珊瑚藻多糖酶法提取工藝優(yōu)化及其在卷煙中的應(yīng)用

張峰 謝全靈 余志強(qiáng) 操曉亮 張怡評(píng) 趙敏 洪專 郭洪輝 陳暉 洪祖燦

摘 要：為了開發(fā)天然海藻多糖煙用保潤劑，采用酶解法從珊瑚藻中提取多糖，首先考察5種酶對(duì)多糖提取量以及卷煙吸食品質(zhì)的影響;在優(yōu)選木聚糖酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過單因素試驗(yàn)考察酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、檸檬酸濃度等提取工藝條件對(duì)多糖提取量的影響;最后設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化珊瑚藻多糖的酶法提取工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)酶法提取工藝條件為：木聚糖酶添加量為0.8%（m/m），酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，檸檬酸濃度為0.062 5 g/L，珊瑚藻多糖提取量為（661.1±7.8） mg/g。感官分析評(píng)價(jià)結(jié)果表明，添加適量的珊瑚藻多糖具有顯著改善卷煙吸食品質(zhì)的效果。

關(guān)鍵詞：珊瑚藻;酶法提取;木聚糖酶;多糖;卷煙

Abstract： The aim of this study was to develop natural polysaccharide humectant for cigarette. The method of enzymatic hydrolysis was used to extract polysaccharides from coralline algae. Firstly， the effects of five kinds of enzymes on the extraction amount of polysaccharides and their corresponding sensory evaluation of smoking quality were studied. After selecting xylanase as the optimal enzyme， the single-factor experiments were carried out to systematically investigate the influences of enzymolysis temperature， enzymolysis time， enzyme content， and citric acid concentration on the extraction amount of polysaccharides. Finally， four factors and three levels orthogonal experiments were designed to optimize the enzymatic extraction process. The results showed that the optimum conditions of the enzymatic extraction process were as follows： xylanase dosage 0.8% （m/m）， enzymolysis temperature 50 ℃， enzymolysis time 3 h， citric acid concentration 0.062 5 g/L. Under the optimal enzymatic extraction process， the extraction amount of coralline polysaccharides reached （661.1±7.8） mg/g. The results of the sensory evaluation showed that the smoking qualities of cigarettes were significantly improved with the addition of an appropriate amount of coralline polysaccharides.

Keywords： coralline algae; enzymatic extraction; xylanase; polysaccharide; cigarette

煙草保潤性能對(duì)卷煙品質(zhì)有著重要影響，我國卷煙制品的保潤性能較差，存在煙氣干燥、辛辣、甜潤度不夠等諸多缺陷[1-2]。海藻多糖富含羥基等親水性基團(tuán)，具有很強(qiáng)的保水作用，是一類理想的天然煙用保潤劑。開發(fā)特色海藻多糖煙用保潤劑，對(duì)提高卷煙產(chǎn)品品質(zhì)、彰顯卷煙品牌風(fēng)格特征、提高中式卷煙產(chǎn)品競爭力等都具有重要的意義[3]。

目前，海藻多糖的提取方法有熱水提取法[4-5]、酸提法[6-7]、堿提法[8-9]、醇提法[5，10]、微波輔助提取法[11-12]、超聲波輔助提取法[13-14]、酶解法[15-16]等。傳統(tǒng)熱水提取法操作簡單，但耗時(shí)長、多糖得率低;酸、堿提取法可得到酸溶性、堿溶性不同種類多糖，但會(huì)降解部分多糖，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和活性影響較大;醇提法需使用大量有機(jī)溶劑，生產(chǎn)成本與生產(chǎn)要求較高;微波與超聲波輔助提取法受設(shè)備限制難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；I(yè)生產(chǎn);酶解法的提取條件比較溫和，具有多糖收率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)。陳森林等[17]采用檸檬酸提取法分別從海帶、紫菜、洋棲菜、麒麟菜等4種海藻中提取功能性多糖，發(fā)現(xiàn)海帶多糖具有明顯改善卷煙吸食品質(zhì)的效果。盧茳虹[18]也采用檸檬酸提取法制備獲得兩種提高煙氣細(xì)膩程度、減少刺激性、余味變干凈的海帶多糖樣品。楊君等[19]采用微波輔助提取工藝從裂片石莼中提取多糖，發(fā)現(xiàn)將裂片石莼多糖添加到煙絲中能較好地改善吸食的口感。然而，鮮見酶解法提取海藻多糖及其在卷煙中應(yīng)用的研究報(bào)道。

