乙酰左旋肉堿對(duì)脊髓損傷后線粒體的保護(hù)作用研究進(jìn)展

崔 佳，劉敏麗

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

脊髓損傷是由短時(shí)間內(nèi)機(jī)械力直接破壞的原發(fā)性原因或原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上啟動(dòng)的多種生化反應(yīng)和多細(xì)胞參與的應(yīng)激反應(yīng)的繼發(fā)性原因所造成的脊髓形態(tài)破壞、感覺(jué)喪失、所支配的肌肉運(yùn)動(dòng)障礙等功能異常的疾病。流行病學(xué)研究顯示，2012年美國(guó)急性創(chuàng)傷性脊髓損傷的年發(fā)病率約54/100萬(wàn)且在過(guò)去10年間保持穩(wěn)定狀態(tài)，其中年輕男性(16～44歲)的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，而65歲以上老年人的發(fā)病率出現(xiàn)了明顯增長(zhǎng)[1]。不同于發(fā)達(dá)國(guó)家，中國(guó)脊髓損傷年患病率約37/100萬(wàn)，年齡多在34.7～54.4歲且男性多于女性，主要原因是汽車(chē)碰撞和高空墜落[2]。

在脊髓損傷的最初急性期之后，細(xì)胞和炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)作用將導(dǎo)致原發(fā)損傷部位周?chē)窠?jīng)組織的進(jìn)行性繼發(fā)性損傷，表現(xiàn)為電解質(zhì)異常、自由基形成、血管缺血、水腫、創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡或遺傳細(xì)胞程序性死亡等[3]。作為機(jī)制復(fù)雜而預(yù)后不良的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，脊髓損傷經(jīng)常出現(xiàn)損傷平面以下感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及自主神經(jīng)等功能障礙，給患者帶來(lái)極大痛苦。脊髓損傷的修復(fù)重點(diǎn)在于對(duì)繼發(fā)性損傷的調(diào)控和治療[4]，臨床上有很多方案，如手術(shù)治療、藥物治療(如甲基強(qiáng)的松龍[5])、高壓氧治療[6]、干細(xì)胞治療[7]、針刺治療[8]等。目前公認(rèn)線粒體氧化損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是急性脊髓損傷的重要致病機(jī)制，因此保護(hù)急性脊髓損傷后受損組織的線粒體成為治療脊髓損傷的關(guān)鍵。乙酰左旋肉堿(Acetyl L-carnitine，ALC)是生物體內(nèi)含量最豐富的左旋肉堿衍生物，其抗炎癥、抗氧化、抗凋亡及促進(jìn)脂肪代謝等生物學(xué)作用可能對(duì)脊髓損傷的治療有重要意義。

1 脊髓損傷對(duì)線粒體的影響

隨著脊髓損傷時(shí)間延長(zhǎng)，透射電鏡觀察損傷區(qū)域線粒體逐漸出現(xiàn)嵴排列紊亂、嵴腫脹、膜破裂和空泡化，傷后24 h視野內(nèi)線粒體大小不一，形態(tài)不規(guī)則，破壞嚴(yán)重。脊髓損傷后線粒體膜Na+-K+-ATP酶活性降低，生成ATP逐漸減少，產(chǎn)能受阻，供能不足。脊髓損傷2 h后Caspase-3表達(dá)即逐漸增多，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，幾乎同時(shí)細(xì)胞色素C釋放逐漸增加，調(diào)控能量代謝和細(xì)胞凋亡。脊髓損傷后脊髓組織丙二醛(MDA)水平增高，谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)水平降低，表明線粒體抗氧化水平下降，自由基氧化反應(yīng)增強(qiáng)，氧化損傷加重。賈志強(qiáng)[9]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，急性脊髓損傷后線粒體膜電位水平明顯降低。

