高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中丙烯酰胺的殘留量

文/劉開 孔祥虹

丙烯酰胺是一種白色小分子結(jié)晶狀固體，分子量71.08，熔點(diǎn)85℃，室溫下穩(wěn)定，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等溶劑，是不飽和酰胺類小分子物質(zhì)。食品中的丙烯酰胺是由天門冬酰胺和還原糖在高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)生成，因此含有上述2種物質(zhì)的高溫加工食品易被丙烯酰胺污染。人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸丙烯酰胺。大量的研究表明丙烯酰胺對(duì)人和動(dòng)物不僅具有神經(jīng)毒性，還具有一定的致癌性、致突變性和生殖毒性。

目前，食品中丙烯酰胺的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）等。GC-MS法需要衍生化處理， 操作過程繁雜，樣品處理操作周期較長(zhǎng)，不適用于大批量樣品的處理。HPLC法受雜質(zhì)干擾大，紫外檢測(cè)靈敏度低。HPLC-MS/MS法綜合了高效液相色譜的色譜分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度，使其具有較低檢測(cè)限，并且操作簡(jiǎn)單無(wú)需衍生化，適合大批量樣品的檢測(cè)。因而被更多研究人員所采用。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)丙烯酰胺在薯片、餅干、鍋巴等食品中的含量，考察提取條件以及凈化方式對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，并優(yōu)化液相色譜、質(zhì)譜條件，對(duì)所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在建立一種高效的丙烯酰胺含量檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)部分

主要儀器與與試劑

儀器：UltiMate 3000超高效液相色譜儀（配TSQ ENDURA質(zhì)譜檢測(cè)器），美國(guó)賽默飛世爾公司；Atiantis T3色譜柱，美國(guó)Waters公 司；Vortex3渦 旋 混 合器，德國(guó)IKA公司；T18均質(zhì)器，德國(guó)IKA公司；Centrifuge 5810R離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Turbo Vap LV氮吹濃縮儀，美國(guó)Caliper公司；XP205電子分析天平，德國(guó)梅特勒-托利多公司；Milli-Q超純水器（Advantage-10/Elix），美國(guó)Millipore公司。

試劑：丙烯酰胺（99.3%），德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；13C3-丙烯酰胺1 mg/mL，（甲醇溶液，1 mL），上海安譜；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純），美國(guó)Fisher公司；Oasis PRiME HLB（60 mg，3 mL）美國(guó)Waters公司；其他試劑均為分析純。

材料：薯片、面包、鍋巴、餅干等淀粉類食品(均購(gòu)于西安市場(chǎng))。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.00 mg，用甲醇定容至10 mL，使丙烯酰胺濃度為1.0 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定量稀釋，分別配制成濃度為0.1、1、10 μg/mL的丙 烯酰 胺使用液。準(zhǔn)確吸取13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mL，用甲醇定容至10 mL，使13C3-丙烯酰胺濃度為100 μg/mL。上述標(biāo)準(zhǔn)溶液均于-20℃冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（0.1%甲酸水配制）：取定量合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液配制成13C3-丙烯酰胺濃度為1μg/mL，丙烯酰胺濃度分別為0、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）已經(jīng)粉碎均勻的樣品，加入0.1 mL（1 μg/mL）內(nèi)標(biāo)溶液，加入20 mL甲醇充分渦旋混合，振搖30 min后，于4000 r/min離心10 min，取上清液待凈化。取10 mL提取液，直接上載至PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液，氮吹濃縮至近干，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，用0.22 μm的濾膜過濾。濾液待UPLC-MS/MS測(cè)定。

液相色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters Atiantis T3（2.1 mm×100 mm，1.7μm）。流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水（體積比5:95），等度洗脫；流速0.2 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式 ESI（+）掃描方式；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM)檢測(cè)方式；噴霧電壓3.5 kV；氣化溫度350℃；鞘氣壓力（N2） 0.525 L/mL（35 Arb)；輔助氣壓力(N2）3.0 L/mL（10 Arb）；離子傳輸毛細(xì)管溫度320℃；去簇電壓2.0 V；碰撞氣體（Ar）199.9 Mpa（1.5 mTorr），定性定量離子對(duì)及碰撞能等條件見表1。

結(jié)果與討論

樣品提取和凈化

丙烯酰胺既易溶于水，又溶于甲醇?？紤]到食品樣品中淀粉和纖維容易在水中溶脹，體系黏度變大，會(huì)導(dǎo)致樣品處理變得復(fù)雜與費(fèi)時(shí)，甲醇提取能盡可能少地提取多糖甚至是淀粉，又不會(huì)引起上述問題。同時(shí)對(duì)比了兩種提取溶液，回收率均能滿足要求，不會(huì)造成樣品提取不充分，所以最終選擇用甲醇作為提取溶液。

固相萃取柱的選擇：GB 5009.204中采用 HLB和Bond Elut-Accucat 兩種固相萃取柱凈化，步驟繁瑣，操作復(fù)雜，回收率不穩(wěn)定。本研究選用PRiME HLB固相萃取柱，與傳統(tǒng)固相萃取柱相比，PRiMEHLB具有很好的去除非極性物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂的效果，無(wú)需活化， 淋洗及洗脫等步驟，直接上樣并接收樣品溶液即可， 操作簡(jiǎn)單，回收率大于80%，不僅可以滿足檢測(cè)需求而且極大的提高檢測(cè)效率。

