不同生態(tài)區(qū)煙葉新植二烯含量的反吹氣相色譜法檢測與分析

王冰 趙樂 余晶晶 蔡君蘭 丁美宙 彭斌 趙俊偉 趙曉東 秦亞瓊 劉克建 劉紹鋒 謝復煒

摘 要：為快速測定煙葉新植二烯含量，構建了5 m DB-5ms預分離柱結合10 m DB-5ms分析柱的反吹柱系統(tǒng)，確立了反吹壓力103 kPa，反吹時間4.5 min的色譜條件及采用10 mL二氯甲烷渦旋提取0.5 g煙粉5 min的前處理方法，并對114個國內外代表性煙樣進行了分析。結果表明：①新植二烯在10～200 μg/mL范圍內線性良好（相關系數(shù)r?0.999 9）。新植二烯定量限為16 μg/g，加標回收率在98%～101%之間，日間、日內相對標準偏差分別為1.81%和1.76%，長期（兩年）相對標準偏差小于5%。每個樣品分析時間僅為8 min。②將國內5個生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進口煙葉中新植二烯含量進行對比分析，西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進口煙葉無顯著性差異;其余4個生態(tài)區(qū)（武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵）煙葉與代表性進口煙葉有顯著性差異。③無論從整體還是從每個生態(tài)區(qū)分析煙葉新植二烯含量，上部煙葉與中部煙葉無顯著性差異，與下部煙葉相比，均有顯著性差異，下部煙葉新植二烯含量較高。本研究通過反吹氣相色譜-火焰離子化檢測器檢測煙葉新植二烯含量，所建方法簡單、快速、靈敏度高、重復性好，可用于不同產區(qū)、不同部位煙葉中新植二烯含量的批量定量檢測。

關鍵詞：煙葉;新植二烯;反吹技術;氣相色譜

Abstract： In order to rapidly analyze neophytadiene in tobacco leaves， a back blowing column system （5 m DB-5ms pre separation column combined with 10 m DB-5ms analysis column） was developed. Chromatographic conditions （back blowing pressure of 103 kPa and back blowing time of 4.5 min） and pretreatment method （extracting 0.5 g tobacco powder with 10 mL dichloromethane vortexing for 5 min） were established， 114 representative tobacco samples at home and abroad were analyzed. The results showed that： 1） In a range of 10-200 μg/mL， neophytadiene had good linear relationship （r?0.999 9）. The limit of quantitation of neophytadiene was 16 μg/g. The spiked recoveries ranged from 98% to 101%， the relative standard deviations （RSD） of inter day and intra day were 1.8% and 1.76% respectively and the long-term （Two-year） RSD was less than 5%. The analysis time of each sample was only 8 min; 2） The contents of neophytadiene in tobacco leaves from five domestic ecological regions and abroad were compared， and no significant differences were found between the southwest plateau ecological region and abroad， but significant differences were observed between the other four domestic ecological regions （Wuling Qinba， Nanling hills， Wuyi hills， Yimeng hills） and abroad; 3） By analyzing the neophytadiene in tobacco leaves from the whole or each individual ecological region， no significant differences were found between the upper and middle leaves， but when compared with the lower leaves， there were significant differences and the content of neophytadiene in the lower leaves was higher. In this study， neophytadiene in tobacco leaves was detected by back blowing gas chromatography and flame photometric detector. The method was simple， rapid， sensitive and reproducible. It can be used for batch quantitative determination of neophytadiene in different parts of tobacco leaves from different production regions.

Keywords： tobacco; neophytadiene; back-flush technique; gas chromatography

新植二烯屬葉綠素降解產物，是烤煙中含量最高的中性致香成分，占煙葉鮮重的0.06%～0.1%，可作為煙氣氣溶膠內香氣物質的載體，具有攜帶煙葉中致香成分進入煙氣的能力，是煙葉重要的增香劑[1-2]。在煙草燃燒時，新植二烯可直接進入煙氣，具有減輕刺激性，醇和煙氣的作用，其含量與煙氣柔和性顯著正相關[3];而且可進一步分解轉化為植物呋喃，能顯著增加烤煙的香氣和吃味，對煙葉質量、香氣風格有重大影響，是影響卷煙感官質量的主要影響因子之一[4]。