2 ALC對(duì)脊髓損傷后線粒體的保護(hù)作用

ALC是生物體內(nèi)含量最豐富的左旋肉堿乙酰化衍生物，天然存在于機(jī)體，主要合成于哺乳動(dòng)物的肝臟、腎臟和腦組織中，主要儲(chǔ)存于哺乳動(dòng)物的肌肉、心臟和骨骼中[10-11]。ALC合成和轉(zhuǎn)化過(guò)程如下：在線粒體內(nèi)膜上，乙酰輔酶A和左旋肉堿在肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化下合成ALC，后者通過(guò)肉堿/乙酰肉堿?；D(zhuǎn)位酶進(jìn)入線粒體基質(zhì)并轉(zhuǎn)化為肉堿和乙酰輔酶A，肉堿穿線粒體基質(zhì)進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，乙酰輔酶A和膽堿在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下生成乙酰膽堿[12]。ALC具有多種生理活性，包括營(yíng)養(yǎng)作用、神經(jīng)保護(hù)、周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)止痛、脂肪酸β氧化調(diào)節(jié)、機(jī)體抗氧化調(diào)節(jié)等。ALC因?qū)χ委熌行陨芰Φ拖掠泻芎玫男Ч鴱V泛應(yīng)用于臨床，其機(jī)制包括促進(jìn)精子成熟、增加精子運(yùn)動(dòng)性、加快精子新陳代謝、促進(jìn)附睪成熟等[13]。近年來(lái)，ALC也開(kāi)始應(yīng)用于阿爾茨海默病[14]、帕金森病[15]、抑郁癥[16]以及糖尿病周?chē)窠?jīng)病變[17]等疾病，并取得了良好效果。其對(duì)線粒體的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在抑制線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡、改善線粒體能量代謝、穩(wěn)定線粒體膜電位(MMP)、增強(qiáng)線粒體自噬幾個(gè)方面。

2.1 抑制線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體在受到各種有害刺激時(shí)，氧化和抗氧化機(jī)制失衡，活性氧類(lèi)自由基(ROS)和活性氮類(lèi)自由基等產(chǎn)生明顯增多，造成細(xì)胞代謝紊亂和功能異常、蛋白質(zhì)損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化等的過(guò)程。ROS產(chǎn)生的主要途徑包括NADPH氧化酶、線粒體、黃嘌呤氧化酶、解偶聯(lián)的內(nèi)皮型NO合酶、環(huán)氧合酶和脂氧合酶等[18]。當(dāng)脊髓損傷導(dǎo)致氧化和抗氧化機(jī)制失衡時(shí)，線粒體產(chǎn)生的ROS將明顯增多并大量堆積，誘發(fā)線粒體氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙。作為抗氧化劑、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和神經(jīng)保護(hù)劑，ALC顯示出極好的安全性和耐受性。早在20世紀(jì)末，就有很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了ALC抑制氧化應(yīng)激的潛在價(jià)值。ALC可顯著減弱蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞凋亡，其部分可能是通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)GSH和熱休克蛋白水平來(lái)完成的。趙興長(zhǎng)等[19]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用ALC處理脊髓損傷的大鼠后，大鼠的 MDA水平明顯降低，SOD活性明顯增加，Caspase-3表達(dá)量明顯下降，證實(shí)ALC可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Wang等[20]研究也支持這一結(jié)論。

2.2 抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是在凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下，由基因、酶和多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡過(guò)程。凋亡相關(guān)基因包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因如p53等，其中Caspase-3是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志分子。真核細(xì)胞主要通過(guò)死亡受體、線粒體、穿孔素/顆粒酶和細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)四種通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。邵海永[22]研究發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷后6 h即發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象并隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，還發(fā)現(xiàn)脊髓損傷局部細(xì)胞大量死亡是由細(xì)胞凋亡所致，因此抑制細(xì)胞凋亡是保護(hù)神經(jīng)元和修復(fù)脊髓損傷的關(guān)鍵。Patel等[23]研究發(fā)現(xiàn)，ALC可明顯恢復(fù)脊髓損傷導(dǎo)致的線粒體功能異常，其機(jī)制可能是增強(qiáng)受損線粒體中某些酶的作用，如提高琥珀酸脫氫酶、乙酰輔酶A等的活性。孟慶峰等[24]研究顯示，ALC可增強(qiáng)大鼠脊髓損傷后細(xì)胞自噬作用，也能明顯抑制細(xì)胞凋亡?？傊?，ALC可有效防止線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，改善線粒體功能，減輕神經(jīng)損傷，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