基質(zhì)效應(yīng)的影響

化學(xué)分析中，基質(zhì)效應(yīng)是指樣品基質(zhì)中的某些共提取物組分對(duì)待測(cè)物目標(biāo)物質(zhì)的影響，基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。薯片、面包、鍋巴、餅干等基質(zhì)富含油脂蛋白質(zhì)，為了消除測(cè)定液中存在的基質(zhì)效應(yīng)，本方法首先在前處理過程中采取除油除蛋白處理，同時(shí)采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，極大程度消除測(cè)定中的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)又明顯提高了定量的準(zhǔn)確性。

質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式分別將濃度為1 μg/mL的丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)用蠕動(dòng)泵注入離子源中，在正離子檢測(cè)方式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描確定它的準(zhǔn)分子離子峰，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、離子傳輸管溫度；再分別以其準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化碰撞室碰撞電壓，選擇豐度強(qiáng)、干擾小的離子作為定性或定量離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

色譜柱的選擇

流動(dòng)相配比及色譜柱選擇會(huì)影響丙烯酰胺的分離及出峰時(shí)間，因此本實(shí)驗(yàn)考察了Hypersil GOLD aQ（2.0 mm×100 mm，1.9 μm）和Waters Atiantis T3兩根色譜柱在乙腈/水和甲醇/水2種流動(dòng)相對(duì)丙烯酰胺分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，丙烯酰胺在Atiantis T3色譜柱上的保留行為更好。由于丙烯酰胺是一種強(qiáng)極性的小分子物質(zhì)，Atiantis T3色譜柱是一種基于超純硅膠基質(zhì)的反相C18色譜柱，其T3鍵合技術(shù)能增強(qiáng)極性化合物保留，適合強(qiáng)極性物質(zhì)分離，因此最終選擇Atiantis T3色譜柱作為實(shí)驗(yàn)用柱。同時(shí)比較了甲醇/水、甲醇/0.1%甲酸水、乙腈/水、乙腈/0.1%甲酸水等流動(dòng)相配比對(duì)目標(biāo)化合物離子化程度的影響。結(jié)果表明，采用甲醇與0.1%甲酸水體積比為5:95等度洗脫時(shí)，丙烯酰胺有較好的出峰，且峰形規(guī)則、干擾少，保留時(shí)間為2.10 min左右。在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，可以將1.7 min出峰的干擾峰分開。如圖1。

表1丙烯酰胺質(zhì)譜參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

按濃度由小到大的順序，將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀中，按上述儀器條件進(jìn)行測(cè)定，得到丙烯酰胺及其內(nèi)標(biāo)峰面積。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0～500.0 ng/mL，回歸方程為y=1.0365x-0.0152（y為峰面積，Counts；x為濃度，ng/mL）；線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。同時(shí)用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信噪比均大于3的條件設(shè)定檢出限，得到方法的檢出限為5 μg/kg，根據(jù)信噪比大于10的條件設(shè)定定量限，得到方法的定量限為10 μg/kg。

表2 4種樣品在不同加標(biāo)水平下的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=6)

回收率和精密度

分別選取薯片、面包、鍋巴、餅干4種食品，稱取每種樣品6份，每份2.00 g，共3組，分別加入添加 水 平 為10 μg/kg、50 μg/kg、200 μg/kg的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，再均添加50 μg/kg內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，按上述樣品處理?xiàng)l件進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見表2。從表2中可看出，不同濃度平均加標(biāo)回收率為82.2%～104.8%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.67%～9.53%（n=6），滿足試驗(yàn)要求。

實(shí)際樣品分析

圖1 含有丙烯酰胺的鍋巴樣品色譜圖

利用本方法對(duì)市場(chǎng)銷售的薯片、面包、鍋巴、餅干4種產(chǎn)品各20份，每份3進(jìn)行檢測(cè)，其中薯片類樣品中丙烯酰胺的含量為40～1595 μg/kg，油炸型薯片中丙烯酰胺含量普遍高于非油炸型薯片；面包類樣品中丙烯酰胺的含量為0～295 μg/kg；鍋巴類樣品中丙烯酰胺的含量為0～595 μg/kg；餅干類樣品中丙烯酰胺的含量為0～695μg/kg。丙烯酰胺的形成與食品的加工方式和加工條件密切相關(guān)，有必要合理改變加工方式、嚴(yán)格控制加工條件，減少丙烯酰胺的產(chǎn)生。

結(jié)論

本文建立了食品中丙烯酰胺殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法樣品加標(biāo)回收率方法回收率為82.2%～104.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.67%～9.53%（n=6）。該 方 法前處理簡(jiǎn)單，適合于大量樣品的快速篩查，方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)要求，適用于薯片、面包、鍋巴、餅干等食品中丙烯酰胺殘留的監(jiān)控檢測(cè)。 ■