珊瑚藻（Coralline officinalis）含有多糖、水溶性膳食纖維、脂肪酸、核黃素等活性成分，其中多糖含量最為豐富[20-21]。為了開發(fā)珊瑚藻多糖的煙用保潤功能，本文采用酶解法提取珊瑚藻多糖，系統(tǒng)研究酶種類、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、檸檬酸濃度等因素對(duì)多糖提取量的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件，開發(fā)具有改善卷煙吸食品質(zhì)的珊瑚藻多糖酶法提取工藝，為充分挖掘與利用海藻多糖資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試劑：纖維素酶（試劑級(jí)，上海阿拉丁公司），木聚糖酶和α-淀粉酶（食品級(jí)，西寶生物科技股份有限公司），果膠酶和木瓜蛋白酶（食品級(jí)，南寧龐博生物工程有限公司），一水合檸檬酸、鹽酸、硫酸、甲基紅、乙醇、溴甲酚綠、葡萄糖和苯酚（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

儀器：高速離心機(jī)（HITACHI CR22N，日本）、紫外-可見分光光度計(jì)（HITACHI UH5300，日本）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-8，上海梅香儀器有限公司）、低溫恒溫反應(yīng)?。―FY-5L/20，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、渦旋振蕩器（QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、攪拌器（IKA RW 20，德國），實(shí)驗(yàn)室香精香料注射儀（Burghart CIJECTOR，德國）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶法提取工藝 稱取適量鹽漬珊瑚藻，水洗、晾干、粉碎之后，再精確加入純水、酶與檸檬酸，進(jìn)行酶解處理，得到珊瑚藻酶解液;珊瑚藻酶解液進(jìn)一步在90 ℃條件下加熱2 h，實(shí)現(xiàn)高溫滅酶;最后采用高速離心機(jī)，在10000 r/min條件下離心10 min取上清液，即為珊瑚藻酶解液。酶解工藝流程為：珊瑚藻→水洗→粉碎→酶解→滅酶→高速離心→多糖提取液。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)過程中，固定料液比為1∶20，以酶種類、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、檸檬酸濃度作為考察因素，以多糖提取量為考查目標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度（A）、木聚糖酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）和檸檬酸濃度（D）4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），以多糖提取量為指標(biāo)，篩選酶法提取多糖的最佳提取條件，正交試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

1.3 多糖測定

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照國標(biāo)GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.008 8x?0.099 9（R2=0.999 5）。

1.3.2 多糖提取量 本試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測定多糖提取量SC/T 3404—2012《巖藻多糖》。取適量多糖提取液，依次加入1 mL 5%苯酚水溶液和5 mL濃硫酸，加水補(bǔ)足至10 mL，渦旋混勻后，于30 ℃水浴反應(yīng)20 min，后在490 nm 測定吸光度，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得提取液中多糖濃度，并計(jì)算多糖提取量。

1.4 多糖在卷煙中的感官評(píng)價(jià)

