)染10 nmol/L 的 miR-146a mimicis，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，加入5 μmol/L的Aβ1-42誘導(dǎo)12 h。

1.3 各組細(xì)胞中炎癥因子IL-6 檢測 采用ELISA法。取各組細(xì)胞，4 ℃條件下5 000 r/min離心15 min，取上清液按照ELISA 試劑盒操作說明書檢測各組IL-6的表達(dá)水平。

1.4 各組細(xì)胞凋亡率測算 取各組細(xì)胞，用不含EDTA 的 0.25%胰酶37 ℃消化2 min 后，4 ℃條件下1 000 r/min離心棄上清，用PBS重懸，輕洗兩遍后用250 μL binding buffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管，加入Annxein V-PE/7-AAD 凋亡試劑，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 的binding buffer，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中炎癥因子IL-6 表達(dá)水平比較 A、B、C 組細(xì)胞中炎癥因子IL-6 表達(dá)水平分別為（1.73± 0.04）、（15.80 ± 0.58）、（10.73 ± 0.43）ng/mL，其中 B 組與 A、C 組相比，P均＜0.05。a、b、c 組細(xì)胞中炎性因子 IL-6 表達(dá)水平分別為（2.85 ± 0.14）、（4.32 ± 0.39）、（3.01 ± 0.25）ng/mL，其中b 組與a、c組相比，P均＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 A、B、C 組細(xì)胞凋亡率分別為7.90% ± 0.80%、13.00% ± 0.64%、9.47% ±0.35%，其中B 組與A、C 組相比，P均＜0.05。a、b、c組細(xì)胞凋亡率分別為2.00% ± 0.60%、5.70% ±0.49%、2.60% ± 0.70%，其中 b 組與 a、c 組相比，P均＜0.05。

3 討論

研究［4，8］表明，許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中均有炎癥反應(yīng)的參與。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是包括帕金森氏病、阿爾茨海默病和肌萎縮側(cè)索硬化癥在內(nèi)的各種神經(jīng)退行性疾病的最顯著特征之一。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡參與許多神經(jīng)退行性疾病，比如阿爾茨海默病、帕金森病等［9］。在病理狀態(tài)下，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放與疾病有關(guān)的炎癥介質(zhì)，從而促進(jìn)神經(jīng)炎癥，并進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［10］。小膠質(zhì)細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，其清除腦內(nèi)壞死或凋亡的神經(jīng)元，吞噬潛在的有害物質(zhì)及細(xì)胞碎屑，參與突觸的重塑，起到維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常組織穩(wěn)態(tài)的作用［11］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是異質(zhì)性的，可分為兩種截然相反的類型：M1表型和M2表型。根據(jù)被激活的表型，小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性或神經(jīng)保護(hù)作用［12］。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生 TNF-α、IL-1β、IL-6 等多炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死，對神經(jīng)系統(tǒng)有損害的作用。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞激活后發(fā)揮吞噬作用，分泌大量抗炎因子、營養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分以及神經(jīng)元遞質(zhì)樣分子，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用［13-14］。綜上所述，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病中起著至關(guān)重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生或惡化的可能機(jī)制［15］。小膠質(zhì)細(xì)胞的長時間激活會導(dǎo)致活性氧（ROS）和促炎細(xì)胞因子等有害分子的過度產(chǎn)生，從而導(dǎo)致有害的細(xì)胞效應(yīng)，并常常導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。LPS是經(jīng)典的炎癥模型誘導(dǎo)物。研究［9］表明，在神經(jīng)退行性病變周圍，通常能發(fā)現(xiàn)被活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。持續(xù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子，加速多種神經(jīng)退行性疾病的疾病進(jìn)展。用LPS 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的急性炎癥后，小膠質(zhì)細(xì)胞會觸發(fā)急性炎癥反應(yīng)，分泌大量炎癥因子［16］。然而在 HMC3 細(xì)胞中，相關(guān)研究［17］報(bào)道，HMC3 細(xì)胞分泌的 TNF-α、IL-1β 較低，不足以被炎癥刺激，但可引起IL-6 的升高。有研究［18］表明，LPS能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但是并不能有效準(zhǔn)確模擬阿爾茨海默病和觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而化學(xué)合成的Aβ1-42寡聚體對細(xì)胞具有毒性作用并能刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。因此，我們也用Aβ1-42構(gòu)建小膠質(zhì)細(xì)胞的慢性炎癥模型。所以，在本研究中，我們觀察了在LPS 或Aβ1-42刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡率。

miR-146a 是眾所周知的與炎癥相關(guān)的microR?NA，miR-146a的相關(guān)單核苷酸多態(tài)性與多種炎癥性疾病有關(guān)［19］。研究［19］表明，miR-146a 基因多態(tài)性與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且miR-146a 表達(dá)水平的改變在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中是至關(guān)重要。miR-146a 的靶基因還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，特別是神經(jīng)炎性反應(yīng)［20-22］。綜上所述，miR-146a 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展過程中的神經(jīng)炎癥中起重要作用，可能會成為一個有前景的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在前期的實(shí)驗(yàn)中，我們驗(yàn)證了100 ng/mL 的 LPS 刺激 HMC3 72 h 后炎癥因子 IL-6表達(dá)水平較高，5 μmol/L 的Aβ1-42刺激HMC3 72 h 后炎癥因子IL-6 表達(dá)水平較高，所以后續(xù)選用為此濃度和時間點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，在100 ng/mL的LPS或5 μmol/L 的Aβ1-42刺激下，HMC3 細(xì)胞的炎癥因子IL-6 的表達(dá)水平上升，而轉(zhuǎn)染miR-146a mimics 后可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子IL-6 的分泌，從而降低炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步探究其凋亡水平，在100 ng/mL的 LPS 或 5 μmol/L 的 Aβ1-42刺激下，HMC3 細(xì)胞凋亡率升高，而轉(zhuǎn)染 miR-146a mimics 后，HMC3 細(xì)胞凋亡率得到抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-146a 可抑制LPS和Aβ1-42誘導(dǎo)下HMC3細(xì)胞中炎性因子IL-6的分泌，還可進(jìn)一步抑制凋亡，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

綜上所述，轉(zhuǎn)染miR-146a對LPS或Aβ1-42誘導(dǎo)的HMC3 炎癥反應(yīng)具有抑制作用，并可降低其凋亡率。因此，我們認(rèn)為miR-146a 有望成為改善神經(jīng)炎性疾病及神經(jīng)退行性病變的治療靶點(diǎn)，但miR-146a 對神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制有待在動物體內(nèi)進(jìn)一步研究。