目前對于煙草中新植二烯的檢測方法，除楊盼盼等[5]報道的近紅外法快速測定初烤煙葉中新植二烯含量，其他大都是與煙草微量香味成分共同分析，存在前處理方法操作繁瑣、耗時費力，上機時間較長等缺陷，且大都采用相對定量方式[6-14]。關于煙草中新植二烯準確定量檢測方法的系統(tǒng)研究鮮有報道，尚未形成統(tǒng)一、規(guī)范化的標準檢測方法。

本文采用有機溶劑提取煙葉中新植二烯，對提取體系、提取溶劑和提取時間進行了優(yōu)化;結合氣相色譜反吹技術[15-18]采用火焰離子化檢測器進行檢測，以期提高檢測效率，為煙葉原料篩選提供技術支持和準確數(shù)據(jù)保證。

1 材料與方法

1.1 化學試劑與材料

二氯甲烷（色譜純，美國Acros Organics公司）;正十七烷（純度大于98%，百靈威公司）;新植二烯（純度均>80.0%，加拿大TRC公司）。根據(jù)全國烤煙煙葉香型風格區(qū)劃[19]研究結果，收集國內西南高原、武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵五大生態(tài)區(qū)上、中、下3個部位煙樣99個及巴西、津巴布韋、美國代表性煙葉11個，所選煙葉樣品均為2018年煙葉樣本。

1.2 設備

6890A氣相色譜儀[配有氫火焰離子化檢測器（FID）和壓力控制模塊（PCM），美國 Agilent Technologie]、SRL-3.7MB5C無油式螺桿空壓機（南京日立產機有限公司）、450cc氫氣發(fā)生器（英國PEAK）、精密電子天平（感量0.0001 g，德國Sartorius）、數(shù)顯型旋渦混合器（美國TALBOYS Advanced Multi-Tube Vortexer）、LC-223鼓風干燥箱（上海愛斯佩克環(huán)境設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 煙葉晾干后粉碎，過40目篩，室溫裝于封口袋中備用。按照YC/T 31—1996行業(yè)標準檢測煙樣含水率。稱取0.5 g煙粉于50 mL離心管，加入50 μL正十七烷內標溶液（內標物濃度為10 mg/mL）及10 mL二氯甲烷溶液，2500 r/min條件下渦旋提取5 min，10 000 r/min下離心3 min，取上清液過2 μm有機相濾膜于一1.5 mL色譜瓶中，等待BF-GC-FID分析。

1.3.2 標準工作溶液配制 稱取0.1 g正十七烷于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，配成內標溶液。

將10 mg新植二烯溶于10 mL容量瓶中并用二氯甲烷定容，配成標準儲備液。分別取100、200、500 μL，1、2 mL儲備液于5個10 mL容量瓶中，并分別加入50 μL內標溶液，配制成5級標準工作溶液，標線濃度范圍為10～200 μg/mL，內標濃度為50 μg/mL。

1.3.3 反吹氣相色譜質譜條件 色譜柱1：DB-5ms （5 m×0.25 mm，0.25 μm）;色譜柱2：DB-5ms（10 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣：N2;進樣口溫度：280 ℃;進樣量：1 μL;分流比為20∶1。進樣口壓力：131 kPa（保持4.5 min），然后以683 kPa/min速率降至34 kPa（保持3.5 min）。PCM壓力：103 kPa。升溫程序：初溫100 ℃，以20 ℃/min的升溫速度升到200 ℃，再以90 ℃/min的升溫速率升至290 ℃，保持3 min。FID參數(shù)：溫度300 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量25 mL/min。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 樣品數(shù)據(jù)為扣除水分后以干質量計含量。運用Excel 2010對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，運用SPSS Statistics 17.0對樣品新植二烯含量進行單因素方差分析。

2 結果與討論

2.1 反吹裝置介紹

反吹裝置如圖1所示，預柱、分析柱及PCM（壓力控制模塊）通過微流控三通相連。當進樣口壓力大于PCM壓力時，載氣流路如圖1A所示，化合物通過預柱及分析柱，進入FID檢測器。當進行反吹時（圖1B），PCM壓力大于進樣口壓力，目標化合物通過預柱、分析柱后進入FID，而不需要分析的化合物在載氣的帶動下，通過預柱，從進樣口反吹出去;通過反吹，在新植二烯后出峰的物質均被吹出，不再進入分析柱及檢測器。