選擇未加香加料的七匹狼（空白）卷煙為參試煙支。用香精注射儀將珊瑚藻多糖按0.05%的比例均勻添加入?yún)⒃嚲頍熤校圆惶砑由汉髟宥嗵堑膮⒃嚐熤閰⒈葻熤?，于?2±1）℃和RH（60±2）%環(huán)境中平衡48 h，組織10名專業(yè)評(píng)吸人員依據(jù)YC/T 497—2014《卷煙 中式卷煙風(fēng)格感官評(píng)價(jià)方法》對(duì)參比卷煙及添加珊瑚藻多糖的卷煙進(jìn)行對(duì)比評(píng)吸。

1.5 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)結(jié)果使用Excel作圖分析，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ分析。

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶種類的篩選 首先考察纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶等5種酶對(duì)珊瑚藻多糖提取量以及卷煙吸食品質(zhì)感官評(píng)價(jià)的影響。從圖1可知，當(dāng)料液比為1∶20、檸檬酸溶液濃度為0.125 g/L、酶添加量為0.2%（m/m，全文同）、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為3 h時(shí)，多糖提取量按從大到小排序?yàn)椋耗揪厶敲?gt;果膠酶>纖維素酶>α-淀粉酶>木瓜蛋白酶。

將各種酶法提取的珊瑚藻多糖用于卷煙保潤加香并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。從圖2可以看出，在口味風(fēng)格方面，添加珊瑚藻多糖對(duì)卷煙的酸味、苦味、涼味無影響，但均能明顯提升卷煙煙氣甜感，尤其是果膠酶與木聚糖酶的效果更加明顯。從圖3可以看出，在舒適感方面，珊瑚藻多糖能改善卷煙口腔刺激/舌部灼燒、口腔殘留/干燥感、喉部刺激，尤其是木聚糖酶的提升效果最明顯;但對(duì)卷煙收斂、喉部干燥、鼻腔刺激等指標(biāo)均無影響。從圖4可以看出，在香氣特性方面，珊瑚藻多糖能改善卷煙的細(xì)膩/柔和/圓潤，其中木聚糖酶的提升效果最明顯;對(duì)香氣、豐富性、煙氣濃度、勁頭等指標(biāo)均無影響;纖維素酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶處理具有明顯的雜氣。

綜上，采用木聚糖酶解工藝的珊瑚藻多糖提取量最高，添加適量的木聚糖酶解工藝提取的珊瑚藻多糖能明顯增加卷煙甜感，改善刺激、干燥感，圓潤煙氣。因此，優(yōu)選木聚糖酶為酶法提取工藝的酶種類。

2.1.2 酶解溫度對(duì)多糖提取量的影響 在優(yōu)選木聚糖酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察30、40、50、60、70 ℃等不同酶解溫度對(duì)多糖提取量的影響。

當(dāng)設(shè)定料液比為1∶20、檸檬酸溶液濃度為0.125 g/L、木聚糖酶添加量為0.2%、酶解時(shí)間為3 h時(shí)，由圖5可知，當(dāng)酶解溫度從30 ℃升高到50 ℃時(shí)，多糖提取量隨著酶解溫度提高而顯著增加，但當(dāng)酶解溫度從50 ℃進(jìn)一步提高到70 ℃時(shí)，多糖提取量隨著酶解溫度的上升而不斷降低。因此，優(yōu)選的酶解溫度為50 ℃，后續(xù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇40、50、60 ℃作為酶解溫度的3個(gè)水平。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響 在優(yōu)選木聚糖酶與酶解溫度（50 ℃）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察1、2、3、4、5 h等不同酶解時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響。

當(dāng)設(shè)定料液比為1∶20、檸檬酸溶液濃度為0.125 g/L、木聚糖酶添加量為0.2%、酶解溫度為50 ℃時(shí)，由圖6可知，當(dāng)酶解時(shí)間從1 h延長到3 h時(shí)，多糖提取量隨著酶解時(shí)間的延長而顯著增加，表明適當(dāng)延長酶解時(shí)間有助于提高木聚糖酶的酶解效率，從而提高多糖提取量。但是，當(dāng)酶解時(shí)間從3 h進(jìn)一步延長到5 h時(shí)，多糖提取量隨著酶解時(shí)間的延長反而降低。因此，優(yōu)選的酶解時(shí)間為3 h，后續(xù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇2、3、4 h作為酶解時(shí)間的3個(gè)水平。