2.3 改善線粒體能量代謝 線粒體作為機(jī)體的動(dòng)力工廠，產(chǎn)生能量供給機(jī)體正常生命活動(dòng)。ALC作為乙酰膽堿的前體，不僅可以調(diào)控脂肪酸β氧化釋放能量，也能自身參與三羧酸循環(huán)生成ATP。Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，ALC的乙酰基部分可通過(guò)大鼠前腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的三羧酸循環(huán)代謝為能量，也可與三羧酸循環(huán)形成的谷氨酸、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸結(jié)合，表明發(fā)育中的大腦能使用外源性ALC進(jìn)行能量代謝，ALC作為能量底物在損傷后早期給藥可以提供神經(jīng)保護(hù)，促進(jìn)腦的氧化供能，減少無(wú)氧糖酵解。Ferreira等[12]的研究也得出了類(lèi)似結(jié)論，在成人、新生兒和兒童腦損傷模型中，ALC可以改善機(jī)體能量狀態(tài)，降低應(yīng)激反應(yīng)，并防止后續(xù)細(xì)胞死亡。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ALC可以作用于初級(jí)代謝、能量產(chǎn)生，通過(guò)氧化和尿素循環(huán)促進(jìn)氨消除，而氨蓄積和能量耗竭似乎是大多數(shù)神經(jīng)毒性事件的基礎(chǔ)，由此證實(shí)ALC對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了積極影響。

2.4 穩(wěn)定MMP 正常的MMP是線粒體發(fā)生氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的必要條件，一旦出現(xiàn)異常，線粒體就不能進(jìn)行正常能量代謝和其他正常生命活動(dòng)，會(huì)逐漸導(dǎo)致細(xì)胞死亡。MMP下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志，因此維持正常的MMP是減少細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[26]。賈志強(qiáng)[9]研究發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷后線粒體膜電位處于下降趨勢(shì)。邵海永[22]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷后局部會(huì)因細(xì)胞外液興奮性氨基酸濃度升高而引起Ca2+內(nèi)流。以上兩種變化都可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡：MMP下降會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)兼有調(diào)控能量代謝和細(xì)胞凋亡雙重功能的細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，再通過(guò)募集、活化等途徑激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要蛋白酶Caspase-3，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Ca2+內(nèi)流會(huì)造成線粒體內(nèi)Ca2+超載，目前一致認(rèn)為線粒體Ca2+超載在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要的作用，可能與其造成線粒體膜電位消失并通過(guò)一系列反應(yīng)介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡有關(guān)。多個(gè)研究[27]證明ALC對(duì)不同方式誘導(dǎo)的線粒體損傷都有保護(hù)作用，其中一個(gè)方面即是穩(wěn)定MMP，因此證實(shí)ALC可以通過(guò)穩(wěn)定MMP來(lái)減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損脊髓。

2.5 增強(qiáng)線粒體自噬 線粒體自噬是在自噬相關(guān)因子如NIX、ATG1/ULK1、LC3、ATG5、PINK1-Parkin信號(hào)通路等的作用下，由細(xì)胞形成雙層膜的自噬小體，包裹衰老或損傷的線粒體并與溶酶體結(jié)合，再被酸性水解酶降解的過(guò)程[28]。標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ的值反映細(xì)胞自噬情況，是觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象、研究自噬活性最可靠的指標(biāo)。研究[29-30]顯示，大鼠脊髓損傷后胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)目減少、嵴腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)松散、有空泡，產(chǎn)生的自噬溶酶體內(nèi)可見(jiàn)受損的線粒體結(jié)構(gòu)，說(shuō)明脊髓損傷時(shí)的確發(fā)生了線粒體自噬。孟慶峰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷后ALC治療組的LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明ALC不僅提高了大鼠脊髓損傷后細(xì)胞自噬水平，也抑制了細(xì)胞凋亡。因此，增強(qiáng)脊髓損傷后線粒體自噬水平是減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡的有效途徑。也有學(xué)者認(rèn)為，脊髓損傷發(fā)生過(guò)程中，可能是MMP降低或能量缺乏啟動(dòng)了線粒體自噬，清除胞漿中損傷的線粒體和其他異常分子，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。雖然具體機(jī)制還不清楚，但ALC確實(shí)可以通過(guò)促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷后細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減輕神經(jīng)損傷，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

3 結(jié) 語(yǔ)

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，已有大量研究表明保護(hù)線粒體是治療脊髓損傷的中心環(huán)節(jié)。ALC通過(guò)抑制線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、改善線粒體能量代謝、穩(wěn)定MMP、增強(qiáng)線粒體自噬等途徑來(lái)保護(hù)線粒體。以上途徑是相輔相成的，ALC多層次、多角度地作用于線粒體，保證線粒體的正常生命代謝活動(dòng)和功能，但其最終通路都是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減輕神經(jīng)損傷，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。鑒于ALC優(yōu)秀的線粒體保護(hù)作用，其可能會(huì)在未來(lái)脊髓損傷的臨床治療中發(fā)揮積極作用，但其具體機(jī)制和劑量應(yīng)用等方面還有賴(lài)于更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。