中藥對(duì)耐藥菌生物膜抑制作用的研究進(jìn)展

解尋 孔晉亮 羅勁 盧樺崧 劉冬梅

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（南寧 530021）

生物膜（BF）是細(xì)菌生長的一種自然形式，在自然環(huán)境中無所不在。它是附著于組織表面，并嵌在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的菌群。BF是在幾十億年的生存壓力下形成，是耐藥菌能夠適應(yīng)幾乎所有的生存環(huán)境的一種生存方式［1-2］。與浮游菌相比，由于BF的屏障等作用，病原菌對(duì)抗生素的耐藥性要明顯高出10～1 000倍［3］。同時(shí)，在BF的保護(hù)下，病原體逃避宿主免疫攻擊，從而使病原體難以被清除，形成慢性感染灶［2］。目前在臨床上對(duì)抗感染的主要辦法抗生素等抗菌藥物存在著一定的副作用，并且病原菌能夠產(chǎn)生BF從而對(duì)此類藥物更加容易產(chǎn)生耐藥性［3-4］。而中草藥等天然植物的提取物在防治感染性疾病中有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，有著藥效持續(xù)時(shí)間長，成本低易獲取，較少出現(xiàn)毒副作用，不易產(chǎn)生耐藥，作用位點(diǎn)豐富等特點(diǎn)［5］。因此，中草藥提取物在抑制細(xì)菌BF感染方面將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。近年來大量研究表明，中藥提取物能夠在體外對(duì)BF有良好的抑制作用。但體外模型中的情況與在人體內(nèi)的情況有很大不同，并不能模擬宿主環(huán)境的復(fù)雜性，需要進(jìn)行更多動(dòng)物模型方面的研究［6］。本文試將耐藥菌BF耐藥機(jī)制及近年來不同中藥提取物對(duì)各種細(xì)菌體內(nèi)BF形成干預(yù)研究的進(jìn)展情況進(jìn)行綜述，以期為挖掘新的抗菌藥物以及中藥提取物應(yīng)用于臨床提供指導(dǎo)性意見。

1 BF耐藥機(jī)制研究

1.1 屏障作用 有研究表明，相對(duì)于浮游狀態(tài)，由于BF的包裹，感染暫時(shí)局限化，但是其屏障作用能夠保護(hù)BF菌免受藥物以及機(jī)體免疫的清除［3］。DJERIBI等［7］的研究表明，BF通過其致密的結(jié)構(gòu)，以及分子間相互作用力阻止抗菌藥物進(jìn)入BF內(nèi)，從而提高BF菌的耐藥性。

1.2 外排泵 外排泵作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⒍喾N化合物排出BF外，其中包括代謝產(chǎn)物與抗菌藥物。由于BF中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)受限促使外排泵基因表達(dá)增強(qiáng)，使細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性增強(qiáng)［8］。同時(shí)，外排泵還能夠?qū)⑷后w感應(yīng)（QS）信號(hào)分子排出，通過調(diào)節(jié)QS信號(hào)通路，影響B(tài)F形成［9］。

1.3 QS信號(hào)通路 QS信號(hào)通路是單個(gè)細(xì)菌之間為了應(yīng)對(duì)外部環(huán)境，通過信號(hào)交流調(diào)控并最終調(diào)節(jié)群體行為依托的信號(hào)通路，它對(duì)于整個(gè)BF的適應(yīng)和生存是至關(guān)重要的。細(xì)菌可通過QS系統(tǒng)調(diào)控自身基因，刺激產(chǎn)生大量胞外多糖，使BF的結(jié)構(gòu)更加致密，強(qiáng)度增強(qiáng)，對(duì)外來威脅的抵抗能力更強(qiáng)。此外，QS系統(tǒng)還能響應(yīng)細(xì)菌密度與環(huán)境壓力的變化，使BF對(duì)藥物的抗性增強(qiáng)［10-11］。

1.4 環(huán)鳥二苷（c-di-GMP）信號(hào)通路 c-di-GMP是一種普遍存在于細(xì)菌中的第二信使分子，高水平的c-di-GMP會(huì)降低鞭毛活性，增加黏附素和胞外多糖的表達(dá)［12］。此外，c-di-GMP水平還影響到細(xì)菌生長代謝速率、膜通透性等BF形成相關(guān)因素［13］。c-di-GMP信號(hào)通路還能夠通過調(diào)節(jié)QS信號(hào)通路對(duì)BF形成進(jìn)行調(diào)控［14］。