2.1.4 酶添加量對(duì)多糖提取量的影響 在優(yōu)選木聚糖酶、酶解溫度（50 ℃）與酶解時(shí)間（3 h）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%等不同木聚糖酶添加量對(duì)多糖提取量的影響。

當(dāng)設(shè)定料液比為1∶20、檸檬酸溶液濃度為0.125 g/L、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為3 h時(shí)，由圖7可知，當(dāng)木聚糖酶添加量從0.05%增加到0.4%時(shí)，多糖提取量隨著酶添加量的增加而不斷增加，但是，當(dāng)木聚糖酶添加量從0.4%增加到0.8%時(shí)，多糖提取量沒有明顯變化。因此，優(yōu)選的木聚糖酶添加量為0.4 %，后續(xù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇0.2%、0.4%、0.8%作為木聚糖酶添加量的3個(gè)水平。

2.1.5 檸檬酸濃度對(duì)多糖提取量的影響 在優(yōu)選木聚糖酶、酶解溫度（50 ℃）、酶解時(shí)間（3 h）與木聚糖酶添加量為（0.4%）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 g/L等不同檸檬酸溶液濃度對(duì)多糖提取量的影響。

當(dāng)設(shè)定料液比為1∶20、木聚糖酶添加量為0.4%、酶解時(shí)間為3 h、酶解溫度為50 ℃時(shí)，由圖8可見，當(dāng)檸檬酸濃度從0.031 25增大到0.062 5 g/L時(shí)，多糖提取量隨著檸檬酸濃度增大而增加，表明增大檸檬酸濃度有助于提高多糖提取量。但是，當(dāng)檸檬酸濃度從0.062 5增大到0.5 g/L時(shí)，多糖提取量反而降低了。因此，優(yōu)選的檸檬酸濃度為0.062 5 g/L，后續(xù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇0.031 25、0.062 5、0.125 g/L作為檸檬酸濃度的3個(gè)水平。

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、木聚糖酶添加量、酶解時(shí)間和檸檬酸濃度4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），以多糖提取量為目的指標(biāo)，篩選酶法提取多糖的最佳工藝條件，結(jié)果如表2所示。

通過表2結(jié)果直觀分析可知，采用木聚糖酶法提取珊瑚藻多糖的工藝，多糖提取量的影響因素主次順序依次為木聚糖酶添加量>酶解溫度>酶解時(shí)間>檸檬酸濃度。根據(jù)極差分析得到珊瑚藻多糖酶法提取的最優(yōu)方案為A2B3C2D2，所對(duì)應(yīng)珊瑚藻多糖的最佳酶法提取工藝條件為：酶解溫度50 ℃、木聚糖酶添加量為0.8%、酶解時(shí)間3 h、檸檬酸濃度為0.062 5 g/L。

2.3 提取工藝驗(yàn)證

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)篩選的最佳酶法提取工藝穩(wěn)定性，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。稱取20 g珊瑚藻3份，在最佳酶法工藝條件下提取珊瑚藻多糖。由表3可知，3份珊瑚藻樣品的平均多糖提取量為661.1 mg/g，RSD為7.8%，表明珊瑚藻多糖的木聚糖酶法提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討 論

