基于HPLC 圖譜探究苗藥八爪金龍3 個基原不同藥用部位的差異*

王長彬 ，周永強 ，俸婷婷 ，雷傳文 ，周 英

（貴州中醫(yī)藥大學 a.藥學院；b.藥食兩用資源應用與開發(fā)研究中心；c.中藥材開發(fā)技術研究中心，貴州 貴陽550025）

八爪金龍為紫金?？谱辖鹋僦参铮咔鍩峤舛?，活血止痛、祛風除濕的功能，用于咽喉腫痛、扁桃體炎、跌打損傷、風濕痹痛，為貴州省少數(shù)民族用藥，也被苗族奉為喉科良藥。八爪金龍主要有3 個基原，為朱砂根Ardisia crenata Sims、百兩金[Ardisia crispa（Thunb.）A.DC.]和紅涼傘[Ardisia crenata Sims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen]的干燥根及根莖[1,2]。目前，苗藥八爪金龍的發(fā)展存在著較多問題：（1）朱砂根收載于《中國藥典》（2020 版）中，并以巖白菜素含量做為朱砂根質量評價的指標性成分[3]，其質量標準可以得到良好的把控。而百兩金和紅涼傘卻并未收載于《中國藥典》中，目前也只載于貴州省地方標準中。所以對百兩金和紅涼傘的研究報道相對較少，嚴重影響其臨床用藥和生產的安全有效性。（2）《中國藥典》明確規(guī)定朱砂根以根入藥[3]，而《中藥大辭典》中卻明確朱砂根的根和葉均可入藥，且把朱砂根的葉單獨拿出來作為一類中藥[4]。目前市場銷售的朱砂根在使用方面大多數(shù)以根莖混合使用，少有的只以根入藥。那么朱砂根的莖葉與根的化學成分差異大嗎？是否可以入藥？（3）苗藥八爪金龍基原復雜，藥材市場在八爪金龍的售賣使用過程中存在著朱砂根、百兩金、紅涼傘這3 個不同基原混合入藥以及藥用部位混亂等情況。如何最大化利用八爪金龍藥用資源等問題都亟待研究。因此，為了探討這些問題，本實驗建立了八爪金龍這3 種基原的不同藥用部位的HPLC 圖譜，并對朱砂根、紅涼傘和百兩金不同藥用部位的指標性成分巖白菜素進行了含量測定，通過質量控制方面橫向比較八爪金龍這3個基原的差異性，為苗藥八爪金龍藥材資源的進一步開發(fā)和利用奠定科學基礎。

1 材料與設備

1.1 儀器

Agilent-1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DAD 二極管陣列檢測器（安捷倫科技有限公司）；SB-600DTY 超聲波多頻清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FA2104N 電子天平（上海菁海儀器有限公司）；XS205 電子天平（瑞士梅特勒公司）；FW177 中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料

YMC-PackODS-A（250 mm×4. 6 mm，5μm）的色譜柱（日本YMC 公司）。

UN1648 乙腈（GR 賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲醇（GR 美國BCR 公司）；H3PO4（GR 天津市科密歐化學試劑有限公司）；巖白菜素（CR 成都瑞芬思生物科技有限公司）；屈臣氏飲用水（AR 廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 藥材

朱砂根和百兩金采自貴州省貴陽市南明區(qū)情人谷，紅涼傘采自貴州省凱里市雷公山，藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為朱砂根（Ardisia crenata Sims）、紅涼傘[Ardisia crenata Sims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen]、百兩金[Ardisia crispa（Thunb.）A.DC]的全株。

2 方法與結果

2.1 八爪金龍不同基原藥材相似度考察

2.1.1 供試品和對照品溶液的制備 將不同基原的八爪金龍全草陰干，根莖葉分離，打粉，取八爪金龍藥材的不用藥用部位粉末各2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲（頻率 40kHz）提取 40min，放冷，補重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.22μm 針式過濾器濾過，作為供試品待用。

2.1.2 HPLC-DAD 色譜條件 型號為YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm, 5μm）的色譜柱；以乙腈（A）－0.1% H3PO4（B）作為流動相；柱溫為25℃；0.5mL·min-1的流速; 進樣量的大小為 5μL；DAD 檢測波長為 214nm；洗脫梯度為：0～15min，5%～10%A；15 ～35min，10%～10%A；35 ～65min，10%～24%A；65～80min，24%～40%A；80～85min，40%～50%A；85～90min，50%～5%A；90～95min，5%～5%A。