2.2 氣相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 無反吹時樣品分離效果 采用色譜柱1（DB-5ms：5 m×0.25 mm，0.25 μm）為預柱，色譜柱2（DB-5ms：10 m×0.25 mm，0.25 μm）為分析柱進行預試驗，通過安捷倫Mass Hunter工作站自帶的壓力流量計算器計算可得，當進樣口壓力為131 kPa，PCM壓力為103 kPa，爐溫在100～200 ℃時（根據(jù)文獻[5]可知，新植二烯大約在200 ℃出峰），預柱與分析柱流量均為2～3 mL/min，可以實現(xiàn)快速分析新植二烯的預想。因此，設定進樣口壓力為131 kPa，PCM壓力為103 kPa，采用1.3.3中的程序升溫條件，進行預試驗，結果（圖2）表明，該系統(tǒng)下可實現(xiàn)樣品中新植二烯的基線分離;但柱系統(tǒng)中有大量雜質，需要高溫烘烤才能潔凈分析系統(tǒng)，以進行后續(xù)分析工作。

為了提高分析效率，可采用反吹技術。該技術的使用不僅可潔凈分析系統(tǒng)，增加其穩(wěn)定性，延長分析柱壽命，而且可節(jié)約分析時間，提高分析效率。

2.2.2 反吹時間優(yōu)化 由預試驗結果可知，不反吹時新植二烯出峰時間約為5.2 min，因此，分別將反吹時間設為3、4、4.5、5 min，即當分析時間為3、4、4.5、5 min時，將進樣口壓力由131 kPa迅速調至34 kPa，PCM壓力仍為103 kPa。通過安捷倫MassHunter工作站自帶的壓力流量計算器計算可得，預柱流量約為6 mL/min，分析柱流量約為2 mL/min，此時，既實現(xiàn)了快速反吹，又使分析柱保持了預期流速。將預試驗中進入分析柱的化合物通過反向吹掃，使之從進樣口出口快速吹出，不再進入分析柱及檢測器，吹掃時間3.5 min。試驗結果（圖3）表明，3 min反吹，內標尚未進入分析柱;4 min反吹，新植二烯尚未進入分析柱;4.5 min反吹，內標與新植二烯均進入分析柱，且達到基線分離;5 min反吹，已有雜質進入分析柱。因此，選擇4.5 min為反吹時間。整個分析過程8 min即可完成。

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取體系選擇 采取直接提取和泡發(fā)提取兩種體系進行試驗：①以二氯甲烷10 mL提取0.5 g干煙粉;②稱取0.5 g干煙粉，加入1 mL蒸餾水泡發(fā)10 min，以二氯甲烷10 mL進行提取。每組試驗平行3次。試驗結果表明（圖4），采用二氯甲烷對干煙粉中新植二烯的提取量比對泡發(fā)后煙葉的提取量高約15%。

2.3.2 提取溶劑選擇 考察了二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚3種溶劑的提取效果，每種溶劑平行試驗3次。結果表明（圖5），二氯甲烷的提取效果最好，新植二烯含量為1.20 mg/g，甲基叔丁基醚的提取效果最差，新植二烯含量為1.06 mg/g。

新植二烯學名為3-亞甲基-7，11，15-三甲基十六碳烯，是含有3個甲基、1個亞甲基的長鏈烯烴。由此可知，該物質具有弱極性，根據(jù)相似相容原理，具有弱極性的二氯甲烷比無極性的正己烷對新植二烯具有更高的提取效率，而甲基叔丁基醚的提取效率最低可能是由于其空間位阻所致。

2.3.3 提取料液比選擇 分別用10 mL二氯甲烷提取0.2、0.5、1.0、2.0 g煙粉，每個稱樣量平行試驗3次。結果表明（圖6），用10 mL二氯甲烷提取0.2、0.5、1.0 g煙粉時，新植二烯提取完全，計算結果均為1.20 mg/g，用10 mL二氯甲烷提取2.0 g煙粉時，計算結果為1.18 mg/g，略有降低。因此當用10 mL二氯甲烷提取煙葉中的新植二烯時，選取0.5 g為煙粉的稱樣量，此時可保證提取完全。