海藻多糖是存在于細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的一類天然生物大分子物質(zhì)。對(duì)細(xì)胞壁的破壁作用可以增加細(xì)胞的通透性，是提高海藻多糖提取率的有效手段。海藻細(xì)胞壁的主要成分包括纖維素、半纖維素和果膠等，而木聚糖又是半纖維素的主要組成成分。因此，本文全面考察了纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶等5種酶的破壁作用對(duì)珊瑚藻多糖提取量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，各種酶對(duì)多糖提取量的排序?yàn)椋耗揪厶敲?gt;果膠酶>纖維素酶>α-淀粉酶>木瓜蛋白酶，表明木聚糖酶對(duì)多糖提取效果最好，這是因?yàn)榧尤肽揪厶敲改軌蚯虚_木聚糖的主鏈，得到低聚木糖、木糖和阿拉伯糖等降解產(chǎn)物[22]，使得珊瑚藻的細(xì)胞壁發(fā)生分解，增加細(xì)胞的通透性，細(xì)胞內(nèi)多糖更容易流出，從而顯著提高珊瑚藻多糖的提取率。各種酶解法得到多糖提取液的卷煙感官綜合評(píng)價(jià)排序與多糖提取量排序完全一致。一方面，海藻多糖含有大量的親水基團(tuán)，可以與外部水分子緊密結(jié)合，同時(shí)多糖分子鏈的交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)加強(qiáng)吸濕和保濕作用，對(duì)卷煙起到很好的保潤保濕作用[23]。另一方面，多糖提取液作為煙用添加劑加入到卷煙煙絲上，在燃吸卷煙時(shí)可能會(huì)熱裂解產(chǎn)生特有的香氣成分，從而改善卷煙的吸食品質(zhì)[24-25]。

在優(yōu)選木聚糖酶提取珊瑚藻多糖的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，多糖提取量與酶解溫度、酶解時(shí)間、木聚糖酶添加量、檸檬酸濃度等酶解工藝條件密切相關(guān)。其中，多糖提取量隨著酶解溫度、酶解時(shí)間、檸檬酸濃度增加都呈先增大后降低趨勢。因?yàn)檫m當(dāng)提高酶解溫度或檸檬酸濃度，或者延長酶解時(shí)間都有助于增強(qiáng)木聚糖酶的酶活力，從而提高多糖提取量。但是，酶解溫度或檸檬酸濃度過高、或者酶解時(shí)間過長反而會(huì)抑制木聚糖酶的酶活力，導(dǎo)致多糖提取量減小。此外，多糖提取量隨著木聚糖酶添加量呈先增大后趨緩趨勢，表明適當(dāng)加大酶添加量可以提升多糖提取量，但是酶添加量過大，不僅對(duì)多糖提取量的提升作用有限，而且還會(huì)增加生產(chǎn)成本、不利于規(guī)模化生產(chǎn)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化木聚糖酶法提取珊瑚藻多糖的工藝條件，研究發(fā)現(xiàn)因素的主效應(yīng)關(guān)系為：木聚糖酶添加量>酶解溫度>酶解時(shí)間>檸檬酸濃度，表明木聚糖酶添加量和酶解溫度對(duì)珊瑚藻多糖的提取量影響較顯著?；谡辉囼?yàn)得到的最佳酶法提取工藝條件為：木聚糖酶添加量為0.8%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，檸檬酸濃度為0.062 5 g/L。通過3批次工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，木聚糖酶法提取珊瑚藻多糖的工藝穩(wěn)定可行。

4 結(jié) 論

本研究以珊瑚多藻多糖提取量和卷煙感官質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，開發(fā)了基于木聚糖酶法提取珊瑚藻多糖的優(yōu)化工藝條件。結(jié)果表明，當(dāng)木聚糖酶添加量為0.8%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h、檸檬酸濃度為0.062 5 g/L時(shí)，珊瑚藻中多糖提取量為（661.1±7.8） mg/g。在卷煙中添加0.05%珊瑚藻多糖，卷煙煙氣變得細(xì)柔、圓潤、甜感明顯，卷煙吸食品質(zhì)明顯改善。下一步將對(duì)珊瑚藻多糖的熱裂解產(chǎn)物進(jìn)行研究分析，以揭示珊瑚藻多糖對(duì)卷煙的保潤增香機(jī)理。

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