2.1.3 八爪金龍疊加圖譜的建立 按2.1.2 項下色譜條件建立HPLC 色譜，將色譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A 版）中，建立八爪金龍不同基原的根、莖、葉疊加圖譜，按照中位數(shù)生成對照圖譜并設置時間窗為0.1，采用多點校正后進行自動匹配后生成疊加圖譜，標定出其共有峰。色譜疊加圖見圖1，相似度匹配見表1。

圖1 八爪金龍的根（A）、莖（B）、葉（C）HPLC 相似度疊加圖Fig.1 Similarity superposition diagram of HPLC of root（A）,stem（B）and leaf（C）of Ardisia crispa（Thunb.）A.DC

表1 八爪金龍不同基元藥材根部成分相似度匹配Tab.1 Similarity matching of root components of different base of Ardisia crispa（Thunb.）A.DC

通過對朱砂根和紅涼傘的根、莖部進行HPLC圖譜比較可以發(fā)現(xiàn)，朱砂根和紅涼傘的相似度可以達到0.9 以上，二者的根莖極為相似,而在葉部相似度只有0.348，說明朱砂根與紅涼傘的葉中化學成分存在著較大差異，這也為民間通過葉片顏色區(qū)分二者提供了理論依據(jù)。百兩金不同藥用部位與二者的相似度都僅有0.5 左右，說明百兩金與朱砂根和紅涼傘在化學成分上存在著較大的差異。

2.2 八爪金龍不同藥用部位巖白菜素含量測定

2.2.1 供試品和對照品溶液的制備 將不同基原的八爪金龍全草陰干，根莖葉分離，打粉，過20 目篩，取八爪金龍藥材的不用藥用部位粉末各0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定重量，超聲（頻率 40kHz）提取 40min，放冷，補重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.22μm 有機針式濾膜濾過，作為供試品待用。精密稱量巖白菜素對照品10.00mg 加入100%甲醇溶液定容至10mL 棕色容量瓶,搖勻,配成 1mg·mL-1的對照品儲備液。

2.2.2 HPLC-DAD 色譜條件 型號為YMC-Pack－ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）的色譜柱；以甲醇-水（25∶75）作為流動相；柱溫為 30℃；1.0mL·min-1的流速; 進樣量的大小為5μL；DAD 檢測波長為214nm。在本試驗色譜條件下，八爪金龍藥材中巖白菜素的分離度R>1.5,符合要求，建立了八爪金龍不同基原的3D 疊加圖譜，結果見圖2。

圖2 巖白菜素對照品（D）及朱砂根（E）紅涼傘（F）百兩金（G）不同藥用部位HPLC 的3D 疊加圖Fig.2 3D overlay map of HPLC of Bergenin reference substance（D）and Ardisia crenata Sims（E）Ardisia crenata Sims var.bicolor（Walk）C.Y.Wu et C.Chen（F）Ardisia crispa（Thunb.）A.DC.（G）

2.2.3 線性關系的考察 精密稱定巖白菜素對照品10.00mg 加入100%甲醇溶液定容至10mL 棕色容量瓶,搖勻,配成母液 1mg·mL-1的溶液,再倍數(shù)稀釋成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg·mL-1濃度備用。精密吸取上述對照品溶液各5μL 按照2.2.2 的HPLC-DAD 色譜條件注入液相色譜議,測定峰面積,以被測物質的濃度（mg·mL-1）為橫坐標（X）,以峰面積為縱坐標（Y）,繪制標準曲線,其回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍，結果回歸方程為Y=21396x+124.31（R2=0.9992）且質量濃度在 1.0～0.015625mg·mL-1范圍內線性關系良好。

圖3 巖白菜素標準曲線圖Fig.3 Standard curve of Bergenin

2.2.4 精密度試驗 取2.2.1 巖白菜素1mg·mL-1儲備液，按照2.2.2 項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次，結果巖白菜素的保留時間和峰面積的RSD 值分別為0.56%和0.13%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 精密稱取不同藥用部位的供試品6 份，制備供試品溶液，按2.2.2 項下色譜條件測定，結果巖白菜素色譜峰的相對保留時間和峰面積的RSD 均小于3% ，表明該方法的重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液適量，分別在 0、2、4、6、8、10、12 和 24h ，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，計算巖白菜素色譜峰相對保留時間和峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收試驗 取已知各成分含量的八爪金龍藥材粉末，精密稱取6 份樣品，每份藥材約0.1g，分別精密加入各對照品適量。按“2.2.1”項下方法制備成供試品溶液，在2.2.2 項色譜條件下進樣分析，記錄峰面積，計算相應含量，并求回收率。巖白菜素的平均加樣回收率在 99.73%～103.33%，RSD 在0.75%～2.67%。表明方法準確性良好。