2.3.4 提取時間優(yōu)化 考察了提取5、10、15、20、25 min時新植二烯的提取效果，每個時間點平行試驗3次。結果表明（圖7），提取時間分別為5、10、15、20、25 min時，用10 mL二氯甲烷提取0.5 g干煙粉，煙粉中新植二烯的提取量是一致的，并沒有隨著提取時間的增加而增加，說明5 min即可完成對新植二烯的提取。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線、檢出限及定量限 將配制的系列標準工作溶液進行BF-GC-FID分析，采用內標法定量。以新植二烯與內標物的響應面積比為縱坐標，濃度比為橫坐標作圖（圖8），得到新植二烯的線性回歸方程及相關系數(shù)。將最低濃度的標準溶液重復進樣10次，分別以測定結果標準偏差的3倍和10 倍確定方法的檢出限和定量限。結果顯示，新植二烯的標準工作曲線線性關系良好（濃度范圍為10～200 μg/mL），相關系數(shù)平方為1;檢測限、定量限分別為4.90 μg/g、16.00 μg/g，遠低于煙葉提取液中新植二烯的質量分數(shù)，滿足對煙葉中新植二烯分析的檢測要求。

2.4.2 精密度及回收率 選取典型烤煙樣品，連續(xù)5 d進行試驗以考察方法日間精密度;同一天內，以相同前處理方法進行6次平行試驗，以考察方法日內精密度。以實際樣品含量為參考，根據(jù)新植二烯在煙末中含量的0.5、1、2倍進行低、中、高加標回收率試驗。結果表明，方法日間、日內相對標準偏差分別為1.81%和1.76%，新植二烯回收率在98%～102%。采用該方法，歷時兩年多，進行了2000余個煙樣中新植二烯含量的分析，監(jiān)控煙樣相對標準偏差小于5%。

2.5 樣品分析

2.5.1 不同產地煙葉新植二烯含量分析 采用所建立的方法對武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵、西南高原五大生態(tài)區(qū)上（B2F）、中（C3F）、下（X2F）3個部位99個煙樣及11個代表性進口煙葉新植二烯含量進行分析。測定結果（表1、圖9）表明：①所有煙樣可分為2組：西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進口煙葉為一組，其新植二烯含量沒有顯著性差異（p=0.211），均值分別為0.83、0.79 mg/g，變異系數(shù)分別為17.44%、17.82%。武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵4個生態(tài)區(qū)煙葉為一組，其新植二烯含量無顯著性差異（p = 0.472），均值含量分別為1.00、1.08、0.97、1.03 mg/g，變異系數(shù)分別為18.48%、15.08%、12.94%、12.85%。②兩組煙樣間新植二烯含量有顯著性差異（p<0.001）。西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進口煙葉新植二烯含量均值為0.81 mg/g，其余4個生態(tài)區(qū)煙葉新植二烯含量均值為1.02 mg/g，前者比后者低約21%。

2.5.2 不同部位煙葉新植二烯差異分析 對武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵、西南高原五大生態(tài)區(qū)上（B2F）、中（C3F）、下（X2F）3個部位99個煙樣新植二烯含量進行分析。結果（表2、圖10、圖11）表明，①總體來看，上部煙葉與中部煙葉新植二烯含量無顯著性差異（p=0.125）;上部煙葉、中部煙葉與下部煙葉相比均有顯著性差異（p<0.001）。上、中、下3個部位新植二烯均值含量分別為0.88、0.93、1.13 mg/g，變異系數(shù)分別為16.12%、14.30%、13.60%。下部煙葉新植二烯含量均值較高，與上部、中部煙葉相比，新植二烯含量約高25%。②每個生態(tài)區(qū)上、中、下3個部位煙葉新植二烯含量分析結果與總體煙樣分析結果趨勢相同，上部煙葉與中部煙葉新植二烯含量無顯著性差異，與下部煙葉相比，均有顯著性差異，下部煙葉新植二烯含量較高。

3 結 論

通過對前處理條件及氣相色譜條件的優(yōu)化，建立了采用10 mL二氯甲烷渦旋提取0.5 g煙粉5 min的前處理方法，構建了5 m DB-5ms預分離柱結合10 m DB-5ms分析柱的反吹柱系統(tǒng)，確立了103 kPa為反吹壓力，4.5 min為反吹時間的分析條件。樣品分析表明，國內五大生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進口煙葉相比，僅西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進口煙葉新植二烯含量較為接近;上、中、下3個部位煙葉相比，上部、中部煙葉新植二烯含量顯著低于下部煙葉。本研究建立的煙葉新植二烯檢測方法，前處理簡單、定量準確、重復性好，適合大量煙樣中新植二烯定量分析，為煙葉原料篩選、煙葉生態(tài)環(huán)境及加工工藝條件研究提供了技術支持。

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