2 中藥抗耐藥菌BF的體內(nèi)研究

2.1 甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA） 金黃色葡萄球菌是院內(nèi)感染中培養(yǎng)出的最常見的革蘭氏陽性菌之一，隨著生物植入材料的廣泛應(yīng)用，金葡菌也是臨床因BF導(dǎo)致的醫(yī)療導(dǎo)管相關(guān)感染引起的敗血癥中最常見的致病菌之一［15］。黃芩是一味我國常見中草藥，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃芩的主要作用成分黃芩苷對(duì)QS系統(tǒng)有抑制作用，并且能夠減少金葡菌BF的形成［16］。杜仲業(yè)在過去的實(shí)驗(yàn)中證明黃芩苷能夠在體外破壞金黃色葡萄球菌BF，并在與利奈唑胺聯(lián)合使用時(shí)能夠起到協(xié)同作用，使利奈唑胺能夠更加輕易進(jìn)入細(xì)菌的BF內(nèi)，然后殺滅膜內(nèi)活菌。為進(jìn)一步研究黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺在體內(nèi)抗生物膜效果，杜嘗試構(gòu)建了大鼠體內(nèi)的金葡菌BF感染模型。結(jié)果表明，黃芩苷對(duì)金葡菌在大鼠體內(nèi)形成的BF有破壞作用，但是對(duì)膜內(nèi)的細(xì)菌沒有殺滅作用或殺滅作用較低［17］。

香葉醇是一種無環(huán)單萜醇，天然存在于檸檬、檸檬草、薰衣草的精油中。在Kannappan的研究中，秀麗隱桿線蟲被用來作為金葡菌載體。該研究證實(shí)，與單藥組或未加處理的對(duì)照組相比，香葉醇和頭孢噻肟聯(lián)合使用能夠更有效的抑制病原體形成 BF［18］。

Peng的研究表明，在金黃色葡萄球菌假體周圍關(guān)節(jié)感染模型中，姜黃素納米顆粒（CURN）能夠抑制金葡菌BF誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MDSCs）的擴(kuò)增并提高M(jìn)2表型細(xì)胞的表達(dá)水平，以逆轉(zhuǎn)BF誘導(dǎo)的T細(xì)胞下降，從而聯(lián)合萬古霉素使金葡菌BF相關(guān)感染引起的滲透性破壞有效地恢復(fù)［19］。

2.2 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA） 吳寶林在對(duì)復(fù)春散1號(hào)對(duì)MRSA感染創(chuàng)面的療效研究中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用復(fù)春散1號(hào)能夠?qū)?chuàng)面MRSA生物被膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，而聯(lián)合利福平可以更好地清除MRSA生物被膜［20］。而在另一項(xiàng)關(guān)于金黃色葡萄球菌BF慢性創(chuàng)面感染的研究中，黃芩聯(lián)合莫匹羅星被證實(shí)能夠通過破壞創(chuàng)面BF，減少創(chuàng)面痂下組織菌量，加快創(chuàng)面愈合，提高療效［21］。

WANG的研究表明［22］，黃芩苷能夠抑制MRSA的生長，減少BF形成，從而減少感染相關(guān)的組織損傷，提高M(jìn)RSA感染小鼠的總存活率。而另一項(xiàng)關(guān)于花旗松素的研究證明，花旗松素通過干擾黏附階段抑制BF形成，從而提高M(jìn)ASR小鼠存活率。而該藥對(duì)成熟BF并無破壞作用［23］。

2.3 表皮葡萄球菌 表皮葡萄球菌是一種通常存活于正常人皮膚表面的菌群，一般情況下并不致病，但可介入治療等特殊情況下可伴隨分子材料進(jìn)入人體，在入侵血液循環(huán)后還可導(dǎo)致敗血癥，產(chǎn)生嚴(yán)重后果［24］。KANNAPPAN等［18］對(duì)表皮葡萄球菌也做了相同的體內(nèi)研究，在香葉醇和頭孢噻肟不同組合的處理下，得到了與金黃色葡萄球菌相同的結(jié)果。

2.4 銅綠假單胞菌（PA） 銅綠假單胞菌是一種需氧型革蘭陰性菌，屬于機(jī)會(huì)致病菌，是住院患者等免疫力低下人群易感的病原菌之一［25］。蒜素是大蒜的主要有效成分之一，對(duì)多種病原微生物有不同程度的殺滅和抑制作用。在這方面，BJARNSHOLT等［26］在小鼠肺部感染模型中發(fā)現(xiàn)大蒜提取物使銅綠假單胞菌對(duì)妥布霉素、呼吸爆發(fā)，以及中性粒細(xì)胞吞噬反應(yīng)敏感性增加。HARJAI等［27］在小鼠尿路感染模型中，大蒜提取物還能夠減少毒力因子的加工，和減少銅綠假單胞菌的QS信號(hào)。

為了探討黃芩苷與美羅培南（MEM）單藥和聯(lián)合使用對(duì)銅綠假單胞菌BF體內(nèi)感染的作用。岑艷靈等構(gòu)建了銅綠假單胞菌小鼠腹腔感染形成早期BF的感染模型。該研究表明，單獨(dú)使用黃芩苷能夠一定程度上破壞銅綠假單胞菌體內(nèi)感染早期形成的BF，而與MEM聯(lián)合用藥能夠顯著增強(qiáng)其對(duì)BF感染的殺菌作用［28］。另外，同一課題組的LUO的研究中［29］，證實(shí)了黃芩苷能夠抑制銅綠假單胞菌的QS基因，導(dǎo)致QS信號(hào)分子減少，從而降低毒力因子的產(chǎn)生以及生物被膜的形成。這一結(jié)果在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中同時(shí)得到了證實(shí)。

