芝麻素對低氧條件下鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞β淀粉樣蛋白和β位淀粉樣前體蛋白裂解酶-1表達影響的實驗研究

朱俊艷，陳筱山，郭彥祥，王 磊

(1.西安市精神衛(wèi)生中心精神科,陜西 西安 710061；2.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西 西安 710003)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又被稱為老年性癡呆，是近年來較為普遍的一種神經(jīng)變性疾病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為：記憶力逐漸衰退，生活能力低下，同時還伴有其他認(rèn)知功能與精神障礙等情況。通常病情進行性加重，在2～3年內(nèi)喪失獨立生活能力，10～20年左右因并發(fā)癥而死亡，對患者的身體健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響[1]。AD的主要病理改變包括：突觸功能障礙、神經(jīng)細(xì)胞外老年斑(Senile plaques，SPs)、細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白變性、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neuron fiber tangles，NFTs)、神經(jīng)遞質(zhì)異常以及線粒體自噬功能障礙等[2]。β位淀粉樣前體蛋白裂解酶-1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE-1)可通過裂解生成β淀粉樣蛋白(Amyloid beta peptide，Aβ)，而Aβ是老年斑的主要成分，其在異常沉積是AD發(fā)病的始動環(huán)節(jié)[3-4]。AD的發(fā)病可通過腦缺血或卒中而引起，一般情況下在細(xì)胞和動物模型中，由于其缺血或低氧可導(dǎo)致Aβ與BACE-1水平異常升高[5]。芝麻素(Sesamin)是從芝麻中提取的一種木脂素類化合物，是芝麻的主要活性物質(zhì)。作為一種抗氧化劑，芝麻素具有保護肝臟、抗化學(xué)物質(zhì)所致腫瘤、抗氧化應(yīng)激和抗炎等作用[6]。芝麻素能減輕腦缺血和帕金森病模型所致的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥損傷[7-8]，但少見芝麻素對低氧條件下神經(jīng)元Aβ和BACE-1表達的報道。PC12細(xì)胞即大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株來自能移植的雄性大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，這些細(xì)胞能夠表達神經(jīng)生長因子[9]。本文探討了芝麻素對低氧條件下PC12細(xì)胞Aβ和BACE-1的表達的影響，以明確芝麻素緩解腦損傷的作用效果與機制，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 芝麻素由陜西省中醫(yī)藥研究院藥理實驗室提供。二甲基亞砜(DMSO)(博士德公司，武漢)。10%馬血清，5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，青、鏈霉素雙抗(GIBCO公司，美國)，Aβ1-42酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(USCN公司，武漢)，BACE-1抗體(Abcam公司，美國)，雙氣、三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scitific公司，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 PC12細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)實驗中心，購自中科院上海生物所)培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，隨機分為正常氧組與低氧組、低氧加芝麻素0.5、5和50 μmol/L濃度干預(yù)組。正常氧組在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。低氧組、低氧加芝麻素0.5、5和50 μmol/L濃度干預(yù)組轉(zhuǎn)移至37 ℃、1%O2、4%CO2、95%N2的三氣低氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，然后分別加入DMSO配制的芝麻素，使培養(yǎng)液芝麻素終濃度為0.5、5、50 μmol/L。

1.3 ELISA檢測Aβ1-42 收集所有組別的培養(yǎng)液，經(jīng)過離心后取其上清液，其余操作步驟嚴(yán)格按照ELISA說明書進行，首先配制出不同稀釋濃度Aβ1-42標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白對照孔，樣品孔，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品，各100 μl，覆膜加入100 μl的檢測溶液A，進行孵育洗滌后再添加100 μl的檢測溶液B，再次經(jīng)過孵育、洗滌，然后將酶標(biāo)板甩干，加入90 μl的底物溶液，將其覆膜后進行避光顯色處理，測定OD450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算Aβ1-42分泌值。

1.4 Western blot檢測BACE-1蛋白 收集獲得的PC12細(xì)胞，采用全蛋白提取試劑盒提取各組蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg，進行SPS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，利用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入BACE-1一抗(稀釋比1∶5000)，4 ℃條件下過夜：二抗37 ℃培養(yǎng)2 h；TBST洗滌，ECL發(fā)光，應(yīng)用Bio-Rad凝膠圖像成像系統(tǒng)采集圖像，Quality One軟件進行掃描分析。GAPDH作為內(nèi)對照。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 各組PC12細(xì)胞Aβ1-42表達水平比較 低氧組的Aβ1-42表達水平顯著高于正常氧組(P<0.05)；在不同濃度芝麻素(0.5、5和50 μmol/L)干預(yù)后，Aβ1-42表達水平顯著下降(均P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性(均P<0.05)。見圖1。

2.2 各組PC12細(xì)胞BACE-1蛋白表示水平對比 低氧組的BACE-1蛋白相對表達水平顯著高于正常氧組(P<0.05)；在不同濃度芝麻素(0.5、5和50 μmol/L)干預(yù)后，BACE-1蛋白相對表達水平顯著下降(均P<0.05)，且呈現(xiàn)濃度依賴性(均P<0.05)。見圖2。