2.2.8 樣品含量測定 分別取朱砂根、紅涼傘以及百兩金不同部位（根、莖、葉）粉末，按 2.2.1 項下方法制備供試品溶液，在2.2.2 項色譜條件下進樣分析，計算巖白菜素的含量，結果見表2。

表2 八爪金龍不同藥用部位巖白菜素含量Tab.2 Contents of Bergenin in different parts of Ardisia crispa（Thunb.）A.DC.

數(shù)據(jù)結果顯示，朱砂根葉中的巖白菜素含量明顯大于根和莖中巖白菜素含量，莖中巖白菜素含量略大于根中巖白菜素含量，紅涼傘葉中的巖白菜素含量特別低，與朱砂根葉中巖白菜素含量形成鮮明對比。朱砂根和紅涼傘在根和莖中巖白菜素含量十分的接近，朱砂根根中的巖白菜素與紅涼傘根中含量接近而莖中含量要高出少許。百兩金中巖白菜素的含量要比朱砂根和紅涼傘中都少的多，相對于根和莖中百兩金葉中巖白菜素含量會更多一點。

3 討論

紅涼傘是朱砂根的變種，二者在植株外形無太大差異，僅紅涼傘葉背、花梗、花萼和花瓣均帶紫紅色，因此《中國植物志》記載，二者作為單獨的兩個種是不恰當?shù)?，也提出了給予歸并[5]。趙愛蓮通過葉綠體DNAtrnL-trnF 片段測序[6]和陳新連通過ITS2 序列[7]也無法將二者進行鑒別。湯昊也通過聚類分析發(fā)現(xiàn)朱砂根和紅涼傘在第一階就被聚成一類，表明兩者親緣關系極近，很難鑒定區(qū)別[8]。所以筆者通過HPLC 法將二者與同基原的百兩金進行了化學成分比較。

通過對朱砂根、紅涼傘和百兩金HPLC 圖譜相似度考察發(fā)現(xiàn)朱砂根和紅涼傘化學成分在根、莖部十分的相似，而葉中的化學成分卻存在著較大的差異，這為民間僅通過葉片顏色區(qū)分二者提供了理論依據(jù)。而百兩金藥材無論在根莖還是葉中與朱砂根和紅涼傘都存在著較大的差異。對八爪金龍藥材不同藥用部位進行巖白菜素的含量測定發(fā)現(xiàn)：朱砂根葉中的巖白菜素含量明顯大于根和莖中巖白菜素含量，莖中巖白菜素含量略大于根中巖白菜素含量，紅涼傘葉中的巖白菜素含量特別低，與朱砂根葉中巖白菜素含量形成鮮明對比。朱砂根和紅涼傘在根和莖中巖白菜素含量十分的接近，朱砂根根中的巖白菜素與紅涼傘根中含量接近而莖中含量要高出少許。百兩金中巖白菜素的含量要比朱砂根和紅涼傘中都少的多，相對于根和莖中百兩金葉中巖白菜素含量會更多一點。

4 結論

本實驗通過HPLC 色譜法將朱砂根、紅涼傘和百兩金進行鑒別，發(fā)現(xiàn)朱砂根與紅涼傘在根和莖的色譜行為是十分相近的，無法辨別出二者。但在葉化學成分的含量上面存在著一定的差異，可以做為區(qū)分二者的一個突破口。而百兩金卻與朱砂根和紅涼傘的化學成分和色譜行為上存在較大差異，所以不建議將三者做為八爪金龍進行混合使用。通過對巖白菜素的含量測定發(fā)現(xiàn)：朱砂根葉中巖白菜素的含量特別高，朱砂根和紅涼傘的莖中的巖白菜素含量也不比根中少，所以建議將朱砂根的莖和葉還有紅涼傘的莖做為藥用部位充分的使用起來，這樣可以使八爪金龍的藥用資源得到充分的開發(fā)利用。