綠原酸也能通過調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)，減弱PA在體內(nèi)的毒力以及BF的形成，導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲和小鼠感染模型的致病性降低［30］。

2.5 白色念珠菌 白色念珠菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，是侵襲性念珠菌病最常見的病原體，其產(chǎn)生的BF是白色念珠菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因［31-32］。炎琥寧（YHN）是天然植物穿心蓮的主要作用成分穿心蓮內(nèi)酯的一種衍生物，具有祛熱解毒，消炎止痛的功效。施高翔等人為探究YHN在大鼠體內(nèi)對(duì)白念珠菌BF的作用，建立了白念珠菌大鼠皮下導(dǎo)管模型。結(jié)果表明，炎琥寧能在白念珠菌BF的形成過程中起到有效的抑制作用，并存在濃度依賴性。同時(shí)YHN且能夠明顯的降低白色念珠菌在黏附于導(dǎo)管上的能力，這極可能是降低大鼠體內(nèi)白色念珠菌BF的形成的原因之一［33］。

2.6 致齲菌 曹茜茜在探究人參皂苷Rh2對(duì)致齲菌BF的作用時(shí)進(jìn)行了體內(nèi)外研究。通過結(jié)晶紫染色法和激光共聚焦掃描顯微鏡觀察體外BF的改變，并建立大鼠齲齒模型，通過頜骨顯微斷層掃描以及Keyes齲齒計(jì)分評(píng)價(jià)人參皂苷Rh2的抗齲作用。結(jié)果表明，Rh2能夠在體外模型中抑制致齲菌的BF形成，并且在體內(nèi)也有一定的抗齲保護(hù)能力［34］。

2.7 混合感染 王瑤等在他們的研究中建立燒傷后混合感染銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的小鼠模型，用于探究燒傷創(chuàng)面感染的防治方法。該研究用穿心蓮內(nèi)酯和慶大霉素對(duì)小鼠燒傷創(chuàng)面進(jìn)行干預(yù)處理。其結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯與慶大霉素具有協(xié)同作用，穿心蓮內(nèi)酯能夠促進(jìn)慶大霉素破壞BF，減少炎癥因子及毒力因子［35］。另外，SHAN等［36］在研究金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜相關(guān)慢性難治性傷口大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)清熱敗毒合劑與五味消毒飲均能下調(diào)AI-2從而抑制BF的形成，并且能夠上調(diào)HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α以及VEGF，同時(shí)聚集巨噬細(xì)胞，促進(jìn)肉芽生長，提高傷口愈合速度。

3 總結(jié)與展望

目前，如何治療BF耐藥菌相關(guān)感染是對(duì)臨床上抗菌治療的極大挑戰(zhàn)，破壞和抑制BF形成也是我們?cè)谀退幘委熤械难芯恐攸c(diǎn)。如本文所述，中草藥資源為篩選抗BF制劑提供了巨大的資源。中藥提取物通過調(diào)節(jié)QS系統(tǒng)、降低黏附能力、提高免疫細(xì)胞反應(yīng)、與抗生素協(xié)同等多種途徑起到抗BF作用，有著廣泛的藥理作用和臨床實(shí)用價(jià)值。盡管中藥抗BF作用研究已取得了一定的進(jìn)展，但相比大量的體外研究，體內(nèi)試驗(yàn)相關(guān)研究明顯較少，而中藥能夠在動(dòng)物模型中起到良好的抗BF作用是進(jìn)入臨床極其重要的一環(huán)，所以未來需要更多的體內(nèi)外結(jié)合試驗(yàn)，為中藥應(yīng)用于臨床提供更加充足的證據(jù)。鑒于多種中藥無論單用或者聯(lián)用抗菌素，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都能起到很好的效果，且存在如黃芩苷這種對(duì)耐藥菌無殺滅作用，而對(duì)BF有破壞作用的藥物，這提示可能會(huì)有大量本身無抗菌作用或抗菌效果不明顯的藥物在聯(lián)用抗菌素的時(shí)候可能會(huì)起到很好的效果，而又因其對(duì)菌本身無殺滅作用而不易產(chǎn)生耐藥性，這可能是今后研究的方向之一。在臨床上，應(yīng)用于抗BF相關(guān)感染的中藥制劑并不多見，今后還因?qū)⒋罅矿w外研究結(jié)果在動(dòng)物模型中加以驗(yàn)證，將中藥抗BF的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床治療方案，為臨床抗BF相關(guān)感染這一問題提供更多的治療選擇，這將對(duì)控制BF相關(guān)感染性疾病產(chǎn)生重大影響，為世界各國的健康衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的收益。