3 討 論

AD是一個與增齡有關(guān)的、具有多病理生理特征的復(fù)雜疾病，包括以進行性腦神經(jīng)元丟失和萎縮為特征的神經(jīng)變性、腦細(xì)胞外β淀粉樣蛋白聚集形成淀粉樣斑塊、腦神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化和聚集形成“神經(jīng)纖維糾纏結(jié)”、腦葡萄糖代謝下降、膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎癥等。當(dāng)前，AD已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅老年健康及生活質(zhì)量的神經(jīng)變性疾病，其也對患者自身、家庭以及社會產(chǎn)生了不可估量的傷害[10-11]。在65歲以上人群中，西方約有5%的人患有此病，85歲以上老年人患病率高達47%～50%，為歐美國家老年期癡呆的主要原因；日本的患病率低于西方，為4%；我國60歲以上人群AD的患病率為3%～5%。但目前對于AD發(fā)病的具體原因還不完全明確，除了只有1%的家族性AD可能會與遺傳相關(guān)外，目前仍舊是世界性難題。約99%的AD患者為晚發(fā)、散發(fā)型癡呆，其影響因素包括糖尿病、高血脂、外傷、缺血等[12-14]。

AD與血管性癡呆在缺血性腦血管病、腦低氧環(huán)境下以及腦卒中老年患者等影響下的發(fā)病率會明顯升高[15]。在腦卒中過程中，低氧損害主要是通過腦低灌注、呼吸暫停導(dǎo)致的，而低氧與Aβ聚集、Tau蛋白磷酸化、血腦屏障損傷、神經(jīng)元變性等有關(guān)[16]。Aβ是細(xì)胞膜上的淀粉樣前體蛋白的生成(Amyloid peptide precussor，APP)，在AD發(fā)病中起到核心作用，該結(jié)果已被人們廣泛認(rèn)可，神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成、氧化和脂質(zhì)過氧化、谷氨酸能興奮性毒性反應(yīng)、炎癥和凋亡細(xì)胞死亡級聯(lián)反應(yīng)的激活，都被視為繼發(fā)于Aβ生成和聚積的后果。Aβ肽聚集可形成神經(jīng)毒性的原纖維，進而組成AD的病理特征之一，如老年斑等[17]。該物質(zhì)主要由蛋白水解酶進行分泌，共分為兩條代謝途徑(α和β)。其中β代謝途徑又稱為淀粉樣代謝途徑，β分泌酶(β-secretase)可導(dǎo)致APP產(chǎn)生毒性作用，小分子的Aβ[18]。BACE-1主要是通過β分泌酶產(chǎn)生，也是Aβ生成過程中的一種限速酶。在AD時，BACE1活性增高，產(chǎn)生過多的Aβ，促進老年斑、Tau蛋白磷酸化等病理改變[19]。

有研究發(fā)現(xiàn)低氧通過β-分泌酶和γ-分泌酶的活性增加Aβ的生成，特別是SH-SY5Y細(xì)胞BACE-1的mRNA和蛋白水平增高[20]。還有研究顯示在短暫性腦缺血、低氧條件下，實驗大鼠的BACE1較對照鼠增加了67%[21]。本研究發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在低氧干預(yù)培養(yǎng)24 h，Aβ水平顯著增高，裂解Aβ的BACE-1蛋白表達也相應(yīng)增高，表明在低氧損傷時，Aβ水平、BACE-1表達水平上升可導(dǎo)致Aβ沉積明顯提高，這與AD的進展及發(fā)病具有一定的相關(guān)性。

芝麻素作為芝麻的主要活性成分，是一種天然的木脂素類化合物，廣泛存在與芝麻籽和芝麻油中，隨著人們對芝麻素藥理活性研究的不斷深入，其藥物作用之間被人們重視。研究發(fā)現(xiàn)，芝麻素不但具有相當(dāng)高的營養(yǎng)價值，并且具有抗氧化、抗菌、保肝、調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定血壓以及抑制腫瘤等多種生物學(xué)活性[22]。近些年，已有一些科研工作者對芝麻素在保護神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷進行了實驗研究。有學(xué)者研究顯示芝麻素可發(fā)揮抗ROS的作用，保護低氧損傷的神經(jīng)元和PC12細(xì)胞[23]。本實驗設(shè)置0.5、5和50 μmol/L濃度芝麻素干預(yù)低氧條件培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)芝麻素降低低氧條件下升高的Aβ1-42、BACE-1蛋白表達，且存在劑量依賴性。還有學(xué)者研究表明芝麻素改善可逆大腦中動脈栓塞動物模型鼠的行為損傷，進行體內(nèi)和體外實驗，進一步驗證了芝麻素具有抗氧化應(yīng)激和抗炎癥的作用，保護缺血腦組織，降低低氧時PC12和BV-2細(xì)胞產(chǎn)生的ROS、細(xì)胞激酶和PGE2；同時也可減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性物質(zhì)對PC12細(xì)胞的損傷，增加PC12細(xì)胞活性和乙酰膽堿釋放[24]。芝麻素通過抑制患者體內(nèi)的信號通路，降低炎癥因子的表達，增加谷胱甘肽和過氧化氫酶的活性，通過顯著的抗氧化、抗炎癥等作用減輕AD所造成的大腦損傷[25-26]。本研究也存在一定的不足，沒有進行體內(nèi)研究分析，且沒有對多種細(xì)胞進行分析，因此對于本研究結(jié)論仍需要大量的實驗進行驗證，將在后續(xù)研究中繼續(xù)進行探究。

總之，在低氧條件下，PC12細(xì)胞Aβ1-42、BACE-1蛋白表達升高，芝麻素降低低氧條件下升高的Aβ1-42，BACE-1表達，本文研究結(jié)果具有一定的科學(xué)性，為阿爾茲海默病的臨床治療提供